抗凝血酶檢測(cè)及臨床研究進(jìn)展

沈凌志

北海市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 廣西北海 536000

抗凝血酶(antithrombin，AT)，是人體抗凝系統(tǒng)的重要因子，約占抗凝系統(tǒng)總活性的50%～70%?？鼓到y(tǒng)主要是維持機(jī)體出血與止血平衡，當(dāng)抗凝系統(tǒng)中某些因子的數(shù)量或功能發(fā)生改變的時(shí)候，就有可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重影響，導(dǎo)致出血或引起血栓形成。造成各種疾病的發(fā)生。本文將從AT 的結(jié)構(gòu)、功能以及對(duì)相關(guān)疾病影響方面研究進(jìn)展綜述如下。

1 抗凝血酶的分子結(jié)構(gòu)及功能

抗凝血酶（AT）是一單鏈糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為58.2ku，由432 個(gè)氨基酸(aa)組成。編碼AT 蛋白的基因已被定位于人類染色體1q23-25.1(基因符號(hào)SERPINC 1)，全長為13535bp，血漿濃度為2μmol／L。AT 分子主要由3 個(gè)β 折疊(A、B 和C)，9個(gè)α 螺旋和1 個(gè)反應(yīng)中心環(huán)(reactive center loop，RCL)。共同組成一個(gè)大小75～100A 的球狀分子。AT 有兩個(gè)重要的功能區(qū)[1]，一個(gè)是位于N 端的肝素結(jié)合區(qū)，AT 反應(yīng)位點(diǎn)在P1(Arg 393)和P1'(Ser 394)位，AT 通過Arg393－ser394 的絲氨酸蛋白酶反應(yīng)點(diǎn)及Lys 殘基（第125 位、第107 位和第136 位）和Arg 殘基（第129 位和第145 位）有關(guān)2 個(gè)功能位點(diǎn)，與肝素、凝血酶結(jié)合發(fā)揮其抗凝作用，其抗凝作用占體內(nèi)總抗凝作用70%左右[2]。一個(gè)是位于C 端的反應(yīng)位點(diǎn)。AT 與肝素的結(jié)合，是AT 抗凝功能中的重要一環(huán)，在肝素存在下，AT 的抗凝作用可以增加數(shù)千倍[3]。在人體有生理意義的有3 種亞型：AT－Ⅰ、AT－Ⅲ、AT－Ⅵ，肝素主要通過加強(qiáng)AT－Ⅲ的活性而發(fā)揮間接抗凝作用，AT滅活絲氨酸蛋白酶活性的速度依賴于肝素，但滅活絲氨酸蛋白酶的量取決于AT 的活性。1993年，國際血栓和止血協(xié)會(huì)推薦將AT－Ⅲ簡稱為AT。由于AT－Ⅰ實(shí)際上是纖維蛋白，AT－Ⅵ為纖維蛋白（原）的降解產(chǎn)物，故只有AT－Ⅲ才具有抗凝血酶的作用，在循環(huán)血液中AT 的濃度大約為2.3μM，這些AT 的抗凝活性比較弱，只有在與特殊的戊糖(pentasaccharide)序列(存在于用于治療的肝素和暴露的血管壁中的硫酸肝素分子中)結(jié)合后，AT 構(gòu)象發(fā)生改變，反應(yīng)中心環(huán)(RCL)暴露，才可有效地發(fā)揮抗凝作用[4]。對(duì)于F Ⅹa 和F Ⅸa，肝素既能通過促進(jìn)AT-肝素-蛋白酶復(fù)合物(michaeliscomplex)的穩(wěn)定而加速AT 對(duì)其的滅活，肝素還能通過介導(dǎo)AT 變構(gòu)激活(allostericactivation)而發(fā)揮其抗凝作用。在肝素的參與下，AT 與F Ⅹa 和F Ⅸa 結(jié)合的阻力減小，并且促進(jìn)AT 反應(yīng)中心環(huán)上的外結(jié)合位點(diǎn)(exosite)與F Ⅹa 和F Ⅸa 的作用[5]。Izagurirre 等[6]研究認(rèn)為Tyr 253 和Glu 255是外結(jié)合位點(diǎn)關(guān)鍵因子，能與F Ⅹa 和F Ⅸa 上的Arg 150 特異結(jié)合，凝血酶由于缺乏Arg150 而無法參與該反應(yīng)。在正常血循環(huán)中存在2 種形式:α-AT 和β-AT，血漿中90%的AT 以α-AT 形式存在，它是反應(yīng)中心環(huán)中的P14 和P15 插入β 折疊結(jié)構(gòu)A 中的一種T 結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)對(duì)凝血酶和活化因子Ⅹ(F Ⅹa)的抑制較弱。β-AT 是P14 和P15 在β 折疊結(jié)構(gòu)A 中展開的一種AT 結(jié)構(gòu)，對(duì)F Ⅹa 抑制能力比α-AT 增加300 倍，是凝血酶的主要抑制物，同時(shí)對(duì)其他絲氨酸蛋白酶如F Ⅸa、F Ⅺa 和F》a 等凝血因子以及纖溶酶、胰蛋白酶和激肽釋放酶等的活性也有抑制作用[7]。因此臨床上常常以測(cè)定血漿AT 的水平作為判斷機(jī)體抗凝水平和血栓形成性疾病的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，也據(jù)此選擇治療方法和評(píng)價(jià)療效。

