基于氣相離子遷移譜檢測靜電場處理的大菱鲆品質(zhì)

陳東杰，張明崗，聶小寶，姜沛宏，張玉華,*，張長峰，任 芳

（1.山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運保鮮技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250103；2.國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250103；3.濰坊工程職業(yè)學(xué)院，山東 青州 262500；4.山東海能科學(xué)儀器有限公司，山東 德州 251500）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）因肌肉白嫩、高蛋白、低脂肪、口感爽滑鮮嫩、風味獨特等特點，深受廣大消費者喜愛。因其肌肉柔軟，含水量高，體內(nèi)組織酶類活性強，在貯藏過程中極易滋生微生物，致使魚肉腐敗變質(zhì)，造成重大經(jīng)濟損失[1-2]，研究其保鮮技術(shù)具有重大意義。目前魚肉保鮮方法有氣調(diào)貯藏、冷凍和保鮮劑涂膜[3-5]等。氣調(diào)貯藏及射線對場地和設(shè)備要求較高；冷凍貯藏解凍后影響大菱鲆風味及口感；保鮮劑涂膜操作繁瑣、不易操作且不利于商業(yè)化。靜電場貯藏保鮮技術(shù)是一種新型的食品保鮮技術(shù)，可影響生物體某些生物酶的活力，一定頻率和強度的靜電場可抑制微生物生長與繁殖。目前靜電場技術(shù)已應(yīng)用在番茄、草莓、雞蛋、羅非魚[6-9]貯藏中，但目前尚無靜電場對大菱鲆貯藏效果的研究。

氣相色譜離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一種將離子遷移譜技術(shù)和氣相色譜技術(shù)兩者結(jié)合的檢測技術(shù)[10]，此檢測技術(shù)克服離子遷移譜技術(shù)分離度差的局限性，使得離子遷移譜信號響應(yīng)經(jīng)氣相預(yù)分離后質(zhì)量上得到顯著改善，而離子遷移譜通過漂移時間信息又使得氣相色譜分離后得到的化學(xué)信息更加豐富；GC-IMS技術(shù)充分發(fā)揮了不同儀器各自的優(yōu)點，產(chǎn)生長處相互疊加的優(yōu)勢[11-12]。該技術(shù)具有快速、靈敏、無需前處理、簡單的優(yōu)點，已應(yīng)用于食品風味分析、品質(zhì)檢測等多個領(lǐng)域[13-16]。

本實驗探討4 ℃貯藏靜電場處理對大菱鲆貯藏品質(zhì)指標如總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、假單胞菌及菌落總數(shù)等影響。利用GC-IMS技術(shù)測定靜電場處理大菱鲆的揮發(fā)性物質(zhì)組成成分及其相對含量的變化，為大菱鲆風味物質(zhì)的分離鑒定、指紋圖譜的構(gòu)建及風味物質(zhì)的理論研究提供參考。通過電子鼻對不同貯藏時間內(nèi)大菱鲆進行連續(xù)的氣味指紋信息采集，采用不同化學(xué)計量學(xué)方法進行快速統(tǒng)計分析，為大菱鲆貯藏期品質(zhì)檢測提供簡便、實用、快捷、準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大菱鲆購自于山東海鮮大市場，挑選體型較大，同一年齡、新鮮、健康、活躍的大菱鲆，?；钸\至實驗室，暫養(yǎng)24 h后停食，宰殺。去除頭、尾、內(nèi)臟及魚鱗，用蒸餾水沖洗后分割為大小相近、厚薄均勻的魚肉（50±5.0）g，用保鮮膜包裝，置于冷庫（4±0.5）℃貯藏。

1.2 儀器與設(shè)備

F6/10-104-S組織破碎機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；EL204-IC電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；BL-75A高溫滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；RX-2智能型人工氣候培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；MS3 digital渦旋混勻器 德國艾卡設(shè)備有限公司；PL-CJ-2N超級潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Scientz-04無菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；LRH-70培養(yǎng)箱 上海藍豹實驗儀器有限公司；K110F凱氏定氮儀 濟南海能儀器有限公司；FOX4000電子鼻 法國Alpha MOS公司。FlavourSpec 1H1-00053型GC-IMS 德國G.A.S.公司；CTC-PAL自動進樣裝置 瑞士CTC Analytics AG公司；CLOT毛細管柱（30 mm×0.25 mm，0.50 μm） 德國CS Chromatographie Service GmbH公司；77-1型磁力攪拌器 天津賽得利斯儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 靜電場處理

圖1 大菱鲆靜電場處理示意圖Fig. 1 Schematic illustration of the electrostatic field for treating S. maximus

