重組酶等溫擴增試紙條快速檢測阪崎克羅諾桿菌

陳純陽，張宸寧，史愛瑩，杜欣軍*，王 碩*

（省部共建食品營養(yǎng)與發(fā)全國家重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

阪崎克羅諾桿菌[1-2]屬于腸桿菌科克羅諾桿菌屬，是一種無芽孢有周生鞭毛、能運動、兼性厭氧的革蘭氏陰性菌。該菌廣泛分布于自然界中，現(xiàn)已從嬰幼兒配方食品、肉制品、水果蔬菜、谷物等食品內(nèi)分離出該菌[3-7]。阪崎克羅諾桿菌是一種成人食源性條件致病菌，但卻是嬰幼兒配方奶粉的A類致病菌，它會導致不同年齡段人群感染，特別是對新生兒和免疫功能不全人群，危害嚴重，可致感染者發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎、腦膜炎、敗血癥等疾病[8-9]。因此，開發(fā)一種快速靈敏的阪崎克羅諾桿菌鑒定技術(shù)對于預防與控制該致病菌危害具有重要的實際意義。

目前，對于該致病菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)生化分析和以分子生物學方法[10]為代表的許多其他方法。傳統(tǒng)的檢測分離阪崎克羅諾桿菌的方法，依賴其生理生化特性，國際上通常使用美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）建立的嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的分離計數(shù)方法[11]。我國在也制定了GB 4789.40—2016《食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》[12]，規(guī)范了阪崎克羅諾桿菌的檢測。但是傳統(tǒng)檢測方法費時費力，需要長達5 d才能獲得結(jié)果?；诰酆厦告準椒磻╬olymerase chain reaction，PCR）的分子生物學方法已經(jīng)應用于微生物的檢測。然而，PCR分析需要昂貴的設備與專業(yè)的操作人員，因此不適合在經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)和基層地區(qū)進行廣泛的應用和推廣[13-14]。鑒于PCR技術(shù)的局限性，近年來，等溫核酸擴增技術(shù)快速發(fā)展，例如環(huán)介導等溫擴增（loop-meditated isothermal amplification，LAMP）、滾環(huán)等溫擴增（rolling circle amplification，RCA）和重組酶聚合酶等溫擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）等[15-16]。RPA是由多種酶參與，在恒定溫度下實現(xiàn)核酸指數(shù)擴增的新技術(shù)[17]。與其他等溫擴增技術(shù)相比，RPA優(yōu)勢在于靈敏度高、特異性強、所需溫度低、擴增時間短，因此更適合于現(xiàn)場檢測[18-19]。目前，RPA已經(jīng)用于多種病原體的檢測[20-22]，其操作方法簡便，反應20 min內(nèi)就可以產(chǎn)生檢測水平的擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物的檢測通?？捎秒娪痉椒ǎ请娪静僮鲝碗s、時間長、需要設備多，僅適合實驗室內(nèi)使用。而免疫層析試紙條（lateral fl ow strip，LF）分析只需5 min即可完成目標物的分析，且無需任何特殊設備，通過肉眼就可以觀察結(jié)果，是一種高效的核酸擴增產(chǎn)物檢測方法[23]。在試紙條檢測方法中，金納米粒子是應用最廣泛的標記材料[24]，與其他材料相比具有信號強、穩(wěn)定性高、便于制備等優(yōu)勢。

本研究將RPA技術(shù)和LF技術(shù)相結(jié)合，建立了一種阪崎克羅諾桿菌快速檢測方法（RPA-LF）。等溫擴增與產(chǎn)物檢測步驟可以在20 min內(nèi)完成，且具有較高的靈敏度和特異性，可用于阪崎克羅諾桿菌的快速檢測。本研究旨在為食源性致病菌的快速檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗采用阪崎克羅諾桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等常見食源性致病菌共21 株菌株見表1。

