中國不同語系人群的色素表型推斷

梁鰍雙 ，劉明 ，陶現(xiàn)明 ，劉凡 ，曾發(fā)明 ，李彩霞 ，趙雯婷

（1.公安部物證鑒定中心 現(xiàn)場物證溯源技術國家工程實驗室 法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室 北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術研究中心，北京 100038；2.廣西玉林市公安局，廣西 玉林 537000；3.昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院，云南 昆明 650500；4.中國科學院北京基因組研究所 中國科學院精準基因組醫(yī)學重點實驗室，北京 100101）

色素表型主要包括眼睛（虹膜）顏色、發(fā)色、膚色等，是一種具有顯著人群差異性的外貌特征。根據(jù)法醫(yī)人類學研究[1]，東亞黃種人（蒙古人種）的眼睛顏色多呈深褐色或黑色，頭發(fā)多為黑色，膚色在黃色的基礎上存在深淺差異。歐洲白種人（高加索人種）的色素特征個體差異較大，頭發(fā)包括淺金色、棕色、紅色和黑色等，眼睛顏色包括藍色、綠色、棕色等，膚色存在從極淺到較深的變化。非洲黑種人（尼格羅人種）的色素特征最為單一，眼睛顏色多為黑褐色，頭發(fā)為黑色，膚色多呈黑色和深褐色。過渡人種同時具有兩種及以上人種的色素特征。色素特征受到遺傳背景、環(huán)境選擇等多重影響[2]，如人群的膚色特征具有明顯的地理分布差異，與紫外線照射強度相關，距離赤道越遠的人群膚色越淺[3-4]。

在法庭科學領域，色素表型不僅被用于法醫(yī)人類學人種判別，也是法醫(yī)遺傳學推斷現(xiàn)場生物物證DNA來源人外貌特征的重要組成信息[5-7]。色素特征的遺傳推斷研究主要基于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。2010年，通過對歐洲人群的遺傳研究，荷蘭的Kayser實驗室研發(fā)了由6個SNP位點構成的IrisPlex眼睛顏色推斷體系[8]。隨后，他們在此基礎上添加了18個頭發(fā)顏色相關位點，構建了包含24個SNP位點的HIrisPlex眼睛及頭發(fā)顏色推斷體系[9]。通過對全球59個人群的膚色遺傳學研究[10]，CHAITANYA等[11]在2018年又建立了基于41個SNP位點的HIrisPlex-S系統(tǒng)，在HIrisPlex系統(tǒng)中添加了ANKRD11、OCA2、SLC24A4等7個膚色相關基因中的17個SNP位點，可實現(xiàn)對三類眼睛顏色、四類頭發(fā)顏色和五類皮膚顏色的推斷。這三個色素表型體系在歐美人群中表現(xiàn)出很高的推斷準確性[12-16]。國際上針對東亞人群尤其是中國人群的色素遺傳研究較少。

中國人群絕大多數(shù)屬于蒙古人種。按照語系劃分，分屬漢藏、阿爾泰、印歐、南亞、侗臺、苗瑤、南島語系[17]，各語系人群呈現(xiàn)出地域分布和色素特征的差異。已有研究[18]表明，東亞人群的遺傳結構與語系分布具有對應關系。本研究利用HIrisPlex-S體系，對分布在中國7大地理區(qū)域的6個語系的17個人群進行眼睛、頭發(fā)、皮膚顏色相關SNP位點的分型檢驗和表型推斷分析，旨在為我國法醫(yī)人類學提供各語系人群的色素表型參考數(shù)據(jù)，并為法醫(yī)遺傳學的外貌推斷技術提供人群及色素表型的劃分依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究人群

中國漢族（廣東、河北、四川）、哈薩克族、蒙古族等共17個人群2666份男性DNA樣本，生物樣本來源于公安部物證鑒定中心國家科技資源共享服務平臺計劃項目（YCZYPT[2017]01-3）的人群樣本庫，所有志愿者均依照公安部物證鑒定中心倫理委員會規(guī)定簽署知情同意書。2666份樣本的人群和語系等信息見表1。

17個人群樣本分屬六大語系七大地理區(qū)域：西北地區(qū)印歐語系的塔吉克族、阿爾泰語系的維吾爾族、哈薩克族；東北地區(qū)阿爾泰語系的蒙古族、錫伯族；華南地區(qū)苗瑤語系的苗族、瑤族，侗臺語系的侗族、壯族以及漢藏語系的廣東漢族；華東地區(qū)苗瑤語系的畬族；華北地區(qū)漢藏語系的河北漢族；西南地區(qū)漢藏語系的四川漢族、藏族、彝族以及南亞語系的佤族。

