ｂｃｌ－ｘｌ基因過表達在腦梗死中的保護作用及細胞色素Ｃ與ｃａｓｐａｓｅ－３的表達研究

王芙蓉　姜永生　劉　艷　肖文伍　張?zhí)K明

【摘要】目的觀察大腦中動脈栓塞模型轉(zhuǎn)基因小鼠中bcl-xl的過表達對腦缺血后再灌流的保護作用及其機制。方法建立bcl-xl過表達轉(zhuǎn)基因小鼠模型，將該模型小鼠與同種系野生型小鼠同時行線栓永久性阻塞大腦中動脈，在缺血24 h時測其神經(jīng)功能評分，觀察轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的差別。在缺血后不同時間點分別檢測兩種小鼠梗死體積及其動態(tài)變化、腦組織中bcl-xl的表達量的差異、再灌流時凋亡細胞的數(shù)量和分布情況以及腦中細胞色素c及caspase-3的表達量及分布情況。結(jié)果轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)功能評分低于野生型小鼠。在缺血后不同時間點，轉(zhuǎn)基因小鼠的梗死體積小于并且皮質(zhì)缺血區(qū)內(nèi)的凋亡細胞數(shù)明顯少于野生型小鼠，且保護作用發(fā)生時間早，持續(xù)時問較長。梗死前后轉(zhuǎn)基因小鼠的皮質(zhì)細胞bcl-xl的表達量均明顯高于野生型小鼠，且梗死后兩種小鼠體內(nèi)的bcl-xl的表達量均有所增加，但兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。缺血后再灌流后不同時問點，轉(zhuǎn)基因小鼠缺血局部細胞色素c的表達及caspase-3的活化明顯低于野生型小鼠。結(jié)論在規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)條件下，轉(zhuǎn)基因小鼠中bcl-xl基因的過表達能夠降低腦梗死的體積并改善小鼠的神經(jīng)功能。過表達bcl-xl基因的這種效應(yīng)可能是通過抑制細胞凋亡而實現(xiàn)的，其機制可能是bcl-xl基因的過表達抑制了細胞色素c的釋放及caspase-3的活化。

【關(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)基因小鼠；腦梗死；bcl-xl基因；細胞色素c；caspase－3

腦梗死是一類發(fā)病率和病死率都很高的疾病，目前尚無理想的治療措施。病理生理機制復(fù)雜，包括細胞離子穩(wěn)態(tài)的破壞、胞內(nèi)鈣的增加、興奮性神經(jīng)毒性物質(zhì)及自由基的損傷等。缺血所致的梗死和神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)，凋亡神經(jīng)元的多少決定著梗死面積的最終大小。肖文伍等研究表明，bcl-xl在體外能夠抑制神經(jīng)元的凋亡。基于上述背景，筆者用所建立的過表達bcl-xl基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，制作大腦中動脈線栓模型，與野生型小鼠比較其梗死體積及神經(jīng)功能評分的差異，用TUNEL觀察溶栓后不同時間點凋亡細胞的數(shù)量及動態(tài)分布變化，同時檢測了細胞色素c及caSpaSe-3的表達水平，深入研究其機制，以期為腦缺血的基因治療及細胞生物學(xué)治療新途徑的開辟奠定理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1．1轉(zhuǎn)基因小鼠的建立、檢測及傳代

通過顯微注射將PstI線性化的表達質(zhì)粒導(dǎo)入昆明白小鼠受精卵中并移植入假孕鼠受精卵中，產(chǎn)生出子代小鼠。對子代小鼠進行檢測，并對檢測陽性的小鼠進行繁殖傳代。

1．2動物分組

選用12～16周齡的6號小鼠的第四代子代雄性昆明白鼠，均經(jīng)檢測為bcl-xl過表達小鼠，體重均為30－35 g；另取同齡雄性昆明白小鼠(購自同濟醫(yī)學(xué)院動物房)作為野生型小鼠。

選取兩組動物各18只，在控制其它實驗條件下對它們進行線栓，于24 h時觀察神經(jīng)功能評分情況。并分別于6 h、24 h、72 h后殺鼠，TFC染色，觀察它們的腦梗死體積。

