低能N+注入誘變選育弱后酸化保加利亞乳桿菌

那治國(guó)，唐敬思，王紅梅，錢 鐳，軒詩(shī)濤

（1.黑龍江東方學(xué)院 食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150066；2.黑龍江東方學(xué)院 總務(wù)處，黑龍江 哈爾濱 150066）

酸奶作為最主要的發(fā)酵乳制品，因其具有特殊的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)與保健價(jià)值，深受消費(fèi)者的青睞[1]。近年來(lái)，我國(guó)酸奶的市場(chǎng)規(guī)模逐年上升，2017年銷售額已達(dá)1 220億元，首次超越牛奶，且每年仍以20%左右的速度快速增長(zhǎng)，是最具發(fā)展?jié)摿Φ娜橹破分籟2]。然而，由于酸奶是經(jīng)保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Strep tococcus thermophilus）共同發(fā)酵而制得的活菌型產(chǎn)品，在正常發(fā)酵結(jié)束后的貯藏、運(yùn)輸和消費(fèi)過(guò)程中，酸奶的pH值會(huì)繼續(xù)下降，出現(xiàn)后酸化現(xiàn)象，使產(chǎn)品酸味過(guò)重和感官質(zhì)量下降，在一定程度上限制了酸奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-4]。

目前，控制酸奶后酸化的主要方法有添加天然防腐劑、抑制劑等外源物，調(diào)整球桿菌比例，改善工藝水平，改變細(xì)胞膜的通透性，采用基因工程和人工誘變育種技術(shù)等[5-8]。其中，添加外源物、調(diào)整球桿菌比例、改善工藝水平等措施雖然能在一定程度上控制后酸化現(xiàn)象，但酸奶的特有風(fēng)味和質(zhì)量將大大降低[8-11]。徹底解決酸奶后酸化問(wèn)題的關(guān)鍵是獲得低溫、低pH值條件下產(chǎn)酸弱的菌株，雖然基因工程技術(shù)在菌種的改良上具有顯著效果，但由于合成乳酸的基因非常復(fù)雜，目前尚不是很清楚，因此，該方法很難實(shí)現(xiàn)[12-13]。而誘變育種尤其是離子注入誘變技術(shù)，因其具有育種速度快、操作簡(jiǎn)單及高效、高定向性、損傷輕、突變譜廣等特點(diǎn)，因而在優(yōu)良菌種的選育領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[14-15]，然而，關(guān)于N+注入誘變技術(shù)在弱后酸化酸奶發(fā)酵菌種選育中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。另外，由于德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）保加利亞亞種是酸奶后期發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌群，耐酸性較強(qiáng)，是導(dǎo)致后酸化的主要菌種[16-17]，因此，選育弱后酸化的保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus），可有效解決酸奶的后酸化問(wèn)題。

本研究以保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）DL1為出發(fā)菌株，采用低能N+注入誘變技術(shù)，并用青霉素處理，選育低pH值條件下產(chǎn)酸弱的菌株，以求有效解決酸奶后酸化問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）DL1：本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏；MRS液（固）培養(yǎng)基（pH值6.2）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；脫脂乳培養(yǎng)基：12%還原脫脂乳（雀巢），95 ℃滅菌10 min。

1.1.2 生化試劑

青霉素（純度99%）：武漢易泰科技有限公司上海分公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Model-1型多功能等離子體浸沒(méi)離子注入裝置：哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院；2120UV型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：韓國(guó)美卡希斯有限公司；S210-B型酸度計(jì)：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；CL-32L型自動(dòng)高壓滅菌器：日本ALP公司；TGL-16型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 保加利亞乳桿菌DL1生長(zhǎng)曲線的繪制

菌種活化：將實(shí)驗(yàn)室保存的保加利亞乳桿菌DL1接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、140 r/min條件下培養(yǎng)，按照3%（V/V）的接種量每24 h傳代一次，共傳代三次。