表1 17個人群的樣本信息

1.2 DNA提取、定量

采用QIAamp DNA Blood Mini試劑盒（德國Qiagen公司）提取DNA，使用NanoDrop 2000c分光光度計（美國Thermo Scientific公司）進行DNA定量。以去離子滅菌水調整DNA質量濃度至5ng/μL。

1.3 HIrisPlex-S復合體系的構建

根據(jù)已報道的引物序列和體系構建方法[11，19]，在實驗室構建HIrisPlex-S復合擴增體系用于DNA樣本的分型檢驗。41個SNP位點分為24和17兩個體系（圖1），其中S1-EX、S3-EX、S4-EX、S10-EX、S21-EX、S22-EX、S24-EX共7個位點的延伸引物改變了多聚t數(shù)目。

圖1 HIrisPlex-S的41個SNP位點基因分型圖譜

1.4 人群樣本的DNA分型檢測

PCR擴增使用ABI PRISM?SNaPshotTMMultiplex試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），5 μL反應體系包含：10×PCR緩沖液（15mmol/L Mg2+）0.5μL、MgCl2（25 mmol/L Mg2+） 0.7 μL、dNTP（10 mmol/L）0.05 μL、PCR 引物混合物 0.5 μL、HotstarTaq plus（5 U/μL）（德國 Qiagen 公司） 0.2 μL、DNA（5 ng/μL）2 μL、ddH2O 1.05 μL。在 96 孔 PCR 儀 Mastercycler Pro Eppendorf?熱循環(huán)儀（德國Eppendorf公司）上進行熱循環(huán)實驗，條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃30s，72℃ 1min，40個循環(huán)；72℃ 10min。PCR擴增結束后，將核酸外切酶Ⅰ（Exo Ⅰ）（10U/μL）0.2μL、蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP；美國 Affymetrix公司）（1 U/μL） 1 μL、10×SAP 緩沖液0.3μL、去離子水1.5μL加入2μL PCR產(chǎn)物中。將混合物37℃孵育30 min，96℃酶純化10 min，去除過量引物和未結合脫氧核苷酸。

純化后的產(chǎn)物進行延伸反應，在5 μL反應體系下，用單堿基延伸（single base extension，SBE）實現(xiàn)SNP基因座的微測序。包括2.5 μL的反應混合物、1.5 μL純化PCR純化產(chǎn)物、0.3 μL SBE引物混合物、0.7 μL ddH2O。熱循環(huán)參數(shù)：96 ℃ 2 min；50℃ 5 s，60℃ 30 s，25個循環(huán)。延伸產(chǎn)物需經(jīng)SAP純化。用0.5 μL SAP在37℃孵育60 min，再用75℃的酶滅活15min，滅活過量熒光標記的dNTPs。

V（內標LIZ 120）∶V（甲酰胺）為30∶1000的混合液9μL與1μL的DNA產(chǎn)物混合，在3130xl基因分析儀（美國AB公司）上進行電泳，結果采用GeneMapper?IDv3.2軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行基因分型。分型圖譜如圖1所示。采用Modified-PowerStates軟件[20]計算Hardy-Weinberg平衡檢驗。

1.5 色素表型在線推斷

將檢測出的SNP分型按照色素表型在線推斷模型（https://HIrisPlex.erasmusmc.nl/）要求的格式整理上傳，計算后得到每個樣本眼睛顏色（藍色、中間色、棕色）、頭發(fā)顏色（紅色、金色、棕色、黑色）、膚色（極白色、白色、中等色、深色、較黑-黑色）的概率。參照推斷模型使用說明及相關文獻[9，11，21]，對眼睛、頭發(fā)顏色、膚色進行判讀。

眼睛顏色推斷：輸入分型后，模型會對每個樣本輸出3種眼睛顏色概率數(shù)據(jù)（P值）。選取P值最大的表型為推斷結果。

頭發(fā)顏色推斷：輸入分型后，模型會對每個樣本輸出4種頭發(fā)顏色概率數(shù)據(jù)（P值）和頭發(fā)深淺概率數(shù)據(jù)（P值）。使用分步推斷法，綜合4種顏色中的最大P值和顏色深淺P值進行判讀。

