間充質(zhì)干細(xì)胞治療婦科系統(tǒng)疾病的臨床研究進(jìn)展

豈航，許天敏

間充質(zhì)干細(xì)胞是一類擁有強(qiáng)大增殖再生潛能的干細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖特性和分泌功能為很多婦產(chǎn)科難治性疾病帶來了希望，同時(shí)先進(jìn)的生物學(xué)技術(shù)也為間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用提供了更廣闊的平臺(tái)。本文綜述了間充質(zhì)干細(xì)胞在婦科系統(tǒng)不同疾病治療中的應(yīng)用，以及利用外泌體和不同生物方法進(jìn)行干細(xì)胞治療的研究進(jìn)展。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究背景

間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有重復(fù)自我更新能力的，能夠多向分化的一類全能干細(xì)胞。干細(xì)胞在維持細(xì)胞再生和增殖方面起主要作用，有利于組織的修復(fù)和維護(hù)，對(duì)組織損傷和病變的恢復(fù)也能提供幫助[1]。目前在多種間充質(zhì)干細(xì)胞中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和月經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞等干細(xì)胞的研究最為廣泛[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源廣泛、易于分離、可操作性高、易于自體移植等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞因其強(qiáng)大的再生特性和修復(fù)特性，為各種疾病的治療帶來了新的思路，具有廣闊的前景[3]。

2 干細(xì)胞治療婦科疾病的種類

2.1 阿什曼綜合征

阿什曼綜合征是指重度宮內(nèi)粘連，是因子宮內(nèi)膜基底層損傷后被單層上皮取代導(dǎo)致子宮纖維化，從而部分或完全閉塞，即子宮腔粘連閉塞癥，是子宮不孕癥的主要原因[4]。子宮內(nèi)膜纖維化、鈣化、對(duì)激素?zé)o反應(yīng)和粘連等問題導(dǎo)致患者生育能力降低，目前主要的治療方法是宮腔鏡下粘連松解術(shù)、激素療法和宮腔放置物理屏障[5]。干細(xì)胞治療可以通過促進(jìn)血管生成、抑制纖維形成和炎癥反應(yīng)同時(shí)調(diào)整免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)來逆轉(zhuǎn)宮腔內(nèi)損傷[6]。實(shí)驗(yàn)表明，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可以使纖維化標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子蛋白的表達(dá)顯著降低，同時(shí)下調(diào)促炎癥因子干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素(IL)-2，證明干細(xì)胞可以延緩受損內(nèi)膜纖維化和炎癥的進(jìn)展。在移植了間充質(zhì)干細(xì)胞的受損子宮內(nèi)膜中檢測(cè)到細(xì)胞增殖標(biāo)志物 Ki-67在 UC-MSC 呈現(xiàn)陽性表達(dá)；子宮內(nèi)膜間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白和上皮標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白19表達(dá)上調(diào)，血管標(biāo)志物 CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子α和基質(zhì)金屬蛋白酶9均有顯著提高，表明子宮內(nèi)膜細(xì)胞和血管增殖修復(fù)得到提高[7]。前瞻性隊(duì)列研究也證實(shí)了干細(xì)胞對(duì)阿什曼綜合征有治療意義，不但增加了子宮內(nèi)膜厚度也增加了腺體數(shù)量，使患者的妊娠率和活產(chǎn)率都得到了提高[8]。

2.2 子宮瘢痕

子宮內(nèi)膜再生能力非常強(qiáng)大，可以反復(fù)通過子宮內(nèi)膜基底干細(xì)胞再生進(jìn)行修復(fù)，但是當(dāng)基底干細(xì)胞被損傷時(shí)子宮內(nèi)膜無法持續(xù)再生，纖維組織沉積在損傷部位形成子宮瘢痕，從而導(dǎo)致不孕、瘢痕妊娠和胎盤植入等問題[9]。基質(zhì)金屬蛋白酶參與膠原纖維的降解，有研究表明干細(xì)胞可以通過促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)來加速瘢痕的修復(fù)和膠原纖維的降解[10]。同時(shí)干細(xì)胞還可以促進(jìn)瘢痕部位血管生成因子VEGFA水平的提升，加速受損部位血管的生成從而促進(jìn)瘢痕再生重塑，提高子宮修復(fù)率[11]。