生長(zhǎng)曲線的繪制：將活化后的保加利亞乳桿菌DL1接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、140 r/min條件下培養(yǎng)14 h。按2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量為30 mL/250 mL，37 ℃、140 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取出5 mL發(fā)酵液，適當(dāng)稀釋后測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值，繪制保加利亞乳桿菌DL1的生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 低能N+注入誘變處理

菌膜的制備：將活化后的保加利亞乳桿菌DL1接種于于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、140 r/min條件培養(yǎng)10～12 h，制成細(xì)胞濃度約為1×108CFU/mL的菌懸液。取0.2 mL菌懸液涂布于無(wú)菌小培養(yǎng)皿內(nèi)，無(wú)菌室下自然風(fēng)干，鏡檢，菌體無(wú)重疊后進(jìn)行N+注入。

N+注入誘變處理[14]：將菌膜置于N+注入機(jī)中，在真空度為0.6 Pa，注入能量為25 keV，注入劑量為0～2.5×1015ions/cm2的條件下進(jìn)行氮離子注入，同時(shí)以真空為對(duì)照。誘變后用1mL無(wú)菌生理鹽水洗脫小培養(yǎng)皿中的菌體，得到誘變后的菌懸液。菌懸液經(jīng)梯度稀釋、涂布培養(yǎng)后按平板菌落計(jì)數(shù)法[17]進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算不同注入劑量菌株的致死率，繪制致死率曲線，從中選取最佳注入劑量。致死率計(jì)算公式如下：

1.3.3 青霉素處理

參照HOFHERR L A等[18]的方法。將N+注入處理后的菌株制備成菌懸液，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、140 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，25 ℃條件下10 000×g離心10 min，收集菌體，懸浮于pH 4.3、含有2.0 mg/mL青霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，42 ℃條件下分別處理1 h、2 h、3 h、4 h、5 h。處理后，離心收集菌體，制備菌懸液，并采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以未經(jīng)青霉素處理的為對(duì)照，計(jì)算致死率，其計(jì)算公式如下：

1.3.4 弱后酸化菌株的篩選

將青霉素處理后制備的菌懸液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑選菌落分布均勻，且菌落數(shù)在100～300個(gè)之間的平板，通過(guò)平板印影法分別接種到pH值為4.3和4.8的MRS固體培養(yǎng)基中，用保鮮膜密封，37 ℃培養(yǎng)。選取在pH 4.8條件下生長(zhǎng)，而在pH 4.3條件下不長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢的菌落為目標(biāo)菌株，并以出發(fā)菌株為對(duì)照，進(jìn)行脫脂乳發(fā)酵及貯藏產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，比較其在貯藏過(guò)程中pH值的變化。

1.3.5 菌株脫脂乳發(fā)酵產(chǎn)酸及后酸化驗(yàn)證

將初步篩選出的突變菌株傳代2次，制作發(fā)酵劑。以出發(fā)菌株DL1為對(duì)照，接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，在42 ℃條件下發(fā)酵8 h，每隔2 h測(cè)定pH值，觀察其發(fā)酵產(chǎn)酸情況。待pH值至4.6時(shí)取出，于4 ℃冷藏12 h后置于25 ℃條件下保藏72 h，每隔12 h測(cè)定pH值，繪制72 h的pH值變化曲線，觀察其貯藏過(guò)程中的酸度變化情況，篩選25 ℃保藏期間產(chǎn)酸慢的菌株。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將篩選出的突變菌株在MRS培養(yǎng)基中連續(xù)傳8代，分別將第3代和第8代的菌株以2%（V/V）的接種量接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，42 ℃條件下發(fā)酵，待pH值達(dá)4.6后，4 ℃冷卻，25 ℃保藏72 h，每隔12 h測(cè)定pH值，以出發(fā)菌株DL1為對(duì)照，觀察突變菌株遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌DL1的生長(zhǎng)曲線