處理大菱鲆的靜電場裝置為實驗室自制，如圖1所示。本實驗采用交流電場（～220 V），經(jīng)圖1中的控制器加到高壓電源上，通過高壓電纜，產(chǎn)生4.0～5.0 kV/m的靜電場；同時可產(chǎn)生較多的臭氧和負離子，將分割完成包裝大菱鲆置于負極平板上，與接地正極板間距為50 cm，對照組置于不通電極板，不用任何靜電場處理。分別于第0、4、6、8、10、12、14天取樣品，測定TVB-N值、菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)、TBA值，利用電子鼻進行氣味指紋分析，并采用GC-IMS對大菱鲆貯藏期間揮發(fā)性風味物質(zhì)進行測定分析。

1.3.2 TVB-N值測定

按照GB/T 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[17]方法測定。

1.3.3 菌落總數(shù)測定

按照GB/T 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[18]方法進行。

1.3.4 假單胞菌測定

采用CFC假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計數(shù)。

1.3.5 TBA值的測定

參照李婷婷等[5]方法。稱取10.0 g攪碎魚肉于燒杯中，加入25 mL蒸餾水和25 mL 10%的三氯乙酸溶液，均質(zhì)，靜置30 min過濾。取5 mL上清液于比色管中，然后方比色皿中加入5 mL的TBA溶液（0.02 mol/L）。將上述混合液在（80±1）℃的恒溫水浴加熱40 min，之后冷卻至室溫，在532 nm波長處測定吸光度。TBA值以丙二醛（malondialdehyde，MDA）質(zhì)量計算，單位為mg/100 g。

1.3.6 電子鼻檢測

稱取2.0 g攪碎的肉樣裝入10 mL樣品瓶，加蓋密封，每個樣品重復(fù)6 次。實驗前先對電子鼻測定參數(shù)進行優(yōu)化，根據(jù)傳感器的響應(yīng)信號，確定電子鼻的測定參數(shù)為：載氣流速150 mL/min，頂空產(chǎn)生溫度40 ℃，進樣體積2 500 μL，進樣速率2 500 μL/s，頂空產(chǎn)生時間600 s，數(shù)據(jù)采集時間120 s，延滯時間400 s。采用主成分分析（principlal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）對樣品進行分析，去除樣品中差異較大的個體。

1.3.7 GC-IMS測定條件

1.3.7.1 頂空進樣條件

頂空孵化溫度45 ℃；孵化時間10.0 min；加熱方式：振蕩加熱；頂空進樣針溫度50 ℃；進樣量500.0 μL，不分流模式；載氣：高純氮氣（純度≥99.999%，推斷和清洗進樣針）；清洗時間0.50 min。

1.3.7.2 GC-IMS條件

色譜柱溫度40 ℃；運行時間15 min；載氣：高純N2（純度≥99.999%）；流速：初始5.0 mL/min，保持10 min后在5 min內(nèi)線性增至150 mL/min。漂移管長度5 cm；管內(nèi)線性電壓400 V/cm；漂移管溫度40 ℃；漂移氣（高純N2，純度≥99.999%）；流速150 mL/min；IMS探測器溫度45 ℃。

1.3.8 檢測方法

取3.0 g樣品，放入20.0 mL頂空進樣瓶中，45 ℃孵化10.0 min，經(jīng)頂空進樣用FlavourSpec?風味分析儀進行測試，經(jīng)G.A.S公司開發(fā)的強大功能軟件分析可給出樣品中揮發(fā)性有機物的差異譜圖；軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫可對物質(zhì)進行定性分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05，差異顯著；運用PCA、LDA對數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果由Origin pro 2016軟件進行繪圖，二維可視化軟件為LAV 2.0（G.A.S. Inc.）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大菱鲆冷藏過程中品質(zhì)指標變化

2.1.1 TVB-N值

圖2 靜電場對大菱鲆中TVB-N值的影響Fig. 2 Time-dependent effect of electrostatic field on TVB-N content in S. maximus

如圖2可知，在貯藏過程中，大菱鲆的TVB-N值不斷升高，貯藏前8 d，靜電場處理組與對照組的TVB-N值變化均較小，兩者無顯著性差異（P＞0.05）。第8天后對照組和靜電場處理組呈快速增長趨勢，根據(jù)我國水產(chǎn)品鮮度的國家標準TVB-N不大于30 mg/100 g[19]為新鮮，對照組貯藏至第10天已超過30 mg/100 g，大菱鲆已呈現(xiàn)明顯腐敗特征，而靜電場處理組至第12天才超過30 mg/100 g，反映出靜電場處理可延緩大菱鲆新鮮度下降。

