牛結節(jié)性皮膚病及其檢測方法研究進展

（新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830000）

牛結節(jié)性皮膚?。╨umpy skin disease，LSD）是由牛結節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的一種病毒性傳染病，又稱為牛疙瘩皮膚病、牛結節(jié)性皮炎和牛結節(jié)疹。LSD屬于急性和亞急性傳染病，臨床上主要癥狀為體溫升高、消瘦、淋巴結腫大、皮膚（黏膜、器官）表面廣泛性結節(jié)及皮膚水腫等。此外，該病毒還可致原發(fā)性和繼發(fā)性肺炎，母牛流產以及公牛暫時或永久不育，對養(yǎng)牛業(yè)危害較大，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須通報的動物疫病[1-2]。

LSD 于1929 年首次在贊比亞被報道，15 年后在博茨瓦納和南非地區(qū)出現。20 世紀70 年代，LSD 向北傳播到科尼亞和蘇丹，向西傳播到尼日利亞，隨后相繼傳播到毛里塔尼亞、馬里、加納和利比里亞等國家。2005 年后，巴林、科威特、阿曼、也門、以色列、黎巴嫩、伊朗、土耳其和約旦河西岸也相繼出現疫情。2015 年以來，LSDV 在歐洲東南部迅速蔓延，包括保加利亞、希臘、科索沃、前南斯拉夫馬其頓共和國、塞爾維亞和阿爾巴尼亞以及俄羅斯。2019 年8 月，我國首次在新疆地區(qū)確診此病。為加強對其監(jiān)測與防控，本文對該病及其檢測方法行了綜述。

1 病原學特征

LSDV 屬于痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV），其原型Neethling 毒株最初分離自南非[3]。LSDV 病毒粒子大小約為260～320 nm，有或者無包膜，形態(tài)相似，呈磚塊狀或橢圓形（副痘病毒除外）[4]。該病毒主要通過昆蟲（如蚊、蠅和虱）媒介機械傳播，其次通過自然接觸傳播，另外動物唾液污染的飼料和水也可能傳播。所有的痘病毒在細胞培養(yǎng)基上生長緩慢，可能需要進行多次傳代，其可在牛和羊等多種動物細胞上繁殖，從而引起易于識別的細胞病變效應（cytopathic effects，CPE）[5]。此外，該病毒還可以在雞胚絨毛膜尿囊膜內繁殖，引起肉眼可見的痘樣病變[6]。同時，在被LSDV 感染的家兔中可發(fā)現大面積的皮膚損傷。通過對LSDV 感染的單層細胞進行蘇木精-伊紅染色并借助顯微鏡，可觀察到LSDV 復制發(fā)生在宿主細胞內涵體的胞漿內。

LSDV 屬于雙鏈DNA 病毒，基因組大小約為151 kbp，由一個具有相同2.4 kbp 反向末端重復序列的中央編碼區(qū)域和156 個假定基因組成，編碼宿主范圍、毒力和免疫逃逸的基因位于基因的末端[7]。利用現場樣本和疫苗毒株的限制性核酸內切酶對其DNA 進行分析，表明其與羊痘病毒毒株之間的同源性可達80%，且與山羊痘病毒（GTPV）和綿羊痘病毒（SPPV）的基因組核苷酸具有96%的同源性，因此簡單的血清學方法很難將其區(qū)分[8]。

LSDV 對熱敏感，55 ℃條件下2 h 或者65 ℃條件下30 min 便可滅活；耐凍融，在-90 ℃可保存10 年，在受感染的組織液4 ℃可保存6 個月。病毒粒子對酸或堿敏感，可在pH 6.6～8.6 的環(huán)境中長期存活；對20%的乙醚、氯仿、1%福爾馬林和一些洗滌（如十二烷基磺酸鈉劑）敏感。對次氯酸鈉（2%～3%）、苯酚（2%，15 min）、碘化合物（1:33稀釋液）和季銨化合物（0.5%）等也敏感。此外，該病毒粒子對陽光敏感，在黑暗條件下可保持活力長達幾個月[9]。