另選取轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠兩組動物各26只，在控制其它實驗條件下對它們進行線栓，分別于缺血．再灌流后6 h、24 h、72 h(每組6只)取腦觀察，每組同時有假手術(shù)組小鼠4只，陰性對照小鼠4只。了解內(nèi)源性bcl-xl在缺血前后的表達變化。

選取兩組動物各32只，用Western-blot方法觀察缺血．再灌流后3 h、6 h、12 h及24 h時(每組6只)細胞色素c及caspase．3的表達情況，每組同時有假手術(shù)組小鼠4只，陰性對照小鼠4只。

1．3線栓的制備及手術(shù)操作

控制好小鼠的品系、體重與線栓規(guī)格的匹配以及術(shù)后溫度等因素，保證小鼠線栓模型有較好的穩(wěn)定性。

1．4儀器設(shè)備

YXK-5G型嬰兒培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；TGL-16G離心機(國產(chǎn))；紫外分光光度計(PhannaciaBioteeh，英國)；顯微攝影儀(OLYMPUS，日本)；兔抗bcl-xl抗體(Santa Cruz)，兔抗cytochrome c抗體(PharMingen)兔抗caspase-3抗體(Santa Cruz)，兔抗caspase-3 P17抗體(cell signaling)。

1．5梗死體積的計算

采用HPIAS-1000高清晰度圖像處理系統(tǒng)進行圖像分析，測量每片的梗死面積和總面積，每層梗死體積為該層梗死面積和層厚的乘積，各層的梗死體積之和即為總的梗死體積。

1．6神經(jīng)功能評分

在術(shù)后24 h采用5分制評分法對小鼠進行評分，評分由本試驗以外的同學(xué)完成。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分表示無神經(jīng)損傷體征；1分表示不能完全伸直對側(cè)前爪；2分表示向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分表示向?qū)?cè)傾倒；4分表示不能自發(fā)行走，意識喪失。

1．7數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計學(xué)方法

采用HPIAS-1000高清晰度圖像處理系統(tǒng)進行圖像分析。參考圖譜每張切片觀察6個區(qū)域，計數(shù)2個表達最強高倍鏡視野(×400)。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示。采用SPSS 12．0 forWindows統(tǒng)計軟件處理。假手?jǐn)?shù)組及相鄰時間點的比較采用方差分析后q檢驗；各相應(yīng)時問點轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠之間的比較均采用方差分析及SNK-q檢驗。神經(jīng)功能評分結(jié)果采用Ridit分析進行統(tǒng)計處理。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

將線栓后24 h的轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠分別進行神經(jīng)功能評分結(jié)果見圖1。用TIC染色并計算其梗死體積，結(jié)果見表1。梗死體積在各不同時間點之間的兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，且各組問的兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠中凋亡細胞的分布結(jié)果見表2。梗死前轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中bcl-xl蛋白的表達量明顯高于野生型小鼠，而在缺血．再灌流后3 h時，兩種小鼠bcl-xl的表達量較梗死明顯增加(P＜0.05)，且梗死后兩種小鼠的bcl-xl的表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但所增加的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠阻塞大腦中動脈后，于再灌流3、6、12及24 h細胞色素C的比較見圖2，caspase-3中P17蛋白與表達的比較見圖3，caspase-3的免疫組化見圖4。

3討論

作為bcl-2家族的一員，bcl-xl在局灶性腦缺血中起著重要的神經(jīng)元保護作用。本實驗用轉(zhuǎn)基因的方法使該基因在神經(jīng)細胞中過表達，實驗結(jié)果顯示出強大的神經(jīng)元保護功能：在總體水平上，bcl-xl轉(zhuǎn)基因小鼠的腦梗死體積在缺血后24 h時較野生型小鼠降低了30％，轉(zhuǎn)基因小鼠的缺血區(qū)中凋亡

