啤酒釀造中二甲基硫、甲基蛋氨酸、二甲基亞砜含量的變化與控制

劉 成，杜金華*，鮑 姣

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰發(fā) 271018；2.山東泰山啤酒有限公司，山東 泰發(fā) 271000）

二甲基硫（dimethyl sulfide，DMS），又名二甲基硫醚，在自然界中普遍存在，是最重要的揮發(fā)性硫化物，它是海洋溫度高低自動調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)。DMS是GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[1]中規(guī)定的允許使用的食用香料，主要用于配制玉米、番茄、土豆、奶制品、菠蘿和橘子類果香及青香型香精。適度的DMS含量對啤酒風(fēng)味有益，但過量會對啤酒風(fēng)味產(chǎn)生不良影響。DMS在水中的閾值為30 μg/L，不同啤酒中的閾值會因啤酒種類不同也有所不同，大多釀酒師認為閾值為30～60 μg/L[2-3]?？刂破【浦蠨MS質(zhì)量濃度在60 μg/L以下被國際釀酒師所接受[4-5]，過量的DMS會導(dǎo)致啤酒有一種“生酒味”、“菜味”、“煮玉米味”、“甜麥芽味”或者“黑醋栗芽苞”的味道[6]。另外DMS有一定毒性，低濃度的DMS會引起頭痛、惡心和嘔吐，高濃度DMS會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有麻痹作用。

上世紀80年代，國外對啤酒中DMS展開研究，結(jié)果表明啤酒中的DMS有兩個重要來源：1）大麥胚萌發(fā)過程中產(chǎn)生的甲基蛋氨酸（S-methylmethionine，SMM）熱分解所得；2）酵母還原二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）得到DMS[3,7-9]。第1個途徑主要發(fā)生在麥芽焙焦過程與麥汁煮沸過程中，第2個途徑主要發(fā)生在發(fā)酵過程中。將SMM與DMSO統(tǒng)稱為二甲基硫前驅(qū)體（dimethyl sulfide precursor，DMSP）。根據(jù)DMS的產(chǎn)生源頭，控制啤酒中DMS含量主要通過兩個途徑[10]：1）通過選擇低DMS前驅(qū)物含量的麥芽種類，控制煮沸時間、麥汁pH值與煮沸后高溫等待時間調(diào)控SMM方DMS的轉(zhuǎn)化；2）優(yōu)選酵母菌株、調(diào)整麥汁濃度、氨基氮含量以及發(fā)酵罐類型、發(fā)酵溫度調(diào)控DMSO還原為DMS的含量。

國內(nèi)學(xué)者對啤酒中DMS含量的影響因素也進行了相應(yīng)研究。溫科[11]研究發(fā)現(xiàn)在制麥過程中添加赤霉素和溴酸鉀可對DMS及DMSP表現(xiàn)出不同的抑制作用。王芝梅[12]研究表明國產(chǎn)大麥的SMM含量高于Cervoise大麥，制麥過程中發(fā)芽及干燥初期麥粒中的SMM含量處于增長的趨勢。房慧婧等[13]對糖化煮沸及沉淀過程中DMS、SMM含量進行了研究，結(jié)果表明麥汁中的游離DMS在煮沸過程可降至最低，但澄清、冷卻階段又重新升高，SMM含量在麥汁制備過程中一直呈下降趨勢。王德良等[14]研究了發(fā)酵過程中發(fā)酵液的DMS含量的影響因素，發(fā)酵溫度、酵母代數(shù)、有害微生物對發(fā)酵液DMS含量有顯著影響。

在國外，Sinclair等[15]和Bamforth[16]證明全麥芽的Lager啤酒中DMS含量高于Ale啤酒。這是由于Ale啤酒的麥芽焙焦溫度比Lager啤酒的麥芽焙焦溫度高，SMM熱分解更為徹底[10]。但國內(nèi)學(xué)者唐朝艷[17]抽取市場5 個啤酒樣品，DMS質(zhì)量濃度在21～29 μg/L，含量均低于閾值。國內(nèi)市場大多的Lager啤酒由于添加了大米、糖漿、淀粉等輔料，反而使得Lager啤酒中的DMS含量大多在閾值以下。然而近年來，由于國內(nèi)的消費升級，全麥芽的特色啤酒越來越受歡迎，啤酒使用全麥芽作為原料后容易導(dǎo)致DMS含量升高，甚至超出風(fēng)味閾值，因此DMS含量變成了國內(nèi)釀酒師釀造全麥啤酒時越來越受重視的一個重要風(fēng)味指標。