2 宿主范圍

牛和水牛都是LSDV 的自然宿主，其感染率分別為30.8%和1.6%[10-11]。山羊和綿羊被人工接種感染后通常在接種部位局部出現反應，而其他的小型反芻動物未被報道感染LSDV。皮薄高產的奶牛品種對LSDV 高度易感，對于荷斯坦奶牛，高溫環(huán)境和為了牛奶高產的農業(yè)實踐操作可能是導致其LSD 嚴重的原因[12]。然而印度牛和印度牛雜交等品種會對LSDV 有一些自然的抵抗力[13]。截至目前，遺傳因素對此病的影響程度還未知。

一般而言，LSDV 具有高度的宿主特異性，主要感染牛和水牛。較少的數據表明野生反芻動物也易于感染LSD，如黑斑羚和長頸鹿接種LSDV 后表現出臨床癥狀。最近，在南非的跳羚皮膚樣本中檢測到LSDV 核酸[14]。

3 臨床癥狀

LSD 具有急性、亞急性和慢性臨床癥狀，且有40%～50%的受感染動物會出現全身皮膚損傷；許多病例的臨床癥狀并不明顯但卻可能攜帶病毒，甚至可以傳播病毒。在自然條件下，LSD 的潛伏期是2～4 周，然而在實驗條件下所誘導的疾病，潛伏期通常只有4～14 d[2]。這種疾病在哺乳期的奶牛和小牛中，往往更嚴重[13]。發(fā)生臨床癥狀的動物，其發(fā)熱溫度甚至會超過41 ℃，在持續(xù)發(fā)熱的4～14 d，一般會伴隨有沮喪、不愿動、食欲不振、流口水、流眼淚和流鼻涕。此外，長期流眼淚可能會引起結膜炎，嚴重時會引起角膜渾濁和失明。淺表淋巴結，尤其是前腳淋巴結，角前和腮腺通常明顯增大[15]。

LSD癥狀通常發(fā)生在發(fā)熱反應開始后48 h內，其結節(jié)數量可能會很多，覆蓋全身，也可能只有零星幾個，頭部、頸部、會陰、生殖器、乳房和四肢等部位的皮膚易發(fā)。結節(jié)直徑范圍為5～50 mm，有邊界、堅固、圓形和凸起，涉及皮膚、皮下組織，有時甚至會涉及到皮下肌肉。有些小結節(jié)可能會自發(fā)消退且不留任何痕跡，而有些小結節(jié)會引發(fā)潰瘍，可發(fā)生在結膜、口角、鼻孔、口腔黏膜、喉部、氣管、食道和皺胃。大結節(jié)通常會纖維化且持續(xù)數月。一些急性感染可能會發(fā)展成嚴重的部分皮下水腫，如垂皮，胸部、四肢、乳房、陰囊和外陰水腫。水腫四肢的皮膚可能會壞死脫落，出現嚴重潰瘍，進而引起繼發(fā)性細菌感染；乳房部位的水腫和壞死病變可能會導致乳腺炎；在一些動物體內，氣管和肺的壞死病變可能導致肺炎；氣管損傷愈合后結締組織的收縮可能會導致局部氣管塌陷，進而導致窒息；公牛通常會暫時不育，也會導致永久不育；懷孕的母?？赡軙鳟a并會持續(xù)幾個月的不發(fā)情期[15-17]。

4 免疫應答

對CaPV 感染的免疫主要是由細胞來介導，需要有效地刺激復制因子[18]。除了被釋放到血液中的包膜病毒外，大多數子代病毒仍然留在受感染的細胞內。通過在細胞間傳播，這些病毒是循環(huán)抗體無法觸及和抵抗的。循環(huán)的抗痘病毒抗體能夠限制病毒在實驗動物中的傳播，但不能阻止病毒在感染部位的復制。先前感染或接種過疫苗的動物的免疫狀況與血清中抗體水平無關。所有CaPV 屬的病毒都由一個共同的主要抗原來中和抗體，因此從一種病毒感染中康復的動物被認為至少部分可免受另一種病毒的感染。不論癥狀是否明顯，從LSD 自然感染中康復的動物均會產生抗體，產生的這些抗體能夠中和病毒并且對再次感染具有抵抗力[15]。血清中和試驗（SNT）、熒光抗體試驗（FAT）、間接熒光抗體試驗（IFAT）或瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID）無法區(qū)分CaPVs。血清學交叉感染和交叉保護試驗表明痘屬病毒具有交叉免疫反應。

