乳桿菌發(fā)酵酸芋荷的工藝研究

朱 苗，鄂君威，胡菊麗，李 麗，李剛鳳

（銅仁學院 材料與化學工程學院，貴州 銅仁 554300）

芋荷梗為單子葉天南星科芋（Colocasia esculentaSchott）的葉柄，含有葉綠素、氨基酸、維生素C等多種營養(yǎng)物質(zhì)，含有優(yōu)質(zhì)的膳食纖維[1-4]。因其含有刺激性澀味影響食用沒有得到有效利用[5]，而貴州印江芋荷種植面積大，當?shù)剞r(nóng)家通常將芋荷梗加以一定量的辣椒、大蒜等輔料，腌制成酸芋荷，傳統(tǒng)工藝傳承已久，色香味俱全，廣受歡迎，但發(fā)酵時間較長，保存期短。

乳酸菌在食品加工中的應(yīng)用非常廣泛，不僅可以縮短發(fā)酵時間，延長食物的保存期，使食物的營養(yǎng)成分得到保留[6]；而且在維持人體腸道正常的微生態(tài)平衡中起到了不可替代的作用，作為人體極其重要的生理菌群，與機體健康緊密聯(lián)系，經(jīng)過發(fā)酵的乳酸菌還能分解膽鹽為解聚態(tài)，使膽固醇含量降低[7-8]。在蔬菜發(fā)酵過程中會代謝產(chǎn)生乳酸、酒石酸和亞硝酸還原酶等[9]，使發(fā)酵環(huán)境的pH下降，從而抑制酶活和雜菌生長[10-11]，降低了因傳統(tǒng)自然發(fā)酵造成亞硝酸鹽含量超標而嚴重危害人體健康的現(xiàn)象[12-14]。因此，利用乳酸菌結(jié)合輔料發(fā)酵芋荷梗，彌補發(fā)酵周期長，貯藏時間短，營養(yǎng)價值流失快的缺點，還帶來了更多對人體健康有好處的優(yōu)點。

本研究以芋荷梗為原料，通過添加乳酸菌、蔗糖、姜、蒜、辣椒等輔料進行發(fā)酵，利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵芋荷梗，旨在改善傳統(tǒng)自然發(fā)酵芋荷梗發(fā)酵周期長、質(zhì)量不穩(wěn)定和食用安全性差等問題，為銅仁地區(qū)工業(yè)化、規(guī)模化、標準化利用乳酸菌純種發(fā)酵芋荷梗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原輔料與菌種

芋荷梗、食鹽、蔗糖、生姜、小米椒、大蒜均為銅仁市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：善恩康生物科技（蘇州）有限公司。

1.1.2 化學試劑

鹽酸、氨水、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、硝酸鉀（均為分析純）、MRS固體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MAX-C30002電子分析天平：深圳市無限量衡器有限公司；PHS-3E酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；DPN-9082-1A電熱恒濕培養(yǎng)箱：常州普天儀器執(zhí)照有限公司；GZ-250-S生化培養(yǎng)箱：金壇市科析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌發(fā)酵酸芋荷工藝流程及操作要點[15-17]

挑選：選取新鮮度、成熟度一致，大小均勻、組織緊密，不萎蔫，無腐爛，無損傷，顏色鮮艷，脆性好的芋荷梗。

清洗、切分：清洗掉污泥和附著在芋荷梗表面上的渣滓，浸泡10 min。將芋荷梗的老根和尖端部分去除，將芋荷梗切分成3～5 cm的長度，盡量保持所切分的芋荷梗外觀形態(tài)一致。

空罐準備：玻璃罐用清水洗凈后再利用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30 min左右備用，保持罐內(nèi)的無菌環(huán)境。

漂燙、冷卻：將切分好的芋荷梗放入沸水中漂燙15～20 s至稍褪色后撈出，瀝干后放入事先準備好的空罐。用涼開水溶解所需要用的蔗糖和鹽，完全溶解后倒入罐中待漂燙后剩下的余溫全部冷卻。