2.3 子宮內(nèi)膜癌

子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的惡性改變，與子宮內(nèi)膜基質(zhì)也有一定關(guān)系，用含有基底膜提取物的培養(yǎng)基培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系(Ishikawa)，當(dāng)培養(yǎng)基中腺苷核苷酸的使用量減少就證明癌細(xì)胞系的增殖受到抑制。Ishikawa細(xì)胞系在正常細(xì)胞分泌的激素刺激下分泌了抑制性蛋白，證明正常的細(xì)胞基質(zhì)可能抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖[12]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族成員，在Ishikawa細(xì)胞系中表達(dá)明顯增強(qiáng)，雌孕激素刺激Ishikawa的增殖可以通過PI3K/AKt/Survivin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑完成，Ishikawa在神經(jīng)干細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，Survivin的檢出率下降了23% 。正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞旁分泌的細(xì)胞因子可以顯著下調(diào)激素刺激的AKt磷酸化、抑制Survivin的表達(dá)，從而對(duì)腫瘤的無限增殖產(chǎn)生抑制和阻斷[13]。子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌因子應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的治療或許可以取得顯著的效果。

2.4 陰道脫垂

女性盆底支持組織退化、創(chuàng)傷導(dǎo)致其支持薄弱會(huì)發(fā)生盆底功能障礙導(dǎo)致盆腔內(nèi)結(jié)構(gòu)下降到陰道發(fā)生陰道脫垂[14]。人體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)蛋白-5(FBLN5)可以促進(jìn)彈性蛋白的形成，研究表明，干細(xì)胞可能通過促進(jìn)FBLN5的表達(dá)增強(qiáng)成纖維細(xì)胞彈性蛋白的形成來恢復(fù)陰道組織的強(qiáng)度[15]。在盆腔器官脫垂患者中，晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)會(huì)對(duì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，干細(xì)胞也可能通過增加抗炎因子的釋放反應(yīng)和激活PI3K/AKT/PTEN 信號(hào)通路來抑制AGE的細(xì)胞毒性并且促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖，從而增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的數(shù)量和功能來治療陰道脫垂[16]。在切除了卵巢的大鼠陰道內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞后，明顯提高了陰道固有層的Ⅰ型膠原、彈性蛋白和微血管密度，同時(shí)也使陰道肌層平滑肌細(xì)胞數(shù)量增多。干細(xì)胞可以顯著提高纖維蛋白、成纖維細(xì)胞以及血管的生成，應(yīng)用于盆腔器官脫垂的治療有很好的前景。

2.5 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指有過3次或者3次以上的自然流產(chǎn)，原因可能是免疫系統(tǒng)異常、內(nèi)分泌異?；蛘吲咛ト旧w異常等，但仍有半數(shù)的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)原因不明[17]。干細(xì)胞通過作用于T細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，使復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者Th1分泌的IFN-γ減少、Th2分泌的IL-4增加，Treg比例增加，同時(shí)可以抑制Th17分泌IL-17從而減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[18]。干細(xì)胞也可能使TREG相關(guān)基因上調(diào)，使胎兒處在免疫特權(quán)的微環(huán)境中來保護(hù)易流產(chǎn)小鼠的胎兒[19]。樹突細(xì)胞提高子宮內(nèi)膜容受性可以降低流產(chǎn)率，在小鼠受損子宮內(nèi)注射臍帶干細(xì)胞后，子宮上皮細(xì)胞分泌GM-CSF使樹突狀細(xì)胞向子宮內(nèi)膜運(yùn)輸并且刺激樹突細(xì)胞的分化和增殖，隨之檢測(cè)到子宮內(nèi)樹突細(xì)胞增加、表達(dá)的分泌因子也增多，流產(chǎn)率降低[20]。