5 檢測手段

5.1 臨床診斷

LSD 可根據特異的臨床特征進行診斷，然而當癥狀不明顯時無法進行確診。由牛皰疹病毒-2（BHV-2）感染、昆蟲叮咬、蠕形螨感染、盤尾絲蟲病、貝諾孢子蟲病和嗜皮菌病引起的皮膚損傷會與LSD 所引起的混淆[19]。一般情況下，BHV-2 感染引起的淺表皮膚病變較多，病程較短，且比LSD 病癥輕。此外，病理組織學表明BHV-2感染中存在的核內包涵體與LSD 引起的胞質內的包涵體是相反的。因此，在LSD 病變發(fā)生后的一周左右，可通過電子顯微鏡檢測陰性活檢標本或分離病毒進行診斷。

5.2 實驗室技術

現場作出初步快速診斷確認，是成功控制和根除流行地區(qū)和非流行地區(qū)LSD 的基礎。目前，首選的診斷工具為分子檢測方法，且正逐步取代傳統的檢測方法。傳統的血清學檢測盡管適用于群體水平，但是對個體水平檢測速度慢，結果不可靠，不能作為主要的檢測方法。

5.2.1 抗原檢測（活的病毒或病毒核酸）

5.2.1.1 PCR 方法 通用的實時定量PCR 方法在檢測CaPV 病毒時較其他診斷方法更為敏感。該檢測方法主要是檢測CaPV 病毒的DNA，因此不能區(qū)分同一屬的不同品種。RT-PCR 方法已經在很多文獻中被報道[20]。采用RT-PCR 方法對CaPV 進行檢測，比傳統的凝膠PCR 檢測方法更為靈敏。該方法的檢測水平每次反應均少于10 個基因拷貝，與其他痘病毒無交叉反應，在檢測其他痘病毒或者陰性樣本時，也未出現假陽性結果。RTPCR 檢測方法具有定量、簡單、靈敏、特異等特點，可對CaPV 病毒進行快速和高通量的測定。該方法在歐盟相關實驗室被廣泛使用，如果與自動提取相結合，可用于大規(guī)模樣本的檢測。種特異性RTPCR 方法可區(qū)分SPPV、GTPV 和LSDV[14]，該方法通過檢測3 種病毒不同的熔點溫度差異，對獲得的熒光熔融曲線進行分析。聶福平等[21]建立的鑒別檢測牛結節(jié)性皮膚病病毒野生毒株的RT-PCR 方法，可有效用于臨床樣品的鑒別檢測。與RT-PCR相比，普通PCR 方法速度慢、靈敏度低、操作簡單、成本低；但對于某些資源有限以及專業(yè)人員缺乏的實驗室來說，普通PCR 是較好的選擇，只是該方法不能進行定量。近幾年逐漸發(fā)展起來的便攜式現場測試PCR 方法已初步取得較為滿意的結果，在現場條件下使用方便，并可在1 h 內獲得結果。由于試劑屬于凍干狀態(tài)，所以在現場檢測時不需低溫操作；樣品采集簡單方便，無需單獨進行DNA 提取，EDTA 中的血液、皮膚損傷部位或所結的痂，唾液、眼睛和鼻子的分泌物均可作為樣品材料。

5.2.1.2 環(huán)介導等溫擴增試驗（LAMP）LAMP已經被很多文獻報道但是并未廣泛使用[22-23]，LAMP 方法的檢測結果是通過顏色的改變判定，因此其結果的解釋也可能會出現偏差。

5.2.1.3 電子顯微鏡 通常在1 d 之內便可得到結果，但是電子顯微鏡技術需要昂貴的設備和專業(yè)訓練的實驗室人員。使用電子顯微鏡很難區(qū)分CaPV 和正痘病毒（Orthopoxvirus），因為二者在形態(tài)上比較接近。但是除了牛痘病毒，還沒有其他痘病毒可引起綿羊和山羊皮膚損傷。相反，CaPV 與副痘病毒屬不同，副痘病毒屬可引起牛的流行性口炎，這同樣可作為LSD 的鑒別診斷之一[15]。