2.1.2 菌落總數(shù)

菌落總數(shù)指標是判斷魚類新鮮度重要的指標。由圖3可知，整個貯藏期間，大菱鲆菌落總數(shù)整體呈現(xiàn)明顯增長趨勢。靜電場處理組與對照組的增長趨勢大體一致，但對照組的菌落總數(shù)在在貯藏期間始終高于靜電場處理組。根據(jù)GB/T 4789.2—2010規(guī)定的方法測定，當細菌總數(shù)大于6（lg（CFU/g））時，判定肉樣變質(zhì)，對照組在貯藏至第10天后超過6（lg（CFU/g）），而靜電場處理組在第12天后超過6（lg（CFU/g））。對照組在貯藏至第10天后開始腐敗，而靜電場處理組在12 d后腐敗，說明靜電場處理一定程度上抑制微生物生長。

圖3 靜電場對大菱鲆中菌落總數(shù)的影響Fig. 3 Time-dependent effect of electrostatic field on TBC in S. maximus

2.1.3 假單胞菌數(shù)

假單胞菌為大菱鲆冷藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌之一[20]。由圖4可知，隨著大菱鲆貯藏時間延長，假單胞菌呈快速增長趨勢。貯藏前8 d，對照組與靜電場處理組的假單胞菌增長趨勢一致，無顯著性差異（P＞0.05）。而貯藏8 d后，對照組假單胞菌增長速度明顯高于靜電場處理組，靜電場處理組的假單胞菌數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05），說明靜電場可以抑制假單胞菌的生長，其原因可能是假單胞菌為原始生物，體內(nèi)存在與類似微管蛋白功能的物質(zhì)[21]，在電場作用而導(dǎo)致其細胞分裂出現(xiàn)異常。

2.1.4 TBA值

魚肉肌肉組織富含大量不飽和脂肪酸，而不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)物MDA可以與TBA產(chǎn)生穩(wěn)定紅色物質(zhì)，其紅色物質(zhì)在532 nm波長處有最大吸回峰。TBA可以反映出大菱鲆組織肌肉被氧化的程度，TBA值越大，表明魚肉的脂肪氧化程度越高。如圖5所示，貯藏前8 d，靜電場處理組和對照的TBA值增長緩慢；貯藏8 d后，對照組和靜電場處理組的TBA值呈現(xiàn)快速增長趨勢，而靜電場處理組增長速率明顯低于對照組說明靜電場能夠降低脂質(zhì)氧化程度，這與趙良等[22]研究靜電場可以抑制羅非魚的脂肪氧化的結(jié)果一致，但貯藏到第14天時靜電場處理組與對照組并無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 靜電場對大菱鲆中TBA值的影響Fig. 5 Time-dependent effect of electrostatic field on TBA value in S. maximus

2.2 大菱鲆電子鼻傳感器響應(yīng)值分析

LDA是利用已知類別的樣品建立判別模型，為未知類別的樣本判別的一種統(tǒng)計方法[23]。圖6為貯藏期間大菱鲆電子鼻響應(yīng)值的LDA結(jié)果，LD1和LD2的貢獻率分別為70.53%和24.47%，兩者累計貢獻率為95.00%。說明這兩個主成分基本上可以反映出大菱鲆所有的特征信息。LDA可將不同貯藏時間下靜電場處理組和對照組的大菱鲆區(qū)分開，且沒有重疊區(qū)域。

圖6 貯藏期間大菱鲆電子鼻響應(yīng)值信號的LDAFig. 6 LDA plot of e-nose sensor signals for S. maximus during storage

圖7 貯藏期間大菱鲆電子鼻響應(yīng)值信號的PCAFig. 7 PCA plot of e-nose sensor signals for S. maximus during storage

PCA是將多個指標通過降維轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾項具有代表性的綜合指標的一種多元統(tǒng)計分析方法[24]。通常認為累計貢獻率超過80%，表明基本包含樣品的信息。PC1和PC2的貢獻率分別為98.27%和1.17%，兩者累計貢獻率為99.44%。說明這兩個主成分基本上可以反映出大菱鲆所有的特征。從圖7可以看出，PCA可將不同貯藏時間下對照組和靜電場處理組的大菱鲆品質(zhì)區(qū)分開，且沒有重疊區(qū)域。