皮膚顏色推斷：輸入分型后，模型會對每個樣本輸出5種皮膚顏色的概率數(shù)據(jù)（P值）。膚色顏色判讀比較復雜，需要使用分步推斷法，綜合較大的前兩位膚色P值進行綜合推斷。一般來說，當?shù)诙籔值膚色比第一位P值膚色更深時，會對結果產(chǎn)生影響；第二位P值膚色較淺時不對第一位P值膚色產(chǎn)生影響。對于中等及更淺的膚色，第二位P值是否大于0.15也會對判讀結果有影響。

采用SPSS 17.0軟件分別對阿圖什和伊寧的維吾爾族頭發(fā)顏色以及對于不同人群、語系、地域的皮膚顏色進行χ2檢驗。檢驗水準α=0.01。

2 結 果

2.1 眼睛顏色的推斷結果

運用自主構建的HIrisPlex-S復合擴增體系檢測2666份樣本。41個SNP位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），共獲得109 306個SNP位點的分型結果，上傳至HIrisPlex-S在線推斷模型。參照色素表型分類標準對輸出的數(shù)據(jù)進行分析判讀，獲得所有個體的色素表型推斷結果。從眼睛顏色的推斷結果（表2）來看：印歐語系和阿爾泰語系突厥語族的4個亞歐混合人群（塔吉克族、阿圖什維吾爾族、伊寧維吾爾族和哈薩克族）有18個藍色眼睛的個體，占1.917%；其他人群眼睛均為棕色，沒有表型差異。

表2 眼睛顏色表型推斷結果 （例）

2.2 頭發(fā)顏色的推斷結果

從頭發(fā)顏色的推斷結果（表3）來看，只有亞歐混合人群具有頭發(fā)顏色表型多樣性，除了蒙古族人群有2個深棕色-黑色頭發(fā)個體，其他人群的頭發(fā)顏色均為黑色。從圖2可以看出4個亞歐混合人群的頭發(fā)顏色分類比例。塔吉克族黑色頭發(fā)個體最少，約占41.414%，棕色、深棕色（包括深棕色-黑色和棕色-深棕色兩類）約占57.576%，金色、深金色約占1.010%；阿圖什維吾爾族黑色頭發(fā)約占75.758%，棕色、深棕色約占24.242%；伊寧維吾爾族黑色頭發(fā)約占72.052%，棕色、深棕約占27.948%；哈薩克族黑色頭發(fā)個體最多，約占84.615%，棕色、深棕色約占14.835%，金色、深金色約占0.549%。南疆（阿圖什）和北疆（伊寧）的維吾爾族人群頭發(fā)顏色表型分類沒有差異（χ2=0.819，P=0.366）。

圖2 4個亞歐混合人群的頭發(fā)顏色分類比例

表3 頭發(fā)顏色表型預測分類結果 （例）

2.3 皮膚顏色的推斷結果

從皮膚顏色推斷結果（表4）來看，中國不同人群的膚色具有明顯的表型多樣性（圖3），塔吉克族、阿圖什維吾爾族、伊寧維吾爾族、哈薩克族有白色至中等偏淺膚色個體，其他各人群自中等膚色至較黑-黑膚色個體均有一定的分布比例。結果呈現(xiàn)出顯著的人群、語系和地域的差異分布（P＜0.01）。

在本研究的2 666個樣本中，白膚色個體共有5例，來自塔吉克族和伊寧維吾爾族。從17個人群的膚色分類比例柱狀圖來看（圖3A），只有4個亞歐混合人群存在淺膚色（白+中等偏淺膚色）個體，且呈現(xiàn)出典型的混合人群特點：各類皮膚顏色的個體都占有一定比例，分布較為平均。苗、畬、瑤、侗、壯族及不同地區(qū)的3個漢族人群都以中等+中等偏深膚色為主，占人群總數(shù)的56.768%，深膚色占比較低。藏、彝、佤族人群膚色較深，以較黑-黑膚色為主；其中佤族的較黑-黑膚色比例占到57.426%。蒙古族人群中等+中等偏深、深+深-較黑膚色和較黑-黑膚色人群為38.519%、30.000%和31.481%，約各占1/3；錫伯族人群膚色分布比例與蒙古族相似，但中等膚色比例略高，為49.444%。