2.6 卵巢功能下降

卵巢發(fā)生損傷或老化會(huì)導(dǎo)致功能下降從而引起激素分泌下降、排卵減少等問題，出現(xiàn)潮熱、盜汗、睡眠障礙等更年期癥狀甚至不孕癥[21]。BCL2是參與細(xì)胞抗凋亡的基因，BAX是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，腹腔注射干細(xì)胞后患者BCL2/BAX比值增高，并且實(shí)驗(yàn)證明卵母細(xì)胞的卵裂和成熟率都有所提高，抗氧化的基因表達(dá)也增高，說明干細(xì)胞有利于卵母細(xì)胞的增殖[22]，干細(xì)胞可能通過粒細(xì)胞集落刺激因子提高P-PI3K和P-AKt的表達(dá)從而對(duì)卵泡細(xì)胞和顆粒細(xì)胞起到保護(hù)作用[23]。在妊娠過程中，Th1細(xì)胞因子參與排斥反應(yīng)，而 Th2細(xì)胞因子與免疫耐受有關(guān)，干細(xì)胞可以抑制Th1的分泌和降低Th1/Th2的比值數(shù)，通過改善免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)子宮內(nèi)膜容受性[24]。同時(shí)，干細(xì)胞促進(jìn)血管生成和抗炎的作用也對(duì)卵巢功能的改善有很大幫助[25]。

2.7 多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征是一種常見的內(nèi)分泌綜合征，臨床上以高雄激素血癥、持續(xù)無排卵、卵巢多囊改變和胰島素抵抗為特征，患者也常表現(xiàn)有月經(jīng)稀發(fā)、不孕癥和肥胖[26]。在大鼠體內(nèi)注射干細(xì)胞的分泌物通過其旁分泌作用可以改善卵巢的病理結(jié)構(gòu)、恢復(fù)大鼠的生育功能，干細(xì)胞通過提高抗炎因子IL-10、INF-γ、TIMP來提高全身的抗炎作用從而改善多囊卵巢綜合征的炎癥反應(yīng)[27]。

2.8 輸卵管損傷

輸卵管是連接卵巢和子宮的管道，在排卵、受精、胚胎發(fā)育過程中都有重要的作用，但是盆腹腔及其內(nèi)部臟器的炎癥都有可能使輸卵管感染并影響其功能。輸卵管中的常駐干細(xì)胞在愈合和再生過程中發(fā)揮重要作用。在輸卵管受損的小鼠體內(nèi)注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，首先輸卵管遠(yuǎn)端的Prom1表達(dá)證明輸卵管遠(yuǎn)端的干細(xì)胞活躍度增加，有利于輸卵管損傷的修復(fù)；其次，提高了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和增殖細(xì)胞核抗原，促進(jìn)了細(xì)胞的再生和增殖；最后，干細(xì)胞還可以在DNA水平減少凋亡基因的激活，促進(jìn)抗凋亡因子的分泌，從而對(duì)輸卵管起到保護(hù)修復(fù)的作用[28]。在輸卵管缺血再灌注模型中，再灌注所引起的炎癥反應(yīng)可以使干細(xì)胞歸巢，支持組織愈合恢復(fù)并抑制凋亡，減少對(duì)輸卵管的傷害[29]。

3 干細(xì)胞治療婦科疾病的應(yīng)用方法

干細(xì)胞在婦科疾病治療中的應(yīng)用主要通過靜脈注射和直接放置在宮腔中兩種方式。干細(xì)胞可以通過靜脈注射的方式輸注到體內(nèi)，再經(jīng)過細(xì)胞遷移歸巢到子宮改善子宮微環(huán)境、治療疾病。也可以直接放置在子宮腔內(nèi)，留滯在子宮中發(fā)揮作用。這兩種方式雖然簡(jiǎn)單方便，但是滯留性、發(fā)揮功能的效率都有待提高，所以很多更加先進(jìn)的方式在被探索研究中。

3.1 建立子宮內(nèi)膜類器官三維模型

類器官是一種由祖細(xì)胞/干細(xì)胞自分化而形成的三維培養(yǎng)系統(tǒng)[30]，目前已經(jīng)可以由許多類型的組織器官干細(xì)胞產(chǎn)生，如腸、腎、前列腺等類器官[31-33]。類器官既可以作為模型來研究各種疾病的發(fā)生發(fā)展，也可以作為生物材料應(yīng)用于疾病治療，目前已經(jīng)證實(shí)可以采用非入侵的方法從月經(jīng)液獲取經(jīng)血干細(xì)胞衍生出類器官進(jìn)行研究[34]。連續(xù)表達(dá)FOXA2和SOX17兩種基因的子宮內(nèi)膜祖細(xì)胞具有分化為類器官的潛能，與模擬子宮宮腔形態(tài)的基質(zhì)膠共同培養(yǎng)后形成類器官。將形成的類器官植入受損的宮腔內(nèi)，類器官通過TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的作用使得子宮內(nèi)膜血管明顯增多、同時(shí)內(nèi)膜再生速度也明顯加快[35]，證實(shí)了類器官可以充分調(diào)動(dòng)干細(xì)胞分化的優(yōu)越性來治療子宮內(nèi)膜疾病。