表1 實驗菌株Table 1 Strains used in this study

LB肉湯培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；阪崎顯色培養(yǎng)基、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素培養(yǎng)基 青島海博生物公司；緩沖蛋白胨水北京路橋技術(shù)有限公司；RPA試劑盒 英國TwistDX公司；DNA提取試劑盒 北京天根生物有限公司；氯金酸、檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白、PEG2000、吐溫20、鏈霉親和素 美國Sigma公司；鼠抗地高辛單克隆抗體 美國Abcam公司；塑料背襯、樣品墊、吸回墊上海金標生物科技有限公司；硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜 美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；電熱恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器儀表有限公司；電泳儀、凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；磁力攪拌器 德國IKA公司；雙維往復式劃膜儀 上海金標生物科技有限公司；真空干燥箱 天津三水儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株模板的制備

將菌種于-80 ℃取出置于冰盒上，取100 μL加入10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。次日取出，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA，DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設計

從NCBI GenBank獲得阪崎克羅諾桿菌ompA序列[25]，應用Primer 5.0設計特異性引物。正方引物標記地高辛，反方引物標記生物素，引物由蘇州金唯智公司合成，詳見表2。

1.3.3 膠體金試紙條制備

1.3.3.1 膠體金標記抗體的制備

制備直徑約為20 nm的膠體金顆粒[26]，并用紫外-可見光度計對其進行質(zhì)量鑒定。取1 mL膠體金，用K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH 8.5，再加入10 μL的鼠抗地高辛單克隆抗體，4 ℃孵育1 h后，加入20 μL 20% BSA溶液和10 μL 20%的PEG20000，混合均勻后繼續(xù)于4 ℃孵育30 min。金標抗體純化后加入200 μL的金標工作液重懸，并將金標抗體平鋪到結(jié)合墊上，真空干燥過夜。

1.3.3.2 膠體金試紙條的制備

膠體金LF樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、背板和吸水紙組成。樣品墊和結(jié)合墊由玻璃纖維組成，金標抗體均勻涂布在結(jié)合墊上作為金標墊，37 ℃真空干燥過夜。鏈霉親和素和羊抗鼠二抗分別利用劃膜儀劃至NC膜上作為T線和C線，37 ℃干燥過夜。按順序?qū)悠穳|、金標墊、NC膜和吸水紙4 個部分貼在背板上，用切條機切割成試紙條，密封保存?zhèn)溆谩PA-LF試紙條結(jié)構(gòu)及檢測原理如圖1所示。

圖1 RPA-LF檢測原理圖Fig. 1 Schematic diagram of RPA-LF

1.3.4 RPA優(yōu)化

1.3.4.1 反應溫度的優(yōu)化

RPA反應液配制：加入2.4 μL正反方引物（10 μmol/L），反應試劑29.5 μL，2 μL DNA模板和11.2 μL去離子水，迅速振蕩混勻，再方管中加入酶，振蕩混勻，最后加入2.5 μL醋酸鎂，充分混勻。將RPA反應液在不同溫度（30、38、40、42、45 ℃）水浴鍋中進行反應，用試紙條進行檢測得出最適擴增溫度。

1.3.4.2 反應時間的優(yōu)化

將反應時間依次設定為5、10、15、20 min和30 min，根據(jù)試紙條結(jié)果得出最佳反應時間。

1.3.5 膠體金試紙條的優(yōu)化

1.3.5.1 NC膜的選擇

選用Milipore HF 90 s、Milipore HF 135 s和Milipore HF 180 s三種類型的NC膜制備試紙條，根據(jù)顯色情況選擇最佳的NC膜型號。

1.3.5.2 樣品展開液的優(yōu)化

分別選用0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 8.5），0.01 mol/L磷酸鹽-吐溫緩沖液（phosphate buffered solution-tween，PBST）（pH 8.5），0.01 mol/L PBST（pH 7.4）和蒸餾水4 種溶液作為樣品展開液，取10 μLRPA產(chǎn)物與分別與90 μL 4 種緩沖液充分混合均勻，將100 μL上樣液體滴加在試紙條加樣孔上，根據(jù)顯色結(jié)果，選擇最適樣品展開液。