2.3 靜電場處理二維譜圖分析

圖8 大菱鲆的GC-IMSFig. 8 GC-IMS profiles of S. maximus

圖8 為靜電場處理和對照組大菱鲆揮發(fā)性物質(zhì)的組分差異變化，第0天大菱鲆樣品為參比，以便觀察不同貯藏時間大菱鲆揮發(fā)性物質(zhì)與參比樣品之間的差異。反應(yīng)離子峰右側(cè)的每一個點代表一種揮發(fā)性有機物，藍色為背景，紅色代表物質(zhì)成分，顏色越深表示含量越高。從圖8可以看出，不同處理方法及不同貯藏時間內(nèi)揮發(fā)性組分可通過GC-IMS技術(shù)很好地分離，且可直觀看出不同貯藏時間段的揮發(fā)性物質(zhì)差異，根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)氣相色譜保留時間和離子遷移時間對揮發(fā)性組分進行定性分析。大菱鲆貯藏過程中，共計檢測出66 種揮發(fā)性物質(zhì)，通過內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S的IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫進行二維定性，確定了28 種具體揮發(fā)性物質(zhì)組成（表1）。為更加方便地對比不同樣品間揮發(fā)性有機物的差異，LAV軟件的Gallery Plot插件可選取圖中所有的待分析區(qū)域，自動生成指紋圖譜。

由圖9可知，將對照組處理大菱鲆指紋圖譜分成A、B、C、D、E 5 個區(qū)域，區(qū)域A標出的物質(zhì)在新鮮大菱鲆中含量最高，隨著貯藏時間的延長，A區(qū)此類物質(zhì)比如3-甲基丁醇、戊醛、苯乙醛、異丁烯等物質(zhì)消失。區(qū)域B為大菱鲆貯藏6 d后出現(xiàn)的揮發(fā)性物質(zhì)，C區(qū)域為存放10 d時出現(xiàn)苯甲醛、環(huán)己酮等特殊揮發(fā)性物質(zhì)，區(qū)域D標出的物質(zhì)在存放14 d中存在，14 d之前的樣品中含量較少，例如2,3-丁二酮（飯膄味）此類物質(zhì)的存在與否可判斷大菱鲆的貯藏時間；區(qū)域E中標出的物質(zhì)在存放10 d后開始出現(xiàn)，例如2-庚酮、乙酸異丙酯、異戊酸乙酯、1-戊醇等隨著貯藏時間延長而增加。A區(qū)域標注的物質(zhì)在存放5 d的大菱鲆中含量很少，而2,3-戊二酮、2-戊酮、2-甲基丁酸甲酯、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醛、丁酸乙酯、2-庚酮等此類物質(zhì)在新鮮的大菱鲆中及存放10 d后的大菱鲆中均存在，具體原因有待進一步研究。

表1 大菱鲆揮發(fā)性組分的定性Table 1 Volatile compounds of S. maximus identi fied by GC-IMS

圖9 對照組大菱鲆不同貯藏時間指紋圖譜Fig. 9 Fingerprint profiles of control group at different storage times

圖10 靜電場處理下大菱鲆的指紋圖譜Fig. 10 Fingerprints of electrostatic field-treated group at different storage times

由圖10可知，將靜電場處理大菱鲆指紋圖譜分成A、B、C 3 個區(qū)域，區(qū)域A中標出的物質(zhì)在新鮮大菱鲆中存在，貯藏6 d后區(qū)域A類揮發(fā)性有機物如1-辛烯-3-醇、苯乙醇、苯乙醛等，僅有苯乙醛尚可檢測出其含量。區(qū)域B中標出的物質(zhì)如正己醇、2-丁酮等僅在貯藏中5 d時生成，貯藏10 d后B區(qū)域的物質(zhì)消失。C中標出的物質(zhì)如環(huán)己酮、苯甲醛、丁酸乙酯等中存放10 d后含量最高，通過此類物質(zhì)可判斷大菱鲆大致貯藏時間。C區(qū)域揮發(fā)性物質(zhì)如3-甲硫基丙醛、正戊醛、3-甲基-1-丁醇、1-戊醇、正己醛、甲基丙基甲酮、2,3-戊二酮等在靜電場中存放10 d及14 d后此類物質(zhì)含量極劇減少此類物質(zhì)的存在及含量可用于判斷大菱鲆在靜電場中的存放時間，區(qū)域B中標出的物質(zhì)在存放10 d的大菱鲆樣品中含量最少，在存放14 d的樣品中含量最高。

圖11 不同處理處理下大菱鲆的指紋圖譜Fig. 11 Fingerprints of S. maximus with different treatments

如圖11可知，揮發(fā)性有機物如2-丁酮、正己醇、環(huán)己酮、2-甲基丁酸甲酯、乙酸異丙酯、1-戊醇、苯甲醛、甲基丙基甲酮、2,3-戊二酮等在對照組中含量最高，而在靜電場中處理的樣品此類物質(zhì)含量很少，即不同處理方式的樣品揮發(fā)性有機物的種類不同。通過對照組及靜電場處理的對比可知，相同的存放時間下，靜電場中大菱鲆中揮發(fā)性有機物的種類和含量明顯少于對照組中，即驗證了靜電場了延長大菱鲆的貨架期。