裝罐、封罐：將經(jīng)過預(yù)處理的輔料（姜、蒜、辣椒）和乳酸菌粉依次放入罐中并注意保持適當?shù)捻斚抖龋?～5 cm）。先用保鮮膜封住罐口，罐蓋緊緊擰住后再用保鮮膜封住一層，以防止漏氣、跑氣。

發(fā)酵：先將恒溫箱提前調(diào)至所需要的溫度，再將封罐好的產(chǎn)品進行編號，整齊放入恒溫箱內(nèi)，在發(fā)酵過程中要嚴格控制好溫度，并定期檢查罐內(nèi)氣密性是否完好。

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

（1）發(fā)酵時間對酸芋荷品質(zhì)的影響

稱取5份25 g的芋荷梗，在食鹽添加量2%、蔗糖添加量2%、發(fā)酵溫度30 ℃、乳酸菌添加量0.2%的條件下進行封罐，放入電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)分別發(fā)酵2 d、3 d、4 d、5 d、6 d后，感官評定小組對發(fā)酵產(chǎn)品進行感官評價，并測定pH值。

（2）發(fā)酵溫度對酸芋荷品質(zhì)的影響

稱取5份25 g的芋荷梗，在食鹽添加量2%、蔗糖添加量2%、乳酸菌添加量0.2%，分別在28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃下發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵時間3 d，感官評定小組對發(fā)酵產(chǎn)品進行感官評價，并測定pH值。

（3）乳酸菌添加量對酸芋荷品質(zhì)的影響

稱取5份25 g的芋荷梗，在食鹽添加量2%、蔗糖添加量2%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間為3 d的條件下，分別添加0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%乳酸菌，封罐后放入電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行發(fā)酵，在發(fā)酵結(jié)束后，感官評定小組對發(fā)酵產(chǎn)品進行感官評價，并測定pH值。

（4）食鹽添加量對酸芋荷品質(zhì)的影響

稱取5份25 g的芋荷梗，在蔗糖2%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間為3 d、乳酸菌添加量為0.3%的條件下，分別添加食鹽添加量1%、2%、3%、4%、5%，封罐后放入電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行發(fā)酵，在發(fā)酵結(jié)束后，感官評定小組對發(fā)酵產(chǎn)品進行感官評價，并測定pH值。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計L9（34）對工藝進行優(yōu)化。設(shè)置4個影響因素即發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、乳酸菌添加量（C）、食鹽添加量（D），且每個影響因素各取3個水平，以pH值和感官評分作為評價標準，正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization

1.3.4 分析檢測

（1）感官評定[18-19]

組織10人成立感官評定小組，根據(jù)感官評分的標準對產(chǎn)品的品質(zhì)進行評定，取其平均值準確、完整地記錄，滿分為100分，評分標準見表2。

表2 酸芋荷感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented taro leafstalk

（2）安全性指標

亞硝酸鹽含量：參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中方法進行測定[20]；沙門氏菌和金黃色葡萄球菌：參照GB 2714—2015《食品安全國家標準醬腌菜》中方法進行測定[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對酸芋荷品質(zhì)的影響

由圖1可得出，隨著發(fā)酵時間的延長，感官評分呈先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵時間為3 d前，仍有雜菌在影響乳酸菌群的生長繁殖，發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸量、酯味、輔料產(chǎn)生的香辛味等未達到最佳的狀態(tài)，從而影響了發(fā)酵產(chǎn)品在氣味和滋味上的感官得分；發(fā)酵時間為3 d時，乳酸菌群占到了絕對的生長優(yōu)勢，發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸量、酯味、輔料產(chǎn)生的香辛味等達到最佳狀態(tài)，發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最高，為72分；在發(fā)酵時間＞3 d以后，乳酸菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸過量，發(fā)酵液環(huán)境越來越偏酸性，酸氣不斷增重，芋荷梗在過酸環(huán)境中，內(nèi)部組織開始變得松軟，失去脆性。所以發(fā)酵產(chǎn)品在氣味、滋味、質(zhì)地上的得分逐漸變低。在發(fā)酵時間2～5 d范圍內(nèi)，pH值呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢，其原因可能是隨發(fā)酵時間的不斷增長發(fā)酵液內(nèi)的乳酸菌不斷獲得生長優(yōu)勢并迅速生長繁殖。在此發(fā)酵過程中，乳酸量不斷增加，所以pH呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢。發(fā)酵時間為3 d時，pH值為4.27，在此pH值條件下，產(chǎn)品色澤均勻、光澤度好、有酯香味，風味獨特、口感酥脆、質(zhì)地良好。因此，綜合分析，選擇最佳發(fā)酵時間為3d。

