響應(yīng)面法優(yōu)化楓楊葉多糖醇提取工藝及其抗氧化活性研究

謝朋飛， 劉靜， 蔡延渠， 王俊杰， 張遠(yuǎn)芳

（1.郴州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖南郴州 423000；2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東廣州 510006；3.湘南學(xué)院，湖南郴州 423000）

楓楊葉為胡桃科植物楓楊（Pterocarya stenoptera DC.）的葉，又名麻柳葉，分布于陜西、河南及長(zhǎng)江流域以南地區(qū)。味苦，性溫，有小毒。具有止咳化痰、消炎解毒、殺蟲(chóng)止癢的功效。主治慢性氣管炎、關(guān)節(jié)痛、瘡疽癤腫、疥癬風(fēng)癢、皮炎濕疹、湯火傷等病癥[1-2]?，F(xiàn)代研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，其具有抗腫瘤、抗病毒、殺滅釘螺等作用，主要成分有維生素、鞣質(zhì)、水楊酸、內(nèi)酯及酚類(lèi)等化合物，但關(guān)于多糖類(lèi)物質(zhì)則鮮少報(bào)道。因此，本研究采用加熱回流提取法，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化楓楊葉多糖的乙醇提取工藝，同時(shí)評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，以期為楓楊葉多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥品與試劑 楓楊葉樣品采自湖南郴州，經(jīng)湘南學(xué)院王俊杰教授鑒定為胡桃科楓楊屬植物楓楊（Pterocarya stenoptera DC.）的葉。D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201707）；三羥甲基氨基甲烷（Thris）、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（上海麥克林生化科技有限公司）；鄰苯三酚、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸、過(guò)硫酸鉀、抗壞血酸（Vc）、鹽酸、無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、三氯乙酸、氯化鐵均為分析純；水為實(shí)驗(yàn)室自制純水。

1.2 儀器 UV-1700雙光束紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；EPED-10TF純水器（南京益普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；FreeZone2.5冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司）；CP-225D電子天平（0.01 mg，德國(guó)賽多利斯公司）；ME-204電子天平（0.000 1 g，瑞士梅特勒—托利多公司）；JJ1000Y電子天平（美國(guó)雙杰集團(tuán)有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；BHS-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江陰市保利科研器械有限公司）；pHS-3C pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測(cè)定[6]

2.1.1 楓楊葉多糖制備 將楓楊葉干燥，粉碎成粗粉，稱(chēng)取30 g粉末，加入20倍量60%乙醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）加熱提取2次，1 h/次，藥液75℃減壓濃縮至適量，定容為1 g（生藥）/mL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱(chēng)取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品9.96 mg，加水配制成0.099 6 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于試管中，加水至1.0 mL；再加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸，90℃水浴20 min后取出冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)定吸光度（D）值。同時(shí)以水為參比溶液進(jìn)行空白對(duì)照。D為縱坐標(biāo)、D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），線性回歸得方程Y＝0.069 0X＋0.039 0，r＝0.999 5，表明在1.422 9～11.382 9μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of glucose

2.1.3 多糖含量測(cè)定 按“2.1.1”項(xiàng)下操作制備楓楊葉多糖樣品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下操作進(jìn)行顯色反應(yīng)后測(cè)定吸光度D值，代入回歸方程計(jì)算多糖含量，根據(jù)以下公式計(jì)算多糖得率。楓楊葉多糖得率（%）=多糖質(zhì)量/楓楊葉質(zhì)量×100%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 采用加熱回流方法，分別考察乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。

2.2.1 乙醇濃度 考察40%、50%、60%、70%、80%等不同濃度乙醇溶液對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。結(jié)果顯示：隨著乙醇濃度的升高，多糖得率逐漸提高；當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，多糖得率最高；隨后繼續(xù)提高乙醇濃度，多糖得率則隨著下降。推測(cè)可能是當(dāng)溶液極性下降，水溶性多糖的溶出率降低。具體變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2。

2.2.2 提取溫度 考察60、70、80、90、100℃等不同提取溫度對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。結(jié)果顯示，楓楊葉多糖得率隨著溫度的升高而提高，當(dāng)溫度為100℃時(shí)達(dá)到最高值。具體變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3。

圖2 不同乙醇濃度對(duì)楓楊葉多糖得率的影響Figure 2 The effect of the different concentrations of ethanol on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

圖3 不同提取溫度對(duì)楓楊葉多糖得率的影響Figure 3 The effect of the different extraction temperatures on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

2.2.3 料液比 考察1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50[（m/g）∶（V/mL），下同]等不同料液比對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。結(jié)果顯示，楓楊葉多糖得率隨著溶劑用量的增加而提高，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)接近最高值，隨后增加溶劑量，得率略微提高。具體變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4。