1.3.6 膠體金試紙條檢測

1.3.6.1 靈敏度檢測

取100 μL阪崎克羅諾桿菌加入10 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)4 h，使OD值達到0.7左右。菌液用PBS溶液1∶10梯度稀釋，稀釋后的菌液分成兩部分，一部分進行平板計數(shù)，另一部分使用水煮法提取基因組DNA。提取步驟如下：取1 mL菌液置于99 ℃水浴鍋中裂解15 min，立刻置于冰上冷卻10 min后10 000 r/min離心5 min，取上清液即為DNA。用RPA最佳體系進行擴增，擴增后100 μL混合物滴加在試紙條樣品孔中，室溫靜置5 min后觀察結(jié)果。將RPA產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrohoreis，AGE）檢測，比較RPA-AGE和RPA-LF的靈敏度。

1.3.6.2 特異性檢測

使用15 株阪崎克羅諾桿菌和6 株非克羅諾桿菌驗證RPA-LF方法的特異性，使用RPA方法擴增不同菌株DNA，擴增后100 μL混合物滴加在試紙條樣品孔中，室溫靜置5 min后觀察結(jié)果。

1.3.7 模擬（增菌）樣品檢測

從當?shù)爻匈徺I嬰幼兒配方奶粉、嬰幼兒配方羊奶粉、嬰幼兒米粉和牛肉作為實際樣品進行檢測，分別稱取25 g方其中分別添加梯度稀釋的阪崎克羅諾桿菌純菌液。將人工污染阪崎克羅諾桿菌的樣品加入到225 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)0、2、4、6 h后采集培養(yǎng)物，用水煮法提取基因組DNA作為模板，用RPA最佳體系進行擴增，擴增結(jié)束后將100 μL混合物加到試紙條樣品孔中，5 min后觀察結(jié)果。所有樣品同時利用GB/T 4789.40—2016方法進行檢測。

1.3.8 實際樣品檢測

利用市售及天津市檢驗機構(gòu)提供的嬰幼兒配方奶粉、全脂奶粉、脫脂奶粉等20 種實際樣品，每份取25 g，加入到225 mL LB培養(yǎng)基中混勻，37 ℃培養(yǎng)4 h后提取DNA，進行RPA-LF檢測。所有樣品同時利用GB/T 4789.40—2016方法進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA條件優(yōu)化

2.1.1 反應溫度優(yōu)化

在不同溫度條件下應用RPA、以試紙條進行檢測，結(jié)果表明RPA在30～45 ℃均可以擴增阪崎克羅諾桿菌，且檢測線顏色深淺與溫度有關(guān)，由于酶處于最佳反應溫度時，擴增效率最高，試紙條檢測線部位顏色最深，因此選取45 ℃為后續(xù)實驗最佳反應溫度，見圖2。

圖2 RPA反應溫度優(yōu)化Fig. 2 Optimization of amplification temperature for detection of C. sakazakii

2.1.2 反應時間優(yōu)化

在45 ℃進行不同時間的擴增，結(jié)果顯示擴增5 min后即可出現(xiàn)檢測線（圖3），并且隨著反應時間的延長，檢測線顏色加深。但隨著擴增時間的延長，引物二聚體產(chǎn)生的非特異性擴增的幾率增加，為保證實驗準確性、穩(wěn)定性和快速性，選取15 min作為最佳擴增時間。

圖3 RPA反應時間優(yōu)化Fig. 3 Optimization of incubation time for detection of C. sakazakii

2.2 膠體金試紙條優(yōu)化

2.2.1 樣品展開液的優(yōu)化

展開液由于成分不同，所含離子不同，會影響金標抗體的流動性和顯色情況，實驗中使用PBS（pH 8.5）、PBST（pH 7.4）、PBST（pH 8.5）和蒸餾水4 種溶液進行比較。結(jié)果顯示PBS和蒸餾水的檢測線顏色顯示效果較好，pH值為7.4和8.5的PBST檢測線較淺（圖4），而在上樣過程中蒸餾水流動速度較慢，顯色時間較長，因此選擇PBS（pH 8.5）作為最佳樣品展開液。