細胞數(shù)也較野生型小鼠明顯減少，與梗死體積的降低結(jié)果相一致。Kim等以及Wissner等發(fā)現(xiàn)，bcl-xl轉(zhuǎn)基因小鼠具有腦保護作用而bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠沒有此作用，bcl-xl在缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，在線栓后24 h所進行的神經(jīng)功能評分中，轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)功能評分明顯低于非轉(zhuǎn)基因小鼠。同時在缺血90 min后再灌流3 h時，兩種小鼠均可檢測到凋亡細胞，與正常組及假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但轉(zhuǎn)基因小鼠的凋亡細胞明顯少于野生型小鼠(P＜0.01)，說明bcl-xl可能在缺血的早期即已開始發(fā)揮抗凋亡作用。缺血一再灌流24 h時，兩種小鼠的凋亡細胞計數(shù)均有明顯增加(P＜0.01)，且達到高峰，轉(zhuǎn)基因小鼠仍顯示較強的神經(jīng)保護作用，其凋亡細胞計數(shù)均明顯低于野生型小鼠(P＜0.01)。在缺血一再灌流后72 h，兩種小鼠的凋亡細胞數(shù)均有所減少(P＜0.05)。但從總體來看，轉(zhuǎn)基因小鼠的凋亡細胞數(shù)一直明顯維持于相對較低的水平。筆者推測，這與過表達的bcl-xl的抗凋亡作用有關(guān)，但這種作用是通過何種機制來實現(xiàn)的，也是研究的重點。

有資料研究表明，缺血一再灌流后的急性期具有bcl-xl表達的短暫上升，此時轉(zhuǎn)基因小鼠的腦保護作用是否是通過影響內(nèi)源性bcl-xl的表達而引起?筆者檢測了梗死前后轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠腦中的bcl-xl蛋白的表達情況發(fā)現(xiàn)，梗死后兩種小鼠的bcl-xl的表達量雖都有增加，但所增加的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。筆者因此推測，缺血所誘導(dǎo)的內(nèi)源性bcl-xl的產(chǎn)生水平在轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠之問差異無統(tǒng)計學(xué)意義，轉(zhuǎn)基因小鼠的這種保護作用不是通過調(diào)動內(nèi)源性bcl-xl的產(chǎn)生實現(xiàn)的，而可能是外源過表達的bcl-xl所起的作用。

另外一個問題是在神經(jīng)元缺血性損傷時，凋亡的機制如何被啟動?在非神經(jīng)系統(tǒng)中，已證實有兩種凋亡途徑。外源性途徑，由死亡受體介導(dǎo)；內(nèi)源性途徑，由線粒體介導(dǎo)。目前的證據(jù)證實，在神經(jīng)元的缺血．再灌流損傷中，兩條凋亡途徑均被激活。在內(nèi)源性途徑中的一個關(guān)鍵的步驟，就是線粒體釋放細胞色素C，釋放出來的細胞色素C可以在ATP或dATP存在的情況下，使凋亡蛋白酶沽化因子Apaf-1(apoptotic protease-activating factor-1)發(fā)生構(gòu)象變化而活化，活化的Apaf-1借助N-端的CARD(caspase-recmitment domain)結(jié)構(gòu)域經(jīng)同源作用于procaspase-9分子中的CARD結(jié)構(gòu)域寡聚化形成apoptosome復(fù)合體，促使procaspase-9自身活化，活化的caspase-9激活下游的效應(yīng)酶如caspase-3，2，7等，切割特定的凋亡底物，誘發(fā)細胞凋亡。caspase-9存在于線粒體中并與細胞色素c同時釋放。

筆者的實驗發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，細胞色素c的釋放水平一直較低，直至再灌流后24 h時，細胞色素c才有較高的表達，但仍明顯低于野生型小鼠，而在缺血．再灌流的早期，caspase-3的活化受到了抑制。筆者推測bcl-xl的過表達能夠抑制細胞色素c的釋放，并在再灌流的早期能夠抑制caspase-3的活化。

目前，基因治療越來越受到人們的廣泛關(guān)注。動物實驗中基因治療已經(jīng)證實有很好的效果。由本研究結(jié)果筆者想到，若能夠通過基因治療，將bcl-xl基因轉(zhuǎn)移到腦缺血患者體內(nèi)，則可以達到很好的治療效果。在人們具有患某種病的危險因素時，即將特定的治療基因轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)，在正常情況下，這種外源基因保持靜止，而一旦一定的致病因素促發(fā)了特定的基因，即引起該基因在體內(nèi)的表達，從而達到預(yù)定的治療目的。這也可能構(gòu)成一種腦缺血損傷及其他慢性損傷新的防治策略。