圖1 發(fā)酵時間對酸芋荷品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of fermented taro leafstalk

2.1.2 發(fā)酵溫度對酸芋荷品質(zhì)的影響

由圖2可得出，隨著發(fā)酵溫度的升高，感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。發(fā)酵溫度＜30 ℃以前，乳酸菌的增長速度較緩慢，發(fā)酵產(chǎn)品所處的發(fā)酵環(huán)境不夠理想，產(chǎn)生的酯味氣體較少，輔料產(chǎn)生的香辛味不足。影響了在氣味和滋味上的感官評分；在發(fā)酵溫度達到30 ℃時，適合乳酸菌生長，且繁殖速度較快，產(chǎn)品發(fā)酵的環(huán)境理想，產(chǎn)生的乳酸量適宜，酯味氣體充足，輔料產(chǎn)生的香辛味濃郁，發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最高，為80分；在發(fā)酵溫度＞30 ℃以后，乳酸菌的生理活性開始受到抑制，芋荷梗在過酸環(huán)境下進行發(fā)酵，會發(fā)生褐變，從而得到的發(fā)酵產(chǎn)品色澤開始變得暗淡，無光澤，影響到了產(chǎn)品在色澤和滋味上的感官得分。pH值在發(fā)酵溫度28～36 ℃范圍內(nèi)呈下降的趨勢，其中28～30 ℃范圍內(nèi)pH值下降幅度較大是因為此階段溫度適宜乳酸菌生長繁殖，產(chǎn)生的乳酸速度較快。在30～36 ℃范圍內(nèi)，由于乳酸菌活性開始受到抑制，產(chǎn)生乳酸的速度開始變慢。發(fā)酵溫度為30 ℃時，pH值為3.1，在此條件下，產(chǎn)品色澤均勻、光澤度好、有酯香味，風味獨特、口感酥脆、質(zhì)地良好。因此，綜合分析，選擇最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對酸芋荷品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented taro leafstalk

2.1.3 乳酸菌添加量對酸芋荷品質(zhì)的影響

由圖3可得出，隨著乳酸菌添加量的增加，感官評分呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在乳酸菌添加量為0.10%～0.30%時，感官評分呈上升趨勢，是由于乳酸菌添加量越多，則發(fā)酵速度越快，產(chǎn)酸速度也越快，發(fā)酵液越快進入過酸環(huán)境，其形成的風味物質(zhì)和風味氣體的速度也在逐漸增加，從而影響到發(fā)酵產(chǎn)品在氣味和滋味上的感官得分；當乳酸菌添加量達到0.30%，此時的乳酸、風味物質(zhì)和氣體的量增加到最佳，感官評分最高，為82分；當乳酸菌添加量＞0.30%后，過大的添加量會導(dǎo)致發(fā)酵速度過快，而不利于風味物質(zhì)和氣體的產(chǎn)生。過酸的環(huán)境又會導(dǎo)致芋荷梗內(nèi)部組織變得松軟，失去脆性，感官評價在色澤、氣味、滋味上的得分逐漸變低。pH值在乳酸菌添加量0.15%～0.35%范圍內(nèi)快速下降后趨于平穩(wěn)的勢態(tài)，其原因可能是由于乳酸菌添加量在0.15%～0.20%內(nèi)乳酸菌發(fā)酵的增速最快，產(chǎn)乳酸量最快，在添加量＞0.20%后，隨著待發(fā)酵物質(zhì)的逐漸減少，而發(fā)酵速度還在增加，故發(fā)酵液環(huán)境會越來越趨于穩(wěn)定的狀態(tài)。乳酸菌添加量為0.30%時，pH值為2.93，在此pH值條件下，產(chǎn)品色澤均勻、光澤度好、有酯香味，風味獨特、口感酥脆、質(zhì)地良好。因此，選擇最佳乳酸菌添加量為0.30%。

