3種植物粗提物對6種植物病原菌抑菌活性研究

劉曉輝 呂國忠 楊紅 李季蓉 李林翰 王劍釗

摘要：試驗研究了平枝構子（Cotoneaster horizontalis）、蒼耳（Xanthium sibiricum）、花椒（Zanthoxylum bun-geanum）3種植物粗提物對玉米彎孢菌（Curvularia lunata）、向日葵菌核（Sclerotinia sclerotiorum）、人參灰霉（Botrytis cinerea）、人參黑斑（Alternaria panaz）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、辣椒疫霉（Phytophthoraca psici）6種植物病原菌的抑菌活性。結果表明：平枝構子和蒼耳粗提物對6種病原菌均有較好抑菌效果，其中平枝構子和蒼耳對人參灰霉菌抑菌活性較明顯，抑菌率分別為89.87%和83.54%?；ń烦龑θ藚⒒颐褂幸欢ǖ囊志Ч猓瑢ζ渌?種病原菌均存在一定程度上的促生長作用。

關鍵詞：植物粗提物;抑菌活性;病原真菌

中圖分類號：S482.2 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）22-0177-04

1 引言

植物病害是造成農業(yè)生產作物損失的重要原因之一，而真菌是引起各類植物病害的重要病原物之一。目前為了提高作物生產力和質量，農業(yè)生產依然無法擺脫對化肥和農藥的依賴[1]。近年來，西方國家已經禁止大量使用合成農藥，因其具有高毒性、急性毒性、需要長期降解期、毒素在食物鏈中累積等問題，過度使用和濫用農用化學品對環(huán)境造成了嚴重的污染，隨著人們環(huán)保意識和食品安全意識的提升，人們對安全、有效的農藥替代品需求日益增加[2]，而植物源抑菌農藥已經成為目前的研究熱點。本試驗以平枝構子、蒼耳、花椒果實粗提物為研究對象，對生產上常見6種作物病害：玉米彎抱菌葉斑病、向日葵菌核病、人參灰霉病、人參黑斑病、瓜果腐霉病和辣椒疫霉病的病原菌的抑菌作用展開研究，為后期活性物質的分離提純提供理論基礎。

2 材料與方法

2.1 供試材料

平枝栒子果實采集于大連民族大學校園內，采集后裝入無菌袋中帶回實驗室并清洗處理，4℃冰箱保存[3];花椒和蒼耳果實購買于學校附近藥店。

供試植物病原菌：玉米彎抱菌（Curvularia luna-ta）、向日葵菌核（Sclerotinia sclerotiorum）、人參灰霉（Botrytis cinerea）、人參黑斑（Alternaria panax）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、辣椒疫霉（Phytoph-thora capsici）6種植物病原菌均由沈陽農業(yè)大學真菌實驗室提供。

2.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）用于活化菌株及其他供試病原真菌的活化和抑菌活性測定。

2.3 主要儀器及試劑

DHG-9147A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司;KG-SX-500蒸汽滅菌器：KAGOSHI-MA SEISAKUSYO INC;EV923MF7-NRH微波爐：廣東美的廚房電器制造有限公司;C21-SDHCB39電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司;VS-1300L-U超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司：RH62K6151S8/SC冰箱：蘇州三星電子有限公司;RXZ-280B智能人工氣候箱：寧波江南儀器廠;ME203E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司等。

無水乙醇、蒸餾水、石油醚、冰醋酸、土豆、葡萄糖、瓊脂等。

2.4 試驗方法

2.4.1植物粗提物的制備

分別稱取研磨成粉末狀的蒼耳、平枝構子、花椒果實各200g于500mL三角燒瓶中，每個瓶中分別加入200mL去離子水、200mL石油醚200mL無水乙醇，用封口膜密封且做好標記后放入120r/min轉速的搖床內，震蕩3d（見表1）[4]。每個處理5個重復。

3d后將混合液分別用紗布過濾到棕色收集瓶內并做好標記（標記見表1），同時將過濾后的固體殘留物繼續(xù)放回原三角瓶內，加入150mL原提取液以相同轉速搖床震蕩2d;2d后將各混合液分別用紗布過濾到相應棕色收集瓶內，同時將過濾后的固體殘留物繼續(xù)放回原三角瓶內，加入150mL原提取液以相同轉速搖床震蕩1d;1d后將各混合液按照上述方法分別提取到指定收集瓶內。3種植物浸提液分別放到旋轉蒸發(fā)儀上旋轉蒸發(fā)，去離子水設置溫度80℃，無水乙醇設置溫度70℃，石油醚設置溫度40℃，得到膏狀物稱質量。用乙醇定容0.005g/mL，4℃冰箱低溫保存。樣品旋轉增發(fā)后膏狀物質量，見表2。

2.4.2 抑菌活性試驗

用打孔器（直徑0.5cm）在培養(yǎng)7～10d的植物病原菌培養(yǎng)皿內打孔，然后分別轉入到混有植物粗提物（濃度為0.005g/mL）的培養(yǎng)基中并做好標記，設立對照組。菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

3 結果與分析

3.1 不同萃取溶劑對3種植物粗提物萃取率的影響

由表2可知：去離子水對蒼耳的提取率最高，萃取率達到1.15%，乙醇次之，石油醚最低;乙醇對平枝栒子的提取率最高，萃取率達到1.01%，去離子水次之，石油醚最低;去離子水對花椒的提取率最高，達到1.185%，乙醇次之，石油醚最低。綜合以上結果，本試驗選擇去離子水作為蒼耳和花椒萃取溶劑，選擇無水乙醇作為平枝栒子作為萃取溶劑。