本研究抽取國內(nèi)15 個商品啤酒樣品，對其DMS含量進行檢測分析，對釀造過程中麥芽、麥汁、發(fā)酵液的DMS、SMM、DMSO含量變化過程進行詳細研究，同時對啤酒生產(chǎn)過程中的DMS含量控制方法進行探討。本實驗對研究全麥啤酒釀造過程中DMS含量的上升原因、控制成品啤酒的DMS含量有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

偏重亞硫酸鈉（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲基乙基硫醚（＞96.0%）、DMS（＞99.7%）阿拉丁試劑有限公司；麥芽為隨機抽取市售10 種樣品，啤酒為隨機抽取市售15 種啤酒樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

Clarus 500 GC氣相色譜儀 美國PerkinElmer公司；DMA4500全自動啤酒分析儀 奧地利發(fā)東帕商貿(mào)有限公司；LXJ-IIB飛鴿離心機 上海發(fā)亭科學(xué)儀器廠；Buhler DLFU麥芽研磨機 麥科儀（北京）科技有限公司；Stomboil煮沸鍋 德國克朗斯股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

麥芽處理參照Baldus[18]與Yang[19]等的方法。稱取20.00 g麥芽（麥芽于4 ℃冰箱預(yù)冷12 h）于研磨機研磨得到麥芽粉于密封袋暫存。稱取10.00 g研磨好的麥芽粉轉(zhuǎn)移至250 mL碘量瓶，加入100 mL蒸餾水搖勻，室溫下振蕩搖勻35 min后轉(zhuǎn)移至離心管（氮氣排空10 s）中，50 000 r/min離心5 min，上清液加蓋濾紙快速過濾，濾液用于樣品檢測。

麥汁取樣后立即密封冷卻至4 ℃，用單層濾紙加蓋快速過濾后用于樣品檢測。啤酒樣品冷卻至4 ℃后直接進行檢測。

1.3.2 麥汁煮沸

麥汁煮沸在帶內(nèi)加熱器的Stom boil煮沸鍋內(nèi)完成，煮沸過程中不同時間麥汁溫度、蒸汽耗用數(shù)據(jù)見表1。

表1 煮沸過程溫度、蒸汽壓力及蒸汽耗用數(shù)據(jù)Table 1 Temperature, steam pressure and steam consumption during the boiling process

1.3.3 DMS、SMM、DMSO的氣相色譜-氫火焰離子化檢測

DMS、SMM檢測參考ASBC分析方法《頂空氣相色譜法測定二甲基硫前體物質(zhì)含量》[20]。DMSO檢測參考Baldus分析方法[18,21]，氮吹清除游離DMS。

色譜柱：DB-WAX（0.53 mm×30 m，1.0 μm）；升溫程序：37 ℃保持2.3 min，以10 ℃/min升至60 ℃，20 ℃/min升至120 ℃，30 ℃/min升至220 ℃，保持1 min；氫火焰離子化檢測器，溫度230 ℃，載氣N2，流速8 mL/min，進樣時間0.05 min。

1.3.4 三角瓶發(fā)酵實驗

發(fā)酵實驗在2 L三角瓶內(nèi)進行，麥汁麥芽配比為60%大麥芽與40%小麥芽，麥汁濃度為10.2 °P，麥汁量為1 L，上面酵母接種，接種量為2×106CFU/mL，發(fā)酵溫度為25 ℃，常壓發(fā)酵。

1.3.5 大罐發(fā)酵實驗

接種麥汁麥芽配比為60%大麥芽與40%小麥芽，麥汁濃度為12.2 °P，滿罐麥汁總量400 m3，上面酵母接種，接種量為2×106CFU/mL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復(fù)3 次，用SPSS Statistics 22.0、Excel 2010統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 15 種市售啤酒的DMS含量