誘變處理時(shí)，一般要求出發(fā)菌株應(yīng)處于菌體生長(zhǎng)狀態(tài)同步、易于變異、重復(fù)性較好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期?？疾毂＜永麃喨闂U菌DL1的生長(zhǎng)曲線，確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 保加利亞乳桿菌DL1的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus bulgaricus DL1

由圖1可知，保加利亞乳桿菌DL1在MRS培養(yǎng)基中啟動(dòng)較快，延遲期較短，4 h后進(jìn)入快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h后菌種生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，因此，確定保加利亞乳桿菌DL1的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為4～12 h。另外，為了增加可能變異的細(xì)胞數(shù)，需保證出發(fā)菌株具有一定的細(xì)胞濃度，因此，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中后期菌株進(jìn)行誘變處理，即培養(yǎng)時(shí)間為10～12 h。

2.2 N+注入劑量對(duì)保加利亞乳桿菌DL1致死率的影響

圖2 不同氮離子注入劑量下保加利亞乳桿菌DL1的致死率曲線Fig.2 Lethality rate curve of Lactobacillus bulgaricus DL1 under different nitrogen ion implantation dose

由圖2可知，在注入能量為25 keV，N+注入劑量為0～1.0×1015ions/cm2條件下，隨著注入劑量的增大，保加利亞乳桿菌DL1的致死率迅速升高，而N+注入劑量在1.0～1.5×1015ions/cm2之間時(shí)，致死率隨N+注入劑量的升高出現(xiàn)小幅度的降低，而后隨著N+注入劑量的進(jìn)一步升高致死率顯著上升，致死率曲線呈現(xiàn)典型的“馬鞍型”[14]。這主要是由于N+注入劑量較低時(shí)僅會(huì)損傷細(xì)胞表面，而隨著N+注入劑量的增加，細(xì)胞膜上沉積離子的能量和質(zhì)量可能會(huì)對(duì)細(xì)胞骨架造成破壞，并間接誘導(dǎo)核仁的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，致死率迅速上升，當(dāng)N+注入劑量進(jìn)一步上升達(dá)到一定數(shù)量后，細(xì)胞的自我修復(fù)功能被激活，致死率有所降低，當(dāng)N+注入劑量增加到引起的細(xì)胞復(fù)雜損傷超過(guò)細(xì)胞修復(fù)能力時(shí)，菌株致死率再次升高[19]。由于最佳的N+注入劑量應(yīng)該在致死率曲線波谷區(qū)域，故確定保加利亞乳桿菌DL1的最佳N+注入劑量為1.5×1015ions/cm2。

2.3 青霉素處理?xiàng)l件的確定

N+注入誘變處理后的菌液，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)10 h后，在pH 4.3、42 ℃條件下，經(jīng)2.0 mg/mL青霉素處理不同時(shí)間的致死率見(jiàn)圖3。

由圖3可知，采用2.0 mg/mL的青霉素處理能選擇性地殺死在42 ℃、pH 4.3條下生長(zhǎng)的保加利亞乳桿菌，從而達(dá)到濃縮低pH值條件下不生長(zhǎng)菌株的目的[18]。另外，GORINI L等[20]研究表明，青霉素對(duì)細(xì)菌的致死率在50%左右時(shí)，對(duì)菌株的濃縮效果最好。因此，采用2.0 mg/mL青霉素對(duì)誘變后的菌株在42 ℃條件下處理2 h。

圖3 青霉素處理時(shí)間對(duì)誘變菌株致死率的影響Fig.3 Effect of penicillin treatment time on lethality rate of mutant strain

2.4 弱后酸化突變菌株的篩選

在“印影”平板上挑取在pH 4.8條件下生長(zhǎng)，而在pH 4.3條件下不長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢的菌落35個(gè)，分別接種于脫脂乳試管中，42 ℃條件下培養(yǎng)，觀察脫脂乳凝乳情況，直接淘汰不凝乳或凝乳較差的突變菌株26株。取凝乳效果較好的9株突變菌，分別標(biāo)記為DL1-1～DL1-9，傳代2次，制作發(fā)酵劑，以出發(fā)菌株DL1為對(duì)照進(jìn)行后酸化驗(yàn)證試驗(yàn)，比較貯藏過(guò)程中各管的pH值變化。最終篩選出在25 ℃下產(chǎn)酸緩慢的突變菌株DL1-3。