3.2 與生物支架共同放置

生物支架在干細(xì)胞的應(yīng)用上具有良好的前景，干細(xì)胞放置在子宮內(nèi)，存在免疫排斥性和發(fā)揮作用緩慢等問題，生物支架不但可以給間質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)和分泌細(xì)胞基質(zhì)的空間，而且可以延長(zhǎng)干細(xì)胞在宮腔內(nèi)的留置時(shí)間。水凝膠是應(yīng)用較多的高水合聚合物類生物支架材料，可以通過親水性聚合物之間的化學(xué)、物理或生物化學(xué)交聯(lián)來維持其結(jié)構(gòu)交聯(lián)，從而維持穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，而且與組織間的相容性較大有利于其發(fā)揮生物功效[36]。高含水量聚合物的種類有很多，包括糖胺聚糖、明膠等天然/合成聚合物[37]以及細(xì)胞外基質(zhì)，可以應(yīng)用脫細(xì)胞技術(shù)制備特異性子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠支架，較其他高分子材料和非脫細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠有更強(qiáng)的組織相容性和更大的再生潛力[38]。干細(xì)胞可以通過細(xì)胞培養(yǎng)懸浮于水凝膠再通過用3D打印技術(shù)建造復(fù)雜的生物組織三維模型，可以改善干細(xì)胞的滯留性、穩(wěn)定性和分泌特性，為干細(xì)胞的生長(zhǎng)提供合適的空間[39]。

除了水凝膠以外，膠原蛋白也可以應(yīng)用，膠原支架結(jié)構(gòu)是多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為幾十到幾百微米，這些孔徑有利于細(xì)胞的旁分泌作用以及細(xì)胞自身的附著增殖。實(shí)驗(yàn)表明，移植之后子宮內(nèi)膜的增殖明顯增強(qiáng)、血管形成增加并且容受性也有所增加[40]。

3.3 干細(xì)胞球體排列

以球體形式聚集的間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)于單層排列的干細(xì)胞增殖能力減弱，從而發(fā)生DNA損傷的概率降低。并且當(dāng)干細(xì)胞以球體形式存在時(shí)，細(xì)胞的抗凋亡基因和自噬基因下調(diào)，細(xì)胞凋亡的易感性提高保障了受損細(xì)胞的程序性消除，這都證明3D模式的細(xì)胞具有更強(qiáng)的移植安全性[41]。在受到損傷時(shí)，球體形式排列的干細(xì)胞可能因缺氧應(yīng)激或者細(xì)胞更緊密等原因分泌出更多的抗炎因子及抗腫瘤分子來抑制炎癥反應(yīng)[42]，同時(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血管生成素的分泌也會(huì)增至10倍，表明以球體形式存在的干細(xì)胞也會(huì)促進(jìn)血管的再生[43]。在培養(yǎng)基中加入脂質(zhì)濃縮物使干細(xì)胞排列呈球形，細(xì)胞抗炎和促血管生成的DNA表達(dá)都增加，提高了干細(xì)胞促進(jìn)傷口恢復(fù)的潛能[44]。目前利用生物打印技術(shù)可以更加靈活快捷地構(gòu)架出干細(xì)胞球體結(jié)構(gòu)[45]并且已經(jīng)應(yīng)用于血液疾病和心肌梗死等方面的治療，對(duì)于子宮損傷的治療也同樣有巨大的前景。

