創(chuàng)傷性腦損傷影響骨折愈合速度的機(jī)制

趙小綱　趙光鋒　陳毅軍　馬岳峰　徐少文　江觀玉

【摘要】目的探討創(chuàng)傷性腦損傷影響骨折愈合速度的可能機(jī)制。方法采用創(chuàng)傷性腦損傷合并一側(cè)脛骨骨折(A組)制作多發(fā)傷模型，不同時點觀察FOS、JUN、bFGF、VEGF表達(dá)并與B組(單純一側(cè)脛骨骨折)比較，x線觀察骨折愈合情況。結(jié)果正常小鼠腦組織FOS、JUN、bFGF、VEGF低水平表達(dá)，B組略強(qiáng)。A組腦組織FOS和JUN的表達(dá)具有時程的一致性，創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后3 h達(dá)到高峰，12 h以后降至對照水平；bFGF與VEGF分別于創(chuàng)傷性腦損傷后12 h、24 h達(dá)到高峰，72 h降至對照水平。兩組骨折位點FOS、JUN表達(dá)均于6 h達(dá)峰值，24 h后降至對照水平。3 h、6 h、12 h組間比較差異有顯著性。A組骨折位點bFGF、VEGF表達(dá)分別于12 h、24 h達(dá)峰值，B組于24 h、48 h達(dá)峰值，均持續(xù)表達(dá)96 h以上。Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，A組腦挫傷灶周圍腦組織FOS蛋白與bFGF表達(dá)、bFGF與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.896、0.832(P＜0.05)；A組骨折位點FOS蛋白與bFGF表達(dá)、bFGF與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.938、0.945(P＜0.05)；B組骨折位點FOS蛋白與bFGF表達(dá)、bFGF與VEGF蛋白表達(dá)也呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.833、0.914(P＜0.05)；兩組腦組織FOS、JUN蛋白與骨折位點FOS、JUN表達(dá)的關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)意義。影像學(xué)上A組在術(shù)后第三周時已接近全部愈合，B組到第4周時才全部愈合。結(jié)論創(chuàng)傷性腦損傷合并長骨骨折是比較理想的多發(fā)傷實驗動物模型；創(chuàng)傷性腦損傷后骨折位點bFGF、VEGF表達(dá)更早更強(qiáng)，促進(jìn)成骨。

【關(guān)鍵詞】創(chuàng)傷性腦損傷；骨折愈合；即刻早期基因；生長因子

在多發(fā)傷救治中觀察到骨折合并腦外傷患者骨痂過度生長，甚至在肌肉中出現(xiàn)異位骨化，骨折愈合明顯加快，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。骨折愈合過程中有許多生長因子的參與，這是骨折愈合的基礎(chǔ)。創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)時通過何種機(jī)制影響生長因子表達(dá)水平的改變從而影響骨折愈合速度，值得深入研究。

1材料與方法

1．1實驗材料

1．1．1實驗動物ICR小鼠118只，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，體重20 g左右，清潔級，在安靜、無強(qiáng)刺激、室溫下飼養(yǎng)24 h以上。

1．1．2主要試劑VEGF、bFGF免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，c-los與c-jun癌基因蛋白免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。自備試劑，DAB顯色試劑盒等。

1．2動物模型及分組

ICR小鼠隨機(jī)分為兩組：A組TBI合并一側(cè)脛骨骨折；B組單純一側(cè)脛骨骨折。TBI參照Queen等腦自由落體撞擊模型用直徑5 mm墊片代替圓錐預(yù)置改良制作，小鼠脛骨骨折參照Hiltunen等方法進(jìn)行，事先以克氏針做髓內(nèi)固定。分別于造模后1、3、6、12、24、48、72、96 h快速斷頭處死小鼠各6只，取致傷側(cè)大腦半球固定。同時截取骨折端周圍長約1 cm左右骨膜、肌肉組織固定過夜。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片備用。正常對照6只。余下動物(A組7只、B組9只)分別于1、2、3、4周時行x線攝片，曝光條件：40 kV，5 mAs，觀察骨折愈合情況。