2.5 突變菌株DL1-3在脫脂乳中發(fā)酵產(chǎn)酸能力

圖4 42 ℃條件下菌株DL1及DL1-3在脫脂乳中的pH值變化Fig.4 pH change of strain DL1 and DL1-3 in skimmed milk at 42 ℃

由圖4可知，42 ℃條件下菌株DL1與DL1-3在脫脂乳培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加pH值均逐漸下降，酸度增加。其中，突變菌株DL1-3的pH值下降速度較出發(fā)菌株DL1緩慢，尤其是在0～4 h，而4 h后突變菌株DL1-3的產(chǎn)酸量與出發(fā)菌株DL1逐漸接近，發(fā)酵培養(yǎng)6 h時(shí)，突變菌株DL1-3的pH值降至4.56，與出發(fā)菌株DL1的pH值沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。因此得出，42 ℃發(fā)酵12%脫脂乳時(shí)，雖然突變菌株DL1-3在前4 h產(chǎn)酸速度較慢，但4 h后產(chǎn)酸速度有所加快，6 h時(shí)與出發(fā)菌株DL1的產(chǎn)酸量差異較小。

2.6 突變菌株DL1-3發(fā)酵脫脂乳的后酸化性能

由圖5可知，菌株DL1-3與DL1發(fā)酵脫脂乳在25 ℃條件下貯藏時(shí)，隨貯藏時(shí)間的增加pH值均逐漸下降，但突變菌株DL1-3與出發(fā)菌株DL1相比，后酸化的程度在貯藏12 h后顯著降低（P＜0.05）。其中，突變菌株DL1-3發(fā)酵脫脂乳在常溫（25 ℃）條件下放置24 h，pH值仍能維持在4.1左右，貯藏72 h時(shí)pH值下降0.78，此時(shí)，pH值的降低（后酸化）程度比出發(fā)菌株DL1降低了18.8%。

圖5 菌株DL1-3和DL1發(fā)酵脫脂乳在25 ℃條件下貯藏時(shí)的pH值變化Fig.5 pH Change of skimmed milk fermented by strain DL1-3 and DL1 during storage at 25 ℃

2.7 突變菌株DL1-3的遺傳穩(wěn)定性

將突變菌株DL1-3在MRS培養(yǎng)基中連續(xù)傳代8次，考察突變菌株DL1-3第3代與第8代發(fā)酵脫脂乳的后酸化性能，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 突變菌株DL1-3第3代與第8代發(fā)酵脫脂乳在25 ℃條件下貯藏時(shí)pH值的變化Fig.6 pH change of skimmed milk fermented by the third and eighth generations of mutant strain DL1-3 during storage at 25 ℃

由圖6可知，突變菌株DL1-3第3代和第8代發(fā)酵脫脂乳在25 ℃條件下貯藏時(shí)，pH變化曲線沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，突變菌株DL1-3具有良好的穩(wěn)定遺傳性能。

3 結(jié)論

采用低能N+注入技術(shù)，以保加利亞乳桿菌DL1為出發(fā)菌株，在最佳注入劑量（1.5×1015ions/cm2）的條件下進(jìn)行誘變，并用2.0 mg/mL青霉素處理2 h，通過(guò)篩選獲得一株后酸化能力較弱的突變菌株DL1-3，其后酸化程度比出發(fā)菌株DL1降低18.8%，且在42 ℃條件下發(fā)酵脫脂乳的產(chǎn)酸能力與出發(fā)菌株DL1差異較小，同時(shí)具有良好的遺傳穩(wěn)定性。