3.4 使用干細(xì)胞外泌體

外泌體是細(xì)胞基質(zhì)中由真核細(xì)胞分泌的雙層脂質(zhì)囊泡，里面有包裹豐富的微小RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)來進(jìn)行細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)等。干細(xì)胞注入血液或者放置在子宮內(nèi)后，只有一小部分能夠在子宮內(nèi)轉(zhuǎn)化為上皮細(xì)胞發(fā)揮作用，所以細(xì)胞外基質(zhì)中的外泌體可能是干細(xì)胞發(fā)揮作用的主要方式[46]。許多實(shí)驗(yàn)也證明了干細(xì)胞的作用是通過細(xì)胞外基質(zhì)中外泌體發(fā)揮的，并且在肺纖維化、腎損傷等治療中取得了良好的效果[47]。外泌體可能通過減少TGF-β與細(xì)胞膜上的 TGF-β 受體結(jié)合，繼而減少Smad蛋白家族的磷酸化,使其無法形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，誘導(dǎo)間質(zhì)內(nèi)皮化的基因表達(dá)就會(huì)下調(diào)，從而改善子宮內(nèi)皮的纖維化程度[48]。也有實(shí)驗(yàn)證明外泌體應(yīng)用于子宮內(nèi)膜損傷可以明顯促進(jìn)腺體細(xì)胞數(shù)量的增多和纖維細(xì)胞的減少[49]。應(yīng)用外泌體治療疾病可以解決干細(xì)胞致瘤性、增殖分化后分泌功能下降、植入率低等問題，應(yīng)用于臨床可以更方便快捷地治療疾病。也可以將外泌體直接放置于水凝膠中，在受損子宮內(nèi)放置載有外泌體的水凝膠支架，相較不含外泌體的水凝膠支架更能增加內(nèi)膜的厚度以及腺體的數(shù)量，加速宮腔粘連的修復(fù)過程[50]。

3.5 干細(xì)胞載體微球

載體微球是將載體材料制作成球型結(jié)構(gòu)，通過注射的微創(chuàng)方法導(dǎo)入體內(nèi)，應(yīng)用載體微球?qū)敫杉?xì)胞不但能解決干細(xì)胞在子宮內(nèi)滯留性差、細(xì)胞活力受損傷的問題，還有創(chuàng)傷小、操作方便、侵入性低等優(yōu)點(diǎn)[51]。微球表面可以開放很多微孔為干細(xì)胞提供適宜的增殖分化的微環(huán)境，微球的內(nèi)部空間也可以被加以利用來幫助干細(xì)胞提高活性。經(jīng)過微球富集之后的干細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)，小鼠的子宮內(nèi)膜細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖性和遷移性，并且血管生成也有提高[52]。將載有間充質(zhì)干細(xì)胞的基質(zhì)凝膠微球注射到大鼠子宮受損的子宮內(nèi)膜后，子宮內(nèi)膜的厚度顯著增加，生育率也提高了50%[53]。干細(xì)胞微球有強(qiáng)大的微創(chuàng)性和有效性，有望建立一種廣譜的間充質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)。

3.6 干細(xì)胞片

干細(xì)胞在敏感的細(xì)胞培養(yǎng)皿生成完整無支架的細(xì)胞致密組織，可以黏附在生物細(xì)胞膜的表面，即具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性，又保證了干細(xì)胞的密度和存活率、避免了支架降解后的免疫性問題[54]。干細(xì)胞片相較于單個(gè)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活率增加了10倍，已經(jīng)證實(shí)皮膚修復(fù)過程中可以迅速促使創(chuàng)傷愈合、減少瘢痕。干細(xì)胞片還可以進(jìn)行堆疊形成多層細(xì)胞片，堆疊后細(xì)胞間通訊傳遞會(huì)增強(qiáng)、促進(jìn)愈合的能力也會(huì)提高[55]。將干細(xì)胞片移植到子宮切開術(shù)后的小鼠體內(nèi)，子宮肌層再生能力得到提高，纖維形成的面積顯著減少[56]。將3D技術(shù)與細(xì)胞片技術(shù)聯(lián)合使用可能為干細(xì)胞片移植提供更廣闊的應(yīng)用范圍。

間充質(zhì)干細(xì)胞的研究已經(jīng)在許多國(guó)家開展，隨著間充質(zhì)干細(xì)胞及其相關(guān)技術(shù)的日益成熟，我國(guó)也批準(zhǔn)了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，走上了間充質(zhì)干細(xì)胞核心技術(shù)研發(fā)的舞臺(tái)。因其具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能且來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化等特點(diǎn)，現(xiàn)已逐步應(yīng)用于臨床。