1．3FOS、JUN與bFGF、VEGF檢測

SP法檢測腦組織與骨折位點FOS、JUN、bFGF、VEGF表達(dá)，按免疫組化試劑盒操作步驟進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。每張切片隨機(jī)選取10個40×10倍的光鏡視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)／100個細(xì)胞，取其均值作為該切片的陽性細(xì)胞數(shù)。

1．4統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)或原始數(shù)組的百分比來表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。均值間差異采用多個均數(shù)間兩兩比較的SNK q檢驗，部分?jǐn)?shù)據(jù)行Spearman等級相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1骨折愈合情況比較

從影像學(xué)上觀察，A組在1、2、3、4周時的愈合比例分別為0／7、2／7、6／7、7／7，B組分別為0／9、0／8、2／7、7／7。A組骨痂量比B組略顯豐富。

2．2腦組織FO$、JUN、bFGF、VEGF蛋白的表達(dá)

正常小鼠低水平表達(dá)，F(xiàn)OS、JUN陽性表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞的胞核上，bFGF、VEGF陽性染色以胞漿為主，呈棕黃色顆粒。

2．2．1腦組織FOS、JUN蛋白的表達(dá)A組3 h達(dá)到高峰，12 h以后降至對照水平，F(xiàn)OS和JUN的表達(dá)具有時程的一致性。統(tǒng)計學(xué)分析表明，A組1、3、6 h與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。該3個時相組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組表達(dá)比對照組略強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2．2．2腦組織bFGF的表達(dá)A組12 h染色反應(yīng)最為強(qiáng)烈，72 h降至對照水平。統(tǒng)計學(xué)分析表明，A組1、3、6、12、24、48 h與對照組比較差異具有顯著性(P＜0.05)。該6個時相組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組低水平表達(dá)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2．2．3腦組織VEGF蛋白的表達(dá)A組TBI后24 h達(dá)到高峰，72 h降至對照水平。統(tǒng)計學(xué)分析表明，A組6、12、24、48 h與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。該4個時相組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組低水平表達(dá)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2．3骨折位點FOS、JUN、bFGF、VEGF的表達(dá)

2．3．1FOS和JUN的表達(dá)正常小鼠骨膜肌肉組織FOS、JUN蛋白表達(dá)輕度陽性。兩組骨折位點FOS、JUN表達(dá)均表現(xiàn)為：創(chuàng)傷后1～3 h骨折位點開始表達(dá)，6 h達(dá)峰值，24 h后降至對照水平。統(tǒng)計學(xué)分析表明，兩組3、6、12 h與對照組比較差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。該3個時相組間兩兩比較差異也都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2．3．2骨折位點bFGF的表達(dá)A組創(chuàng)傷后12 h達(dá)峰值，B組于24 h達(dá)峰值，均持續(xù)表達(dá)96 h以上。統(tǒng)計學(xué)分析表明，A組除1 h、B組除1、3 h外，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。3、6、12、48 h四個時相組問兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2．3．3骨折位點VEGF蛋白的表達(dá)A組創(chuàng)傷后24 h達(dá)峰值，B組于48 h達(dá)峰值，均持續(xù)96 h以上。統(tǒng)計學(xué)分析表明，A組6 h后、B組12 h后與

對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。6、12、24 h三個時相組問兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2．4相關(guān)性分析

speamlan等級相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)A組腦挫傷灶周圍腦組織FOS蛋白與bFGF表達(dá)、bFGF與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.896、0.832，P＜0.05；A組骨折位點FOS蛋白與bFGF表達(dá)、bFGF與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.938、0.945，P＜0.05；B組骨折位點FOS蛋白與bFGF表達(dá)、bFGF與VEGF蛋白表達(dá)也呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.833、0.914，P＜0.05；兩組腦組織FOS、JUN蛋白與骨折位點FOS、JUN表達(dá)的關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)意義。