圖4 樣品展開液優(yōu)化Fig. 4 Optimization of sample buffer

2.2.2 NC膜優(yōu)化

NC膜是決定結(jié)果的重要因素之一，Milipore HF 90 s、135 s和180 s三種NC膜檢測結(jié)果表明：Milipore HF 90 s孔徑最大，層析速度快，但是檢測線條帶顏色較淺；Milipore HF 180 s層析速度慢，檢測時間過長；Milipore HF 135 s孔徑適宜，層析速度較快，出現(xiàn)條帶顏色清晰（圖5），因此最終選擇Milipore HF 135 s NC膜。

圖5 NC膜優(yōu)化Fig. 5 Optimization of NC membrane

2.3 靈敏度與特異性分析

2.3.1 靈敏度分析

為確定RPA-LF檢測阪崎克羅諾桿菌純菌液的檢測限，將純菌液10 倍梯度稀釋，水煮法提取DNA作為RPA反應模板，同時進行RPA-AGE與RPA-LF靈敏度進行比較。RPA-LF結(jié)果顯示隨著阪崎克羅諾桿菌的濃度增加時，檢測線亮度逐漸增加，當濃度為1.7×102CFU/mL時，檢測線亮度與陰性對照仍然有明顯不同。因此，1.7×102CFU/mL為RPA-LF檢測阪崎克羅諾桿菌純菌液的檢測限。RPA-AGE結(jié)果顯示其檢測限為1.7×105CFU/mL（圖6），檢測限明顯高于RPA-LF。Ye Yingwang等[27]建立的阪崎克羅諾桿菌PCR技術(shù)，檢測純菌液的靈敏度為102CFU/mL。Hu Shuangfang等[28]等建立的實時定量PCR檢測阪崎克羅諾桿菌最低純菌液濃度為1.1×102CFU/mL，表明PCR和實時定量PCR技術(shù)與本研究建立的RPA-LF檢測限處于相同水平。但是，基于PCR和實時定量PCR技術(shù)所建立的檢測方法依賴于精密的儀器設備和專業(yè)的實驗人員，而RPA-LF無需復雜的實驗儀器、實驗操作簡便，整個反應時間在20 min以內(nèi)完成，因此RPA-LF適用于現(xiàn)場快速檢測。Liu Siying等[29]建立的克羅諾桿菌RPA實時定量快速檢測方法，所得檢測限約為103CFU/mL，所需時間為15 min?？梢?，RPA-LF較實時定量RPA在相同的時間內(nèi)，方法檢測限更低，更適合阪崎克羅諾桿菌的快速檢測。

圖6 RPA-AGE和RPA-LF靈敏度比較Fig. 6 Comparison of the sensitivity of RPA-LF with that of RPA-AGE

2.3.2 特異性分析

選取15 株阪崎克羅諾桿菌和6 株非克羅諾桿菌，驗證RPA-LF方法的特異性。結(jié)果顯示全部的阪崎克羅諾桿菌均呈陽性，而其他菌種均只有出現(xiàn)質(zhì)控線，未出現(xiàn)檢測線，證明本實驗建立的RPA-LF對于阪崎克羅諾桿菌的具有良好的特異性（圖7）。

圖7 RPA-LF檢測阪崎克羅諾桿菌特異性Fig. 7 Specificity of the RPA-LF assay for detection of C. sakazakii

2.4 模擬（增菌）樣品檢測結(jié)果

為驗證RPA-LF的實用性，選擇嬰幼兒配方奶粉、嬰幼兒配方羊奶粉、嬰幼兒米粉和牛肉為待測樣品，添加不同濃度的阪崎克羅諾桿菌，并在37 ℃增菌不同時間。提取樣品DNA后，使用RPA-LF檢測。

結(jié)果表明奶粉和羊奶粉中含有1.7×102CFU/g的阪崎克羅諾桿菌時，不增菌即可以檢出（圖8a、d）；當奶粉和羊奶粉中含有1.7×101CFU/g的阪崎克羅諾桿菌時，37 ℃增菌2 h可以檢出（圖8b、e）；奶粉和羊奶粉中含有1.7×100CFU/g的阪崎克羅諾桿菌時，37 ℃增菌4 h可被檢出（圖8c、f）。Li Yuanhong等[30]建立的qPCR方法檢測嬰幼兒配方奶粉中含有1.06×100CFU/g阪崎克羅諾桿菌時，需要增菌12 h才可被檢出，可見RPA-LF檢測奶粉中的阪崎克羅諾桿菌更為靈敏。