表2 市售啤酒樣品的DMS含量Table 2 DMS contents of commercial beer samples

抽取國內(nèi)15 個啤酒樣品進行DMS含量檢測，結(jié)果見表2。由結(jié)果得知，不同樣品DMS含量差別較大，波動范圍為20～105 μg/kg，與Liu Chunfeng等[22]檢測14 種國內(nèi)啤酒樣品DMS含量結(jié)果49～102 μg/kg相近，同時Liu Chunfeng等[22]研究還得出國內(nèi)DMS含量較低的啤酒更受歡迎的結(jié)論。本實驗中15 個樣品中有7 個樣品超出閾值（60 μg/kg），品評部分有生青味，占總體抽檢樣品比例的47%，運用SPSS對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明啤酒DMS含量與啤酒類型之間呈顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)0.538（P＜0.05），其中Lager啤酒中有25%超出閾值，Ale啤酒中有71%超出閾值。因此DMS含量應(yīng)該是國內(nèi)釀酒師關(guān)注的指標，特別是生產(chǎn)全麥芽的Ale啤酒。抽檢樣品中，8 個Lager啤酒樣品DMS平均含量為46 μg/kg，7 個Ale啤酒樣品DMS平均含量為72 μg/kg，Ale啤酒的DMS含量高于Lager啤酒，這與國外檢測結(jié)果相反。國外檢測Lager啤酒DMS含量高于Ale啤酒，其原因是在麥芽焙焦過程中，溫度升高，SMM的總量減少，Ale啤酒麥芽的焙焦溫度比Lager啤酒的麥芽焙焦溫度高，SMM熱分解更為徹底，麥汁中產(chǎn)生的DMS含量低于Ale啤酒，同時Ale啤酒一般采用高溫發(fā)酵，導(dǎo)致最終Ale啤酒DMS含量低于Lager啤酒[10]。而在國內(nèi)Lager啤酒麥汁原濃大多比Ale啤酒原濃低，且多數(shù)Ale啤酒使用全麥芽作為原料，未添加糖漿大米等輔料或添加比例較低。White[23]與孫軍勇[24]等檢測國內(nèi)大米、糖漿輔料中不含有或含有極少量的DMS及DMSP，從而降低了成品Lager啤酒中DMS的含量，因此檢測國內(nèi)樣品中Ale啤酒的DMS含量高于Lager啤酒。

2.2 市售麥芽DMS、SMM、DMSO含量

表3 市售不同麥芽樣品的DMS、SMM、DMSO檢測結(jié)果Table 3 DMS, SMM and DMSO contents of malts μg/g

抽取國內(nèi)市場4 個廠家6 種澳麥芽品種、4 種國產(chǎn)小麥芽，檢測DMS、SMM、DMSO含量。從表3中可以看出，澳麥芽DMS含量在1.55～4.03 μg/g范圍內(nèi)波動，這與Dickknson[25]測定的英國Lager麥芽與White等[26]測定的英國Julia Lager麥芽含量范圍相符，但溫科[11]制麥過程中的檢測數(shù)據(jù)差別較大，與唐朝艷[17]的檢測結(jié)果（0.15～1.36 μg/g）相近。Dickknson[25]測定的英國Lager麥芽DMS與SMM含量高于Ale麥芽，而DMSO含量Lager麥芽低于Ale麥芽，這與麥芽的焙焦溫度、含氮量有關(guān)[10,19,27]。實驗中6 個澳麥芽之間DMS含量波動較大，澳麥芽5是澳麥芽2的2.6 倍，澳麥芽6的SMM含量也達到澳麥芽2的2.09 倍。運用SPSS對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明麥芽SMM含量及DMSO含量與麥芽類型之間呈顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.420（P＜0.01）、0.831（P＜0.01）。而啤酒中的DMS含量主要受麥芽中SMM與DMSO含量影響較大[24]，因此同一生產(chǎn)工藝選用不同品種麥芽可造成定型麥汁DMS含量偏差較大，釀酒師在糖化生產(chǎn)前需特別關(guān)注大麥芽中的DMSO與SMM含量，根據(jù)含量不同調(diào)整糖化的生產(chǎn)工藝。美國、加拿大部分啤酒廠也已經(jīng)把麥芽中DMS相關(guān)指標納入標準，成品麥芽總DMS含量小于2 μg/g。除小麥芽4外其余麥芽DMS、SMM、DMSO含量均比澳麥芽含量低，所以選用合適的小麥芽品種、適當提高小麥配比可以降低定型麥汁的DMS含量。

2.3 煮沸時間對DMS、SMM、DMSO影響

圖1 煮沸時間對麥汁DMS與SMM含量影響Fig. 1 Effect of boiling time on the contents of DMS and SMM in wort

圖2 麥汁煮沸前后DMSO含量對比Fig. 2 Comparison of DMSO content of wort before and after boiling