從語系和地理分布上來看（圖3B、3C），西北地區(qū)的印歐語系白+中等偏淺膚色個體最多（9.091%），較黑-黑膚色個體比例與淺膚色相近（11.448%）；同屬西北地區(qū)亞歐混合人群的阿爾泰語系突厥語族有少數(shù)淺膚色個體（5.296%），膚色整體更深，與印歐語系之間差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=19.437，P=0.002）。阿爾泰語系的通古斯與蒙語族同屬東北地區(qū)，膚色比例差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.819，P=0.366）。生活在華南地區(qū)及華東南部的苗瑤語系和侗臺語系中等膚色比例過半，是整體膚色較淺的兩個群體。同為漢藏語系的藏緬語族與漢語族差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=179.189，P＜0.001），漢語族多數(shù)人為中等膚色（53.823%），而藏緬語族以深膚色、深-較黑膚色和較黑-黑膚色為主（83.186%）。藏緬語族（藏族、彝族）和南亞語系（佤族）所生活的四川、西藏、云南等地同屬于西南地區(qū)。南亞語系人群膚色更深，以較黑-黑膚色個體居多（57.426%），與藏緬語族膚色比例差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=16.510，P=0.002）。17個人群之間的卡方檢驗結果為χ2=667.506，P＜0.001；六大語系人群之間的χ2檢驗結果為χ2=615.558，P＜0.001；七大地理區(qū)域人群之間的χ2檢驗結果為χ2=570.975，P＜0.001。

表4 膚色表型預測分類結果 （例）

圖3 各人群膚色推斷表型分布

3 討 論

國際上已有的關于色素表型的研究大多基于歐洲人群，對于東亞人群的研究較少。本研究通過構建包含41個色素表型相關位點的HIrisPlex-S體系，對中國7大地理區(qū)域6個語系17個人群樣本進行了DNA分型檢測和色素表型推斷。研究結果較全面地呈現(xiàn)了中國各語系人群的色素表型分布及差異情況，為我國法醫(yī)人類學和法醫(yī)遺傳學表型推斷研究提供了人群的色素表型參考信息。

根據(jù)本研究的結果，通過HIrisPlex-S體系推斷出的人群色素表型與對各人群色素特征的常識認知、法醫(yī)人類學對各人群色素特征的描述基本一致。中國僅有印歐語系和阿爾泰語系中的亞歐混合人群在眼睛和頭發(fā)顏色方面存在明顯分類差異，其中塔吉克族的歐源成分最高，其黑發(fā)個體占比最少，淺膚色個體占比最多。哈薩克族的歐源成分最低，黑發(fā)個體最多，沒有白膚色個體。通常認為南疆和北疆的維吾爾族人群存在外貌表型的差異，本研究中北疆伊寧維吾爾族推斷為棕色頭發(fā)個體更多且有白膚色個體，但總體而言與南疆阿圖什維吾爾族人群的色素表型十分接近。其他語系、語族的人群僅有膚色表型的多樣性，眼睛和頭發(fā)顏色沒有明顯差異。以上結果表明，眼睛、頭發(fā)顏色主要與遺傳背景及族源成分相關。

中國人群的膚色表型比較復雜，不僅與遺傳背景相關，還與中國獨特的地理環(huán)境相關。中國地區(qū)的全球水平輻照度（global horizontal irradiation，GHI）[22]顯示，喜馬拉雅山脈及與之緊鄰的青藏高原是平均輻照度最高的地方，其次是云貴高原及內蒙古高原，華東、華南地區(qū)輻照度較低，四川盆地則是全國輻照度最低的地區(qū)。本研究結果與膚色是紫外線輻照的適應性進化理論一致[23]，即生活在高輻照地區(qū)的人群膚色深，生活在低輻照地區(qū)的人群膚色淺。阿爾泰語系的蒙古族和錫伯族的膚色、遺傳背景和地理區(qū)域都比較相近，但生活在內蒙古高原的蒙古族人群深膚色的比例更高。漢藏語系中藏族、彝族兩個人群的采集地都位于川藏高原，以深膚色為主，居住海拔更高區(qū)域的藏族人群膚色更深。低輻照區(qū)域的四川及廣東漢族比華北地區(qū)的河北漢族膚色淺，華南地區(qū)的苗瑤、侗臺語系人群的膚色也較為白皙。南亞語系的佤族人在17個人群中膚色最深，除了其居住區(qū)域為云貴高原，也與南亞語系人群的族源歷史相關。

本研究結果證實，HIrisPlex-S色素推斷體系在中國人群中具有一定的適用性，中國不同語系和地域人群的色素表型有一定差異，其中膚色表型的差異更大。由于眼睛和頭發(fā)顏色相關位點是基于歐洲人群挖掘的，對亞歐混合人群有一定應用價值，但在東亞人群中的應用受限。后續(xù)研究基礎上需要進一步篩選和驗證中國人群色素相關的遺傳位點，確定適合中國人群的色素分類標準，優(yōu)化預測模型，使該技術可以更廣泛地用于我國的法醫(yī)物證學鑒定實踐。