圖4 不同料液比對(duì)楓楊葉多糖得率的影響Figure 4 The effect of the different solid-liquid ratios on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

2.2.4 提取時(shí)間 考察0.5、1、2、3、4 h等提取時(shí)間對(duì)楓楊葉多糖得率的影響。結(jié)果顯示，在1～3 h內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率較為明顯地提高；4 h后，變化趨勢(shì)變緩，得率略微提高。其原因可能是溶液中多糖含量接近飽和，因此即使增加提取時(shí)間，多糖的溶解也較少。具體變化趨勢(shì)見(jiàn)圖5。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)楓楊葉多糖得率的影響Figure 5 The effect of the different extraction time on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法[7-8]以多糖得率為響應(yīng)值指標(biāo)，選擇乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為影響因素進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到楓楊葉多糖得率（Y）對(duì)三因素的回歸方程：Y=12.28-0.20A+0.27B+0.61C+0.01AB+0.010AC-0.14BC-1.18A2-0.59B2-0.53C2。

2.3.1 模型建立與方差分析 由表3結(jié)果可知，模型F值為78.35，P＜0.000 1，表明該模型具有顯著性。同時(shí)模型失擬項(xiàng)值為0.638 6（P＞0.05），表明模型擬合度良好。相關(guān)系數(shù)R2為0.990 2及失擬項(xiàng)系數(shù)R2Adj為0.775，均表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)性良好。由F值可知，因素A、B、C對(duì)楓楊葉多糖得率有顯著影響（P＜0.001），順序依次為C＞B＞A，三者間的交互項(xiàng)影響不顯著（P＞0.05），表明楓楊葉多糖與各個(gè)因子之間不單單是線性關(guān)系。二次項(xiàng)A2、B2、C2亦影響顯著（均P＜0.001）。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface methodology

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The design and results of response surface methodology test

2.3.2 響應(yīng)面圖分析 由模型繪制各因素的等高線與響應(yīng)面，可以分析在最佳條件下不同變量的取值和各變量之間產(chǎn)生交互作用的顯著程度。由結(jié)果可知，乙醇濃度與提取時(shí)間的響應(yīng)面較為陡峭、等高線較為趨于橢圓形，表明因素間交互作用較為顯著，而其他因素間的交互作用則不顯著。具體見(jiàn)圖6。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)軟件Design Expert 8.0分析所得楓楊葉多糖提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度59.39%、料液比1∶40.67，提取時(shí)間3.60 h、提取2次，預(yù)測(cè)多糖得率為12.47%。結(jié)合實(shí)際，調(diào)整最優(yōu)條件為乙醇濃度60%、料液比1∶40，提取時(shí)間3.5 h、提取2次。按此工藝進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得多糖得率為（12.12±0.08）%，與預(yù)測(cè)值接近，表明模型具有良好的預(yù)測(cè)性，且響應(yīng)面法優(yōu)化所得工藝條件準(zhǔn)確、可靠。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 The variance analysis results of regression model

2.4 楓楊葉多糖抗氧化能力測(cè)定[9-10]稱(chēng)取楓楊葉粗粉100 g，按照最佳工藝條件進(jìn)行提取，藥液80℃減壓濃縮至適量，冷凍干燥至恒質(zhì)量（7.52 g），研磨成粉，過(guò)100目篩，即得楓楊葉多糖。稱(chēng)取適量楓楊葉多糖和Vc（陽(yáng)性對(duì)照），分別用純水配成系列質(zhì)量濃度溶液，進(jìn)行不同抗氧化活性檢測(cè)。

2.4.1 清除DPPH·自由基能力測(cè)定 分別吸取1 mL的不同質(zhì)量濃度樣品溶液和0.5 mL的DPPH儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度為0.35 mg/mL）于試管中，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度D1值；吸取0.5 mL DPPH儲(chǔ)備液、1 mL純水，同法操作，測(cè)定吸光度D0值；吸取0.5 mL無(wú)水乙醇、1 mL樣品溶液，同法操作，測(cè)定吸光度D2值。根據(jù)下式計(jì)算清除率：清除率=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：楓楊葉多糖，Y=0.062 3X+0.304 3（R2=0.985 4）；Vc，Y=0.029 6X+0.345 5（R2=0.990 5）。計(jì)算IC50：楓楊葉多糖，3.141 3 mg/mL；Vc，5.219 6 mg/mL。結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.4.2 清除ABTS+·自由基能力測(cè)定先將7 mmol/L的ABTS溶液和7.35 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液按體積比2∶1混合，室溫下避光反應(yīng)16 h，即為ABTS儲(chǔ)備液；用前以純水稀釋?zhuān)蛊湓诓ㄩL(zhǎng)734 nm處的吸光度值D0為0.70±0.20。分別吸取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液和2 mL ABTS稀釋液于試管中，超聲30 s，室溫下暗處反應(yīng)8 min，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度值D1。根據(jù)下式計(jì)算清除率：清除率=[（D0-D1）/D0]×100%。