3 討 論

新鮮魚肉變質(zhì)腐敗主要是優(yōu)勢腐敗菌大量活動繁殖造成[25]，采用靜電場處理的魚肉后與對照組相比，表現(xiàn)出更好的貯藏效果，可將菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)、TBA值和TVB-N值維持相對較低的水準。這與岑劍偉等[9]研究高壓靜電場對延長羅非魚片的貨架期和陳文波等[26]研究靜電場可抑制白切雞的微生物結(jié)果一致。靜電場可能通過改變微生物體內(nèi)生命大分子電荷分布，影響其體內(nèi)酶的活性，進而影響酶與底物的接觸反應(yīng)，從而影響微生物細胞的正常代謝活動[27-28]。靜電場雖可以抑制優(yōu)勢腐菌的生長，減緩微生物的生長速率，降低微生物對魚肉的破壞，在一定程度上，延長了大菱鲆魚肉的貨架期，但不能徹底殺死微生物，大菱鲆貯藏后期，微生物依舊大量繁殖致使大菱鲆腐敗。

目前，測定樣品中揮發(fā)性物質(zhì)常用的檢測是采用氣相色譜-質(zhì)譜或者頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定，該方法需要破壞原始樣品進行前處理，通過譜圖庫檢索對應(yīng)峰進行定性，計算峰面積進行定量，但碎片離子導(dǎo)致的解譜困難，不能做到快速無損檢測。而GC-IMS技術(shù)結(jié)合氣相色譜的分離能力和離子遷移譜快速響應(yīng)、高靈敏度的優(yōu)勢，具有操作簡單、快速無損以及重復(fù)性好等特點。而且無需樣品前處理且分析的溫度遠低于相傳統(tǒng)的氣相色譜-質(zhì)譜法，GC-IMS法測得揮發(fā)性物質(zhì)更真實反映貯藏環(huán)境的樣品的揮發(fā)性物質(zhì)[29-31]。本研究采用GC-IMS技術(shù)對靜電場處理和對照組不同貯藏時間大菱鲆的揮發(fā)性物質(zhì)檢測，檢測結(jié)果很直觀展現(xiàn)出采用靜電場處理與對照組的大菱鲆在貯藏過程中產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的差異?？梢钥闯鰮]發(fā)性有機物如1-辛烯-3-醇、苯乙醇、苯乙醛，只存在于貯藏前6 d，可用于判斷大菱鲆在靜電場中的貯藏時間。貯藏到第14天時，靜電場處理的魚肉揮發(fā)性物質(zhì)明顯少于對照組，原因可能是靜電場抑制微生物分解為肌肉中蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)。大菱鲆貯藏過程中，共計檢測出66 種揮發(fā)性物質(zhì)，GC-IMS檢測出的66 種物質(zhì)均可以提供保留指數(shù)，GC-IMS定性依據(jù)是基于GC-MS數(shù)據(jù)庫，即使用氣相保留指數(shù)和離子遷移時間進行二維定性。但由于目前IMS數(shù)據(jù)庫在水產(chǎn)領(lǐng)域的數(shù)據(jù)庫還不完善，66 種化合物中只有28 種揮發(fā)性有機物有遷移時間，故二維定性只能給出28 種物質(zhì)的定性結(jié)果。定性剩余38 種揮發(fā)性物質(zhì)，有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

靜電場保鮮技術(shù)可有效延長大菱鲆的貨架期，可抑制大菱鲆菌落總數(shù)和優(yōu)勢腐敗菌（假單胞菌）生長繁殖，降低TVB-N和TBA產(chǎn)生，使其維持在較低水平。通過GC-IMS技術(shù)可以快速檢測不同方法處理大菱鲆產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)。利用電子鼻對大菱鲆連續(xù)的指紋信息采集，結(jié)合PCA和LDA化學(xué)計量學(xué)方法處理，可以將不同貯藏時間下靜電場處理與對照組樣品區(qū)分開。說明GC-IMS和電子鼻都可用于大菱鲆品質(zhì)快速檢測。本實驗雖然研究了靜電場對貯藏過程大菱鲆魚肉新鮮度的影響，但對其產(chǎn)生作用機理和靜電場對大菱鲆營養(yǎng)品質(zhì)是否產(chǎn)生影響都未進行深入細致分析，需要后續(xù)進一步深入研究。