3討論

小鼠TBI后呈昏迷狀態(tài)，約2～3 h后逐漸復(fù)蘇，部分有偏癱，進(jìn)食量減少。24 h后進(jìn)食進(jìn)水基本正常，但嚙咬食物明顯減少，直至96 h以后仍未完全恢復(fù)。用直徑5 mm墊片代替圓錐預(yù)置，可以有效減少硬腦膜的破裂。大體可見腦挫傷灶較局限，腦組織腫漲明顯，內(nèi)有多個小出血灶。脛骨均為橫形或者輕度斜形骨折，髓內(nèi)針固定的目的是為了消除骨折端異常活動。該模型經(jīng)改良后已具備以下特點：(1)與臨床顱腦創(chuàng)傷合并多發(fā)骨折的損傷機(jī)制類似或接近；(2)實驗的穩(wěn)定性、可重復(fù)性高；(3)致傷能量能夠衡量、傷情能夠分級；(4)致傷后對動物的神經(jīng)功能、病理變化及骨折愈合情況等能夠進(jìn)行有效研究和評估；(5)易于操作、經(jīng)濟(jì)。

bFGF的合成主要在骨形成的早期。認(rèn)為bFGF刺激骨愈合主要是由于刺激了未分化問充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生形成毛細(xì)血管參與骨愈合。bFGF與VEGF有明顯的時間和濃度關(guān)系，bFGF可以直接和間接地調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞的化學(xué)趨向性。皮質(zhì)直接打擊可改變即刻早期基因(immediate early genes，IEGs)的表達(dá)。真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在c-los、c-jun等IEGs，在第二信使的誘導(dǎo)下，表達(dá)FOS和JUN等核蛋白。FOS和JUN蛋白通過亮氨酸拉鏈形成激活蛋白-1(activated protein-l，AP-1)，后者作為轉(zhuǎn)錄因子與許多基因的AP-1結(jié)合位點結(jié)合，影響晚期靶基因的表達(dá)。后續(xù)基因通過AP-1轉(zhuǎn)錄因子激活而表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，通過直接或間接的作用途徑，調(diào)節(jié)骨系細(xì)胞的分化與增殖。bFGF與癌基因c-fos、c-jun之間存在著密切的關(guān)系，兩者相輔相成，在精密的調(diào)控機(jī)制下共同作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化。

綜合本實驗的結(jié)果分析，TBI后骨折愈合加速的機(jī)制可能為：創(chuàng)傷性腦損傷后挫傷灶周圍腦組織FOS、JUN蛋白的高表達(dá)使挫傷腦組織bFGF的表達(dá)顯著上升，繼而影響VEGF表達(dá)水平的增加，從而在組織修復(fù)過程中起協(xié)同作用；腦外傷后骨折局部VEGF、bFGF表達(dá)到達(dá)峰時間提前，峰值更高，有利于促進(jìn)多種細(xì)胞趨化、增殖與分化，促進(jìn)成骨，但具體機(jī)制不詳。

合并腦外傷而未行有效固定的骨折，由于骨折處存在不同程度的異常活動，刺激骨折周圍的骨形態(tài)發(fā)生蛋白合成、分泌增加，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨痂形成，是臨床上腦外傷合并骨折患者手術(shù)時發(fā)現(xiàn)大量骨痂形成的可能機(jī)制之一。在本實驗中，小鼠脛骨骨折事先以克氏針做髓內(nèi)固定，排除機(jī)械性因素的影響，仍可發(fā)現(xiàn)TBI后骨折位點bFGF、VEGF表達(dá)特點的改變，同時影像學(xué)也證實TBI后骨折愈合的速度比單純骨折小鼠快且骨痂量要豐富，因此，創(chuàng)傷性腦損傷后骨折盡可能的早期確切固定可以充分利用其成骨加速機(jī)制，促進(jìn)骨折修復(fù)。