2 抗凝血酶檢測(cè)方法及原理

嚴(yán)格按抗凝劑與血液1 ∶9 的比例采血。嚴(yán)格按照全自動(dòng)血凝分析儀操作規(guī)程進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用發(fā)色底物法檢測(cè)AT，其原理為定量的凝血酶加入到待測(cè)血漿中，與血漿中AT 作用，形成無活性的復(fù)合物，剩余的凝血酶作用于發(fā)色底物，釋放出對(duì)硝基苯胺（PNA），PNA 在波長405nm 處有最大吸收峰，PNA 顯色深淺與AT 成反比[8]。

3 抗凝血酶與主要疾病的關(guān)系

正常人體的凝血與抗凝血系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，若失平衡就會(huì)有出血或血栓形成的危險(xiǎn)，AT 是血漿中抑制凝血的關(guān)鍵物質(zhì)，它可直接抑制凝血也可與凝血酶形成復(fù)合物抑制多種凝血因子活性。當(dāng)體內(nèi)啟動(dòng)凝血系統(tǒng)隨之產(chǎn)生消耗性AT 減少，是體內(nèi)處于高凝狀態(tài)的客觀指標(biāo)。因此，AT 的增多或減少是出血、血栓的關(guān)鍵，其不僅在高血壓、糖尿病、心梗（AMI）、腦梗死、肺栓塞、肝病、腫瘤等疾病的診斷中有一定的重要意義，在靜脈血栓等疾病的治療方面也有積極的作用，尤其是在腦梗、心梗、肺栓塞等突發(fā)疾病的協(xié)助診斷方面尤為重要。

3.1 抗凝血酶與高血壓病

原發(fā)性高血壓病患者存在凝血、纖溶的失衡。研究發(fā)現(xiàn)[9]：高血壓Ⅰ期時(shí)血漿中AT 無顯著性改變，尿中AT 與正常人無顯著性差異；到Ⅱ期時(shí)隨著尿中微量蛋白的出現(xiàn)，血中AT 下降，尿中AT 升高；發(fā)展到Ⅲ期時(shí)，血漿中AT 水平顯著降低，尿液中AT 增高更加明顯。尿中AT 與尿中白蛋白有關(guān)，與血壓高低無關(guān)。尿中AT水平增高導(dǎo)致了血中AT減少，說明血液凝固性增高易形成血栓，如果腎內(nèi)凝血反復(fù)進(jìn)行，可導(dǎo)致腎功能減退以及腎小球硬化。通過檢測(cè)血、尿中AT 的變化，可以為臨床監(jiān)控高血壓病及有無并發(fā)腎損害提供依據(jù)。

3.2 抗凝血酶與糖尿病

糖尿病患者在持續(xù)性高血糖狀態(tài)下，可導(dǎo)致一些組織、器官功能障礙及形態(tài)上的改變，特別是2 型糖尿病，神經(jīng)、血管、視網(wǎng)膜、腎臟等最易受累，血管內(nèi)皮損傷、出凝血機(jī)制異常是其發(fā)生病變的重要原因。單純的控制血糖，似乎也不能阻止并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。糖尿病伴視網(wǎng)膜病變、腎臟病變，血漿中AT 明顯下降[10]。糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，激活凝血系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)，修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮，清除局部病理產(chǎn)物的堆積，致使AT 下降。此外AT 相對(duì)分子質(zhì)量小，通過腎小球，流失到尿液，尿中AT 水平增高導(dǎo)致血中AT 減少，并隨著糖尿病腎臟病變的加重而逐漸變化[11]。如果腎內(nèi)凝血反復(fù)進(jìn)行必將導(dǎo)致腎功能的減退以及腎小球硬化。為此，在對(duì)糖尿病患者的治療除了積極控制血糖，治療原發(fā)病因外，還應(yīng)進(jìn)行血、尿中AT 的監(jiān)測(cè)，以防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。