5.2.1.4 病毒分離 主要用于確認病毒的傳染性，并不適合基本診斷，如果有可用的組織培養(yǎng)系統，則可以在多種細胞上進行病毒分離。然而，CaPV在細胞培養(yǎng)上生長緩慢，通常需要進行多次傳代。當從皮膚樣本或者結痂中分離病毒時，經常會被細菌和真菌污染。

5.2.2 抗體檢測

5.2.2.1 血清/病毒中和試驗 這是血清學檢測的金標準。該方法在檢測有輕微臨床癥狀和接種后體內低抗體度的動物還不夠敏感，且耗時耗力，因此不適合初步檢測或大量樣本的檢測。中和試驗的靈敏度在70%～96%之間，特異性可達100%[24]。但是，作為一種以細胞為基礎的檢測方法，其標準化相對困難并且其敏感性在不同實驗室可能有變化。該檢測方法還需要使用活的病毒且必須在具有三級防護水平的實驗室進行操作，同時還需有適合細胞培養(yǎng)的材料，如適當的原代細胞或細胞系和參考血清，且樣本材料必須是受感染動物的血清。

5.2.2.2 間接熒光抗體試驗（IFAT）IFAT 也被用于抗體檢測。2008 年，埃塞俄比亞研究人員評估了IFAT 作為診斷工具檢測LSD 抗體，測定的容量為每板45 個樣品，這比中和試驗所檢測的樣本量大，但是該檢測方法可能與其他痘病毒具有交叉反應[24]。由于背景熒光和細胞質的非特異性染色，對IFAT 結果的解釋可能更為主觀，因此在解釋結果前需要進行標準化。

5.2.2.3 瓊脂凝膠免疫擴散試驗 檢測抗體時所需設施簡單，操作方便，但敏感度較低并且會與副痘病毒產生交叉反應[25]。實時PCR 方法結合瓊脂凝膠電泳可對羊痘病毒進行檢測、定量和區(qū)分[14]。Zheng 等[26]建立了雙重PCR 方法用于同時檢測和區(qū)分羊痘病毒和口瘡病毒，并對其DNA 產物進行凝膠電泳，所建立的方法檢出限為1 pfu，且具有較高的靈敏度和特異性。

5.2.2.4 酶聯免疫吸附測定法（ELISA）ELISA具有敏感性和特異性高的優(yōu)點，但需注意試劑與儀器的選擇，兩者會影響其檢測結果的準確性。Authie[20]利用ELISA 檢測綿羊痘和山羊痘，敏感性為70%～100%，特異性為84%～100%。史宗勇等[27]采用ELISA 方法對山西北部圈養(yǎng)羊群羊痘進行實驗室診斷技術研究，檢測的12 個樣品的OD值孔間變異系數小于10%，說明檢測結果穩(wěn)定性和重復性良好。Babiuk 等[28]采用間接酶聯免疫吸附測定法檢測山羊、綿羊和牛共231 份血清中羊痘病毒的特異性抗體，結果其敏感性為96%，特異性為95%。同樣，Bowden 等[29]采用重組羊痘病毒屬抗原建立間接酶聯免疫吸附法對病毒進行檢測，經過對42 種抗原的篩選，鑒定到有效表達的兩個羊痘病毒核心蛋白；當對人工感染病毒的羊血清進行檢測，ELISA 的敏感性和特異性范圍為95%～97%，且無交叉反應。

6 防控建議

2019 年LSD 已傳至我國，對我國養(yǎng)牛業(yè)造成了一定打擊。為防控LSD 蔓延，政府及有關主管部門應盡早建立LSD 的標準診斷技術，對防疫人員及養(yǎng)殖者開展培訓和宣傳，建立疫苗儲備等。同時，各地方動物疫病預防控制部門應加強LSD 診斷能力和監(jiān)測排查，在高危和低危地區(qū)對易感牛群進行抽樣，確保第一時間發(fā)現疫情。