3.2 抑菌活性鑒定結果

3.2.1 3種植物粗提物對玉米彎孢菌葉斑病菌的抑菌活性

由圖1可知：去離子水萃取的蒼耳粗提物和去無水乙醇萃取的平枝拘子粗提物對玉米彎孢菌有顯著的抑菌效果，其中平枝栒子抑菌活性最好，達到75.34%;蒼耳抑菌活性達68.49%;而去離子水萃取的花椒粗提物對玉米彎孢菌葉斑病菌沒有抑菌活性，且試驗中粗提物對玉米彎孢菌的生長有一定促進作用。

3.2.2 3種植物粗提物對向日葵菌核病菌的抑菌活性研究

由圖2可知：無水乙醇萃取的平枝栒子粗提物對向日葵菌核病菌抑菌活性最好，達到81.69%;去離子水萃取的蒼耳粗提物對向日葵菌核病菌抑菌率達到46.47%;而去離子水萃取的花椒粗提物抑菌效果為負值，即花椒內某些物質促進了向日葵菌核病菌的生長繁殖，促生長率達到16.9%。

3.2.3 3種植物粗提物對人參灰霉病菌的抑菌活性研究

由圖3可知：無水乙醇萃取的平枝栒子粗提物抑菌活性最好，達到89.87%;去離子水萃取的蒼耳粗提物抑菌率達到83.54%，略次于平枝栒子;去離子水萃取的花椒粗取物對人參灰霉有一定的抑菌活性，抑菌率為20.25%。結果表明：平枝栒子和蒼耳的粗提物對人參灰霉生長有明顯抑制活性，花椒粗提物對人參灰霉病菌抑菌效果不顯著。

3.2.4 3種植物粗提物對人參黑斑抑菌活性研究

由圖4可知：無水乙醇萃取的平枝栒子粗提物對人參黑斑病菌抑菌效果最好，達到73.01%;去離子水萃取的蒼耳粗提物對該病菌的抑菌率為39.68%;而去離子水萃取的花椒粗取物對人參黑斑病菌有促生長作用，促生長率為15.87%。

3.2.5 3種植物粗提物對瓜果腐霉的抑菌活性研究

由圖5可知：無水乙醇萃取的平枝栒子粗提物對瓜果腐霉菌抑菌活性達到69.81%;去離子水萃取的蒼耳粗提物對該菌的抑菌率為52.63%;而去離子水萃取的花椒粗提物對瓜果腐霉無抑制作用，反而促進該菌生長，且促生率為52.83%。

3.4.6 3種植物粗提物對辣椒疫霉菌的抑菌活性研究

由圖6可知：無水乙醇萃取的平枝拘子粗提物對辣椒疫霉有顯著的抑菌效果，抑菌率達到75.00%;去離子水萃取的蒼耳粗提物對該菌也有較顯著抑菌效果，抑菌率達到65.38%;而去離子水萃取的花椒粗取物對辣椒辣椒疫霉菌存在促生長作用，且促生率達到了59.61%。

4 結論與討論

植物次生物質的抑菌作用的研究是現(xiàn)階段植物源抑菌農藥開發(fā)的重要方向。本研究表明：平枝拘子和蒼耳粗提物抑菌普遍較廣，平枝拘子粗提物對6種植物病原菌抑菌率均達到69%以上，其中對人參灰霉病菌的抑菌率高達89%;蒼耳對人參灰霉抑菌率達到83%以上。由此可見，以上2種植物中均含有一定的農用抗菌成分，可作為兩種潛在的植物源農藥開發(fā)資源對其穩(wěn)定性、抑菌活性物質進行深入研究。

此外，研究中發(fā)現(xiàn)花椒除對人參灰霉病菌具有一定抑菌作用，對其它病原菌均有促進生長作用，對瓜果腐霉、辣椒疫霉菌促生長率達到50%以上。陸寧海等研究發(fā)現(xiàn)花椒在甲醇、乙醇、丙酮和二甲苯4種不同溶劑提取物對水稻紋枯病菌、番茄早疫病菌、大蔥紫斑病菌和棉花枯萎病菌4種植物病原菌菌絲生長的抑制作用存在顯著差異，其中甲醇的提取物抑菌活性最低[5]。而本研究中采用去離子水作為提取溶劑，其粗提物對所研究的參試6種病原菌中的5種具有促生作用，說明不同的溶劑提取的花椒粗提物的活性物質存在顯著差異且復雜，需要根據(jù)生產實際選擇合適的萃取溶劑，以便獲得所期活性物質。本研究結果表明，從植物源生防抑菌活性物質角度，盡量避免使用去離子水作為花椒萃取溶劑，以減少促生成分對抑菌效果的不良影響。

參考文獻：

[1]周汛，李桂明.10種中藥的不同制劑對常見致病菌體外抗菌活性研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（2）：237～239.

[2]Bertschinger HU，Nief V，Tsch？ pe H.Active oral immunizationof suckling piglets to prevent colonization afterweaning by entero-toxigenic Escherichia coli with fimbriae F18[J].Veterinary Micro-biology，2000（71）：255～267.

[3]沈映君，陳長勛.中藥藥理學[M].上海：上海科學技術出版社，2012.

[4]梁宇，高玉葆.內生真菌對植物生長發(fā)育及抗逆性的影響[J].植物學通報，2000（1）：52～59.

[5]陸寧海，吳利民，侯培琳，等.不同溶劑提取花椒抑菌活性物質的初步研究[J].河南農業(yè)科學，2012，41（6）：109～111.

收稿日期：2019-10-15

基金項目：國家自然科學青年基金項目（編號：31800007）

作者簡介：劉曉輝（1994-），女，碩士研究生，研究方向為真菌資源與分類。

通訊作者：呂國忠（1964-），男，教授，博士，研究方向為真菌資源開發(fā)。