圖3 乳酸菌添加量對酸芋荷品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus inoculum on the quality of fermented taro leafstalk

2.1.3 食鹽添加量對酸芋荷品質(zhì)的影響

由圖4可得出，隨著食鹽添加量的增加，感官評分呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在食鹽添加量2%以下時，容易滋生腐敗微生物，會影響乳酸菌產(chǎn)生特有的風味物質(zhì)和氣體，造成發(fā)酵產(chǎn)品的口感品質(zhì)下降，且此食鹽添加量下的產(chǎn)品，色澤度較差，質(zhì)地過硬，感官評分為63分；食鹽添加量為2%時，能抑制腐敗微生物的生長繁殖且乳酸菌得到較好的發(fā)酵環(huán)境，利于發(fā)酵產(chǎn)生風味物質(zhì)和氣體，且此食鹽添加量下的產(chǎn)品光澤度最好，有脆性，感官評分最高，為79分；食鹽添加量＞2%之后，隨著鹽濃度的增加，對乳酸菌的抑制效果也會增大，但風味變差。pH值在1%～5%食鹽濃度范圍內(nèi)，呈先下降后趨于平穩(wěn)的勢態(tài)。其原因可能是由于開始隨著食鹽濃度的增加，乳酸菌產(chǎn)乳酸量也在不斷增加，pH值下降幅度較大，當食鹽添加量過大時，對乳酸菌的生長抑制效果大于生長促進效果，產(chǎn)酸速度逐漸變小，故pH值開始趨于平穩(wěn)。食鹽添加量為2%時，pH值為3.46，在此pH值條件下，產(chǎn)品色澤均勻、光澤度好、有酯香味，風味獨特、口感酥脆、質(zhì)地良好。因此，綜合分析，選擇最佳食鹽添加量為2%。

圖4 食鹽添加量對酸芋荷品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of salt addition on the quality of fermented taro leafstalk

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計L9（34）對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。考察影響因素即發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、乳酸菌添加量（C）、食鹽添加量（D）對pH值和感官評分的影響，正交試驗結(jié)果與分析見表3。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization

由表3可知，影響乳酸發(fā)酵芋荷梗感官品質(zhì)的4個因素主要順序依次是乳酸菌添加量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞食鹽添加量，得出乳酸菌發(fā)酵芋荷梗的最佳組合是A1B2C2D2。影響乳酸發(fā)酵芋荷梗pH值的4個因素主要順序依次是乳酸菌添加量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞食鹽添加量，得出乳酸菌芋荷梗的最佳組合為A1B1C1D3。通過綜合分析得出芋荷梗乳酸菌發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝條件組合為A1B2C2D2，即乳酸菌添加量為0.3%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為3 d、食鹽添加量為2%。在此優(yōu)化條件下進行3次驗證試驗，感官評分平均值為84分，pH值為3.29。

2.3 安全性指標檢測

乳酸發(fā)酵酸芋荷中亞硝酸鈉含量為6.25 μg/g，未檢出沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，滿足相關(guān)國標要求。

3 結(jié)論

以芋荷梗為原料，添加輔料，利用乳酸菌進行發(fā)酵，并通過單因素試驗與正交試驗來探究芋荷梗乳酸菌發(fā)酵的加工工藝。得出乳酸菌添加量是對乳酸發(fā)酵芋荷梗的感官評分和pH影響最大的因素。最佳工藝為乳酸菌添加量0.30%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間3 d、食鹽添加量為2%，此優(yōu)化條件下，感官評分為84分，pH值為3.29。酸芋荷色澤均勻、光澤度好、有酯香味，風味獨特、口感酥脆、質(zhì)地良好。