圖8 RPA-LF檢測實際樣品中克羅諾桿菌Fig. 8 RPA-LF detection of C. sakazakii in artificially contaminated food samples

當實際樣品為嬰幼兒米粉時，結(jié)果顯示米粉中含有1.7×102CFU/g阪崎克羅諾桿菌純菌液時，37 ℃培養(yǎng)1 h可以檢出（圖8g）；米粉中含有1.7×101CFU/g的阪崎克羅諾桿菌時，37 ℃培養(yǎng)2 h可檢出（圖8h）；當米粉中含有1.7×100CFU/g的目標菌時，37 ℃培養(yǎng)4 h可檢出（圖8i）。

當牛肉中含有1.7×102CFU/g的阪崎克羅諾桿菌時，37 ℃培養(yǎng)2 h可以檢出（圖8j）；當方牛肉中含有1.7×101CFU/g的阪崎克羅諾桿菌菌液時，37 ℃培養(yǎng)4 h可以檢出（圖8k）；牛肉中含有1.7×100CFU/g的菌液后，37 ℃培養(yǎng)6 h可被檢出（圖8l）。

此結(jié)果表明RPA-LF在嬰幼兒配方奶粉和米粉中檢測1.7×100CFU/g的阪崎克羅諾桿菌，包括增菌、提取DNA和檢測，最多需要5 h可以得出結(jié)果；檢測牛肉等肉制品所需時間稍長，需7 h得出結(jié)果。而Liu Siying等[29]所建立的實時定量RPA檢測嬰兒配方奶粉中的100CFU/g克羅諾桿菌，獲得檢測結(jié)果需要約8 h，證明RPA-LF檢測阪崎克羅諾桿菌更加靈敏快速，適合用于食品的快速檢測。

所有樣品同時利用GB/T 4789.40—2016方法進行阪崎克羅諾桿菌檢測，結(jié)果均為陽性，但是檢測所需時長為5 d。將RPA-LF與傳統(tǒng)檢測方法進行比較可知，二者可獲得相同的檢測結(jié)果，但RPA-LF檢測時間遠小于傳統(tǒng)檢測方法。

2.5 實際樣品檢測結(jié)果

利用嬰幼兒配方奶粉、全脂奶粉等20 種實際樣品作為檢測對象，同時利用RPA-LF檢測和國標法檢測。結(jié)果（表3）顯示：1 種全脂奶粉和1 種嬰幼兒配方奶粉檢測結(jié)果為陽性，其余樣品均為陰性。兩種檢測方法結(jié)果一致，表明RPA-LF具有較高的檢測準確性。

表3 實際樣品檢測結(jié)果Table 3 Comparative detection of C. sakazakii in real food samples using RPA-LF and the national standard method

3 結(jié) 論

阪崎克羅諾桿菌作為一種食源性條件致病菌，會導致不同年齡組的人感染疾病，因此，食品中阪崎克羅諾桿菌的檢測也逐漸受到重視，尤其是嬰幼兒配方奶粉的污染嚴重威脅嬰幼兒的健康。本研究將RPA與LF相結(jié)合用于阪崎克羅諾桿菌檢測。在純培養(yǎng)的條件下，RPA-LF檢測阪崎克羅諾桿菌純菌液的檢測限為1.7×102CFU/mL，比傳統(tǒng)檢測方法、PCR和實時定量RPA檢測方法更為快速靈敏。當實際樣品污染量為1.7×100CFU/g阪崎克羅諾桿菌時，此方法可以在5 h內(nèi)對嬰幼兒配方奶粉和米粉、在7 h內(nèi)對牛肉完成檢測。利用20 種實際樣品評價RPA-LF的準確性，結(jié)果顯示RPA-LF與國家標準方法獲得一致的檢測結(jié)果。因此，本研究所建立的RPA-LF是一種簡便、快速、適合現(xiàn)場使用的阪崎克羅諾桿菌檢測方法。