3.3 抗凝血酶與急性心梗（AMI）

抗凝血酶（AT）是體內(nèi)主要的生理性抗凝因子，可抑制凝血酶類絲氨酸蛋白酶活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12]急性心肌梗死（AMI）時(shí)血漿，AT 呈消耗性降低，其機(jī)制就是凝血酶與抗凝血酶結(jié)合形成的一 種復(fù)合物TAT（促凝血酶原激酶復(fù)合物），血漿TAT 水平的增高，可較早提示急性心肌梗死患者體內(nèi)凝血系統(tǒng)處于異?；钴S狀態(tài)，其所導(dǎo)致的高凝狀態(tài)是冠脈血栓形成的重要因素，而冠脈血栓形成則是急性心肌梗死發(fā)生的主要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死（AMI）患者，TAT 變化較心肌肌鈣蛋白T（cTnT）和肌酸激酶－MB（CK－MB）、肌紅蛋白等更為敏感，高TAT 的AMI患者可能有心肌大片的壞死，因此，TAT 水平有助于AMI 早期診斷及預(yù)后判斷[13]。

3.4 抗凝血酶與腦梗死

Tohgi 等[10]的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦梗死患者急性期血漿AT 明顯下降，說明急性腦梗死患者存在高凝狀態(tài)，AT 大量消耗所致，此變化且與年齡因素有關(guān)。表明AT 的測(cè)定對(duì)進(jìn)展性腦卒中的早期診斷、治療及病情演變的觀察提供了依據(jù)。

3.5 抗凝血酶與慢性阻塞性肺疾病（COPD）

研究表明，COPD 患者無論是急性發(fā)作期還是緩解期血漿AT含量都明顯低于正常組，治療后明顯上升，這可能是由于COPD 患者長期缺氧、感染等因素使體內(nèi)凝血因子含量增加或活化，從而使抗凝血酶的消耗增多，導(dǎo)致其抗凝機(jī)制出現(xiàn)異常[14，15]，造成血液的高凝狀態(tài)和肺小動(dòng)脈血栓的形成，進(jìn)而加重病情發(fā)展。因此，筆者認(rèn)為在臨床治療中加以適當(dāng)?shù)幕钛鼓委煂?duì)控制病情的發(fā)展有重要的價(jià)值[16]。COPD 常易并發(fā)肺小動(dòng)脈血栓的形成，這與COPD 的高凝狀態(tài)有關(guān)，持續(xù)的肺部微小血栓的形成是導(dǎo)致及加重肺動(dòng)脈高壓的一個(gè)重要原因。

3.6 抗凝血酶與肝臟疾病

肝細(xì)胞損害時(shí)血液中的凝血因素與抗凝因素保持一個(gè)低水平，平衡一旦被破壞，如組織壞死或細(xì)胞溶解釋放入血（含凝血酶），大量凝血因子被激活引起AT 的大量消耗，極易伴發(fā)DIC。AT 活性低于50%時(shí)有利于血栓形成，可以作為肝病的早期預(yù)防和診斷血栓性疾病的依據(jù)[17]。臨床上在用小劑量肝素抗凝治療無效時(shí)，可選用AT 制劑治療，使體內(nèi)AT 升高至80%以上再行肝素治療，所以臨床上治療肝病伴發(fā)DIC 時(shí)一定要注意合理利用肝素，達(dá)到最好的抗凝治療效果[18]。