圖6 不同因素對(duì)楓楊葉多糖得率影響的響應(yīng)面值（1）（3）（5）與等高線圖（2）（4）（6）Figure 6 The response surface diagrams（1）（3）（5）and contour line plots（2）（4）（6）for the effects of the different factors on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

圖7 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)DPPH·自由基清除能力的變化（1）（2）Figure 7 The changes of DPPH· radical-scavenging activities of the samples at different concentrations（1）（2）

通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：楓楊葉多糖，Y=0.287 0X+0.310 7（R2=0.993 3）；Vc，Y=17.384 1X+0.320 9（R2=0.994 0）。計(jì)算IC50得：楓楊葉多糖，0.659 6 mg/mL；Vc，0.010 30 mg/mL。結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)ABTS+·自由基清除能力的變化（1）（2）Figure 8 The changes of ABTS+· radical-scavenging activities of the samples at different concentrations（1）（2）

2.4.3 清除·OH自由基能力測(cè)定 分別吸取2 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液、2 mL的6 mmol/L FeSO4溶液及2 mL的6 mmol/L H2O2溶液于試管中，靜置10 min后再加入2 mL的6 mmol/L水楊酸溶液，靜置30 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度D1值；以純水代替水楊酸，同法測(cè)定吸光度D2值；另以純水為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度D0值。根據(jù)下式計(jì)算清除率：清除率 =[1-（D1-D2）/D0]× 100%。

通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：楓楊葉多糖，Y=0.020 4X+0.271 4（R2=0.980 6）；Vc，Y=1.002 7X+0.204 8（R2=0.985 3），計(jì)算IC50得：楓楊葉多糖，11.205 9 mg/mL；Vc，0.294 4 mg/mL。結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)·OH自由基清除能力的變化（1）（2）Figure 9 The changes of·OH radical-scavenging activities of the samples at different concentrations（1）（2）

通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：楓楊葉多糖，Y=0.934 9X+0.098 7（R2=0.980 5）；Vc，Y=31.931 0X+0.190 4（R2=0.983 0）。計(jì)算IC50得：楓楊葉多糖，0.429 2 mg/mL；Vc，0.009 314 mg/mL。結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)O-2自由基清除能力的變化（1）（2）Figure 10 The changes of O-2 radical-scavenging activities of the samples at different concentrations（1）（2）

2.4.5 還原力測(cè)定 分別吸取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液于試管中，依次加入1%鐵氰化鉀溶液與磷酸緩沖液（pH=6.6）各2.5 mL，混勻，50℃水浴20 min，取出冰水冷卻至室溫。再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，3 000 r/min離心10 min；取上清液2.5 mL，加入0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液和2.5 mL的蒸餾水，混勻20 min后于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)其吸光度。同時(shí)以水為空白溶劑、Vc為陽(yáng)性對(duì)照。由圖11可知，楓楊葉多糖與Vc的還原力均隨質(zhì)量濃度的增大而較為緩慢提高。二者相比，Vc的還原力更強(qiáng)。

圖11 不同樣品的還原能力Figure 11 The reducing power of the different samples

3 討論

本研究通過(guò)響應(yīng)面法篩選出楓楊葉多糖的最優(yōu)提取工藝為：乙醇60%、料液比1∶40、100℃加熱回流提取3.5 h、提取2次。驗(yàn)證結(jié)果顯示多糖得率為12.12%。表明所建立的模型具有良好的預(yù)測(cè)性。同時(shí)分析因素間的交互效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間的相互影響較為明顯。

抗氧化活性結(jié)果表明，楓楊葉多糖對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH和等自由基的清除能力較強(qiáng)，還原力與抗氧化能力表現(xiàn)出正相關(guān)性，且均呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，其中對(duì)DPPH·的IC50（3.141 3 mg/mL）明顯低于Vc的IC50（5.219 6 mg/mL）。提示楓楊葉多糖具有較好的抗氧化作用，可用于醫(yī)藥保健食品、美容護(hù)膚品等產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。由于所得楓楊葉多糖仍為粗品，純度較低，我們將在下一步工作中對(duì)其進(jìn)行分離、純化，制備出純度更高的多糖物質(zhì)，同時(shí)將會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化試驗(yàn)，以更好地確證其抗氧化功能。