研究10.2 °P麥汁在Stormboil煮沸鍋中煮沸過程的DMS及SMM含量變化，如圖1所示。煮沸的初始麥汁量為104.3 t，結(jié)束麥汁量為99.9 t，煮沸強度為4.2%，煮沸過程中未添加任何水，煮沸過程麥汁pH值控制在5.6，煮沸結(jié)束時調(diào)整pH值至5.5左右。從圖1可以看出，DMS在前40 min內(nèi)有一個快速的降低過程，40 min時達到30 μg/kg，降低92%，隨后的20 min內(nèi)降低速度減緩，整個過程中DMS降低速率遠高于麥汁蒸發(fā)率，因為麥汁蒸發(fā)對DMS與SMM含量升高的影響可以忽略。DMS降低主要是因為DMS沸點只有38 ℃，在100 ℃高溫情況下會快速蒸發(fā)，再加上Stormboil采用強制循環(huán)、增加麥汁揮發(fā)面積的煮沸方式，能夠保證DMS的揮發(fā)速度大于SMM分解速度，從而起到快速降低麥汁中DMS的含量。

根據(jù)Scheuren等[3]的研究，SMM熱分解符合提出的一級動力學(xué)反應(yīng)Ct＝C0e-kt，Ct為SMM隨時間變化的瞬時濃度，C0為初始濃度，參數(shù)k描述了與溫度有關(guān)的反應(yīng)速度。半衰期時間還與實際生產(chǎn)過程中麥汁煮沸時的壓力有關(guān)[26-28]，實驗在Stormboil煮沸鍋中進行，煮沸過程中鍋內(nèi)壓力為1 個大氣壓。運用Excel對圖1中SMM含量在0～60 min內(nèi)分解曲線進行模擬，趨勢線指數(shù)函數(shù)為Ct=440.07e-0.023t（R2=0.990 7），此模型中模擬了SMM濃度與加熱時間的關(guān)系，與Scheuren等[3]的一級動力學(xué)反應(yīng)相符，由此可以計算SMM在100 ℃、pH 5.6時半衰期為31 min，與Dickenson[29]研究SMM在98.5 ℃的半衰期為30.5 min相符。

圖2中DMSO含量煮沸開始至煮沸60 min結(jié)束增加了83%，說明煮沸過程中部分從DMS被氧化為DMSO。

2.4 麥汁沉淀過程DMS、SMM、DMSO含量變化

圖3 麥汁煮沸結(jié)束至過料結(jié)束不同時間下DMS與SMM含量變化Fig. 3 Trends of DMS and SMM contents in boiled wort during precipitation

如圖3所示，隨著在高溫區(qū)保留時間延長，SMM不斷減少，DMS含量不斷增加。煮沸結(jié)束至過料結(jié)束，麥汁溫度始終保持在98 ℃以上，SMM在高于70 ℃溫度下會繼續(xù)熱分解產(chǎn)生DMS[30]，而沉淀槽中的麥汁揮發(fā)面積較小，DMS被保留在麥汁中，導(dǎo)致DMS含量繼續(xù)上升。SMM含量從煮沸結(jié)束至過料結(jié)束降低54 μg/kg，DMS增加量為40 μg/kg，74%的熱分解產(chǎn)生的DMS被麥汁溶解。

圖4 麥汁煮沸結(jié)束與沉淀結(jié)束DMSO含量對比Fig. 4 Comparison of DMSO content of wort after boiling and precipitation

如圖4所示，在沉淀槽內(nèi)停留40 min后DMSO只有小幅增加，總含量只增加了5%，沉淀過程中DMS少量被氧化。

2.5 三角瓶發(fā)酵過程DMS、SMM、DMSO含量變化

實驗室內(nèi)用高SMM含量的麥汁作為接種麥汁，添加上面酵母在三角瓶內(nèi)進行常壓發(fā)酵，研究酵母發(fā)酵過程的DMS、SMM、DMSO含量，結(jié)果如圖5所示。在常壓下啤酒中的DMS隨發(fā)酵產(chǎn)生的CO2散失，而SMM被酵母作為氮源消耗，但是未見發(fā)酵液中DMS有明顯上升，這由于SMM被酵母代謝而未產(chǎn)生活性DMS，這與Scheuren等[8]描述相符。DMSO含量在發(fā)酵第3天時有明顯的上升趨勢，這可能與DMS被氧化有關(guān)。文獻[19,31]報道DMSO是啤酒中DMS的重要前驅(qū)物，Sugai等[32]研究發(fā)現(xiàn)在Lager酵母與Ale酵母中均能產(chǎn)生蛋氨酸亞砜還原酶，將DMSO還原為游離DMS，但兩種酶的活性差別較大，不同的酵母菌株有不同的還原能力，而且酵母可利用氮源較少時DMSO被還原的量增多，發(fā)酵溫度低比發(fā)酵溫度高時酵母還原DMSO的量多[33-35]。實驗中該酵母菌株未能將麥汁中的DMSO大量還原，這與實驗用酵母菌種、麥汁氨基氮含量較高、上面發(fā)酵溫度有關(guān)。