3.7 抗凝血酶與腫瘤

腫瘤患者特別是惡性腫瘤患者，在腫瘤免疫性淋巴細(xì)胞的刺激下，可以合成釋放大量組織因子（TF），而TF 又是參加外源性凝血途徑的凝血因子，其因暴露于血液而啟動(dòng)，由于腫瘤患者機(jī)體內(nèi)增加了TF 凝血因子，同時(shí)由于腫瘤浸潤破壞周圍器官、組織，使血管受損，打破了機(jī)體內(nèi)凝血系統(tǒng)與抗凝血系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，為了避免腫瘤患者高凝狀態(tài)出現(xiàn)，機(jī)體必須調(diào)動(dòng)抗凝血因子來與TF 凝血因子形成復(fù)合物，從而消耗了機(jī)體內(nèi)的抗凝物質(zhì)，無論惡性腫瘤還是良性腫瘤其抗凝活性都比正常人低得多[19，20]。據(jù)此，抗凝血酶活性檢測(cè)對(duì)于腫瘤患者出凝血狀況的觀察、診斷和療效監(jiān)測(cè)有重要意義。另外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤抗凝血酶活性明顯低于良性腫瘤，這對(duì)區(qū)別惡性與良性腫瘤具有一定價(jià)值。特別對(duì)胸腔積液的良、惡性診斷是目前困擾醫(yī)學(xué)界的一大難題。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)胸腔積液的肺癌患者血液中的AT 較正常人及結(jié)核性患者顯著降低，而結(jié)核性患者血漿AT 略有升高，但與正常人比較，差異無顯著性[21]。所以AT 的檢測(cè)，對(duì)于良、惡性胸腔積液的鑒別具有輔助診斷意義。

3.8 抗凝血酶與妊高征

文獻(xiàn)報(bào)道[22]，正常孕婦AT 水平在整個(gè)妊娠期進(jìn)行性降低，妊高征患者于孕20～24周起與對(duì)應(yīng)的正常孕婦存在顯著性差異，降低更為明顯。妊娠時(shí)由于活性高的凝血因子與AT 結(jié)合形成復(fù)合物，AT 被消耗而降低，導(dǎo)致高凝狀態(tài)?；颊唧w內(nèi)這種病理生理紊亂狀態(tài)如未得到改善并繼續(xù)發(fā)展，必然超出抗凝系統(tǒng)的代償能力，最終形成血栓。故有專家建議采用小劑量肝素改善微循環(huán)，以提高AT 的作用，這對(duì)于預(yù)防妊高征的發(fā)生及發(fā)展有一定的臨床意義。因此，在產(chǎn)前除做常規(guī)凝血功能檢查外，對(duì)高危人群監(jiān)測(cè)AT，對(duì)保護(hù)母嬰健康有重要的意義。

3.9 抗凝血酶與彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）

DIC 是多種原因造成的獲得性全身性出血、血栓綜合征，其起病急驟，發(fā)展迅速，預(yù)后兇險(xiǎn)?？鼓到y(tǒng)功能降低是DIC 發(fā)病過程的重要環(huán)節(jié)，約80%的急性DIC 患者AT 降低，治療后AT 較治療前顯著回升，并接近正常水平[23，24]。AT 水平下降可能是由于AT 在凝血酶形成時(shí)不斷被消耗，同時(shí)被中性粒細(xì)胞釋放的彈性酶降解所致。臨床上常采用抗凝血酶與肝素合用，既可減少肝素用量又可增強(qiáng)抗凝療效。因此，檢測(cè)AT 不僅有助于DIC 的診斷，而且是肝素抗凝治療及療效判斷的重要參考指標(biāo)。

3.10 抗凝血酶的其他功能研究進(jìn)展

除了抗凝作用，AT 還具有抗炎和抗血管新生作用。其抗炎作用首先由Taylor 在猴子模型上研究DIC 時(shí)提出，他發(fā)現(xiàn)輸注AT 能大大降低接受致死量E.coli 猴子的死亡率。其作用機(jī)制是通過抑制凝血酶和F Ⅹa，AT 能減少凝血酶/F Ⅹa 介導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子(如IL-6 和IL-8)的釋放。通過與內(nèi)皮細(xì)胞上的硫酸乙酰肝素結(jié)合，AT 能增加重要的抗炎癥細(xì)胞因子前列環(huán)素的產(chǎn)生，后者能使平滑肌舒張，血管擴(kuò)張并抑制血小板聚集。AT 的抗炎作用與其和內(nèi)皮細(xì)胞上葡萄糖胺聚糖結(jié)合能力緊密相關(guān)[4]。

綜上所述，AT 檢測(cè)越來越受到檢驗(yàn)界及臨床醫(yī)生的重視，并有望成為診斷血栓、出血等疾病的首選檢測(cè)手段。