圖5 三角瓶發(fā)酵過程DMS、SMM、DMSO含量變化Fig. 5 Trends of DMS, SMM and DMSO contents during fermentation

2.6 400 t發(fā)酵罐發(fā)酵過程DMS、SMM、DMSO含量變化

圖6 400 t發(fā)酵罐發(fā)酵過程DMS含量與糖度變化Fig. 6 Trends of DMS content and gravity during fermentation in 400-t fermenter

如圖6所示，1～2 d為麥汁滿罐過程，前2 d滿罐后DMS含量有上升趨勢，2 d時達到最高值，為73 μg/kg。2 d后酵母進入?yún)捬醢l(fā)酵，糖度由11.6 °P快速降低為7.7 °P，發(fā)酵進入旺盛期，DMS隨著CO2產(chǎn)生而揮發(fā)，下降速度較快，3 d時達到DMS最低值為43 μg/kg，為最高值的59%。Hansen等[35-36]報道61%～72%麥汁DMS都被發(fā)酵過程中的CO2洗滌排出罐外。3～7.5 d后隨著糖度下降速度降低而趨于穩(wěn)定。7.5 d后開始降溫后貯，發(fā)酵后貯過程中DMS含量有升高趨勢，啤酒降溫后DMS溶解增高。釀酒師為了控制啤酒DMS含量，可以在發(fā)酵過程中適當推遲封罐時間，讓DMS隨之CO2而排出。

圖7 400 t發(fā)酵罐發(fā)酵過程SMM、DMSO含量變化Fig. 7 Trends of DMSO and SMM contents during fermentation in 400-t fermenter

如圖7所示，SMM含量在發(fā)酵初期有明顯的下降趨勢，這與本實驗室得出的結(jié)論相符，部分硫甲基蛋氨酸被酵母代謝消耗，較峰值降低65%左右。DMSO含量前3 d穩(wěn)定，這于Baldus等[7]研究相符，發(fā)酵期間前3 d DMSO含量穩(wěn)定，3 d后少量的DMSO被還原為DMS，Baldus等[7]研究中第7天時6%的DMSO被還原，而這種還原受到限制，由于麥汁中存在著高濃度的蛋氨酸氧化硫，它是DMSO還原的強烈抑制劑。本實驗3 d后觀察到DMSO含量有升高趨勢，其原因需要進一步驗證。

3 結(jié) 論

DMS是啤酒中的重要風(fēng)味指標，但GB 4927—2008《啤酒》[37]中未進行強制要求。本研究檢測國內(nèi)市場上常見的15 種啤酒樣品的DMS含量，其中47%的抽檢樣品DMS含量超出60 μg/kg，因此DMS應(yīng)該是國內(nèi)釀酒師重點關(guān)注的指標，特別是國內(nèi)全麥芽的Ale啤酒。

實驗對國內(nèi)市場10 個麥芽樣品的DMS及DMSP進行檢測，不同麥芽間DMS與DMSP差異較大，多數(shù)小麥芽的DMS與DMSP含量較澳麥芽低，因此釀酒師選用合適的小麥芽品種、適當提高小麥配比利于降低啤酒中的DMS含量。實驗研究了麥汁煮沸及沉淀過程中的DMS及DMSP含量的變化，麥汁在100 ℃、pH 5.6時，煮沸0～40 min階段DMS含量降低較快，40 min時達到30 μg/kg，SMM的半衰期為31 min，SMM分解動力學(xué)和DMS的揮發(fā)性可以用來計算和預(yù)測麥汁中DMS含量，是優(yōu)化麥汁生產(chǎn)的有效工具，這給啤酒釀造師制定糖化工藝提供了理論依據(jù)。研究發(fā)酵過程中的DMS及DMSP含量變化，結(jié)果表明DMS在發(fā)酵旺盛期時有明顯的下降趨勢，麥汁中65%的SMM被酵母利用，釀酒師在控制DMS含量時可考慮適當延長發(fā)酵封罐時間，使更多的DMS排出罐外。