高效液相色譜法檢測(cè)白酒中非法添加頭痛粉

陳同強(qiáng)，曾湘媚，李 燦*，徐文泱，趙紅清，李凱龍

（1.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.楓樹山蓮湖小學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

頭痛粉作為民間常見的解熱止痛藥，其功效為解熱鎮(zhèn)痛。市售的頭痛粉主要由阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因3種成分組成，阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚主要通過抑制下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞前列腺素合成酶而發(fā)揮作用，主要用于治療感冒發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛、偏頭痛、癌性痛及手術(shù)后止痛[1-4]?？Х纫蜃鳛橐活愔袠信d奮藥，主要藥效為收縮腦血管，減輕其搏動(dòng)的幅度，同解熱鎮(zhèn)痛藥配伍，可以增強(qiáng)鎮(zhèn)痛的效果。然而近年來為減輕消費(fèi)者因飲酒而由其中的雜醇油、胺類等物質(zhì)引起的頭痛癥狀[5-7]，一些不法商販違規(guī)在白酒中添加頭痛粉，以次酒冒充好酒，以達(dá)到喝了不上頭的效果，欺騙消費(fèi)者，謀取高額利潤(rùn)，同時(shí)此類藥物與酒一起飲用，會(huì)對(duì)人的肝腎造成較大損傷[8-9]。

目前，針對(duì)頭痛粉出現(xiàn)在白酒中的不良現(xiàn)象報(bào)道較多，國(guó)內(nèi)外關(guān)于對(duì)其中成分檢測(cè)文獻(xiàn)方法幾乎集中在藥品制劑上[10-19]，如謝華等[10]采用高效液相色譜法（high performance liquidchromatography，HPLC）測(cè)定復(fù)方氨酚烷胺片中的對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因和馬來酸氯苯那敏；王軍等[11]采用超快速液相色譜（ultra-fast liquid chromatography，UFLC）儀同時(shí)測(cè)定復(fù)方氨酚烷胺片中對(duì)乙酰氨基酚和咖啡因的含量；羅少偉[14]建立了高效液相色譜法測(cè)定飲料中的咖啡因含量。但作為非法添加物出現(xiàn)在白酒中的檢測(cè)方法尚未見報(bào)道，由于白酒成分復(fù)雜，不同于一般的藥物制劑，目前文獻(xiàn)報(bào)道的這些相關(guān)方法無法滿足檢測(cè)的需求，這給食品監(jiān)管工作帶來一定的難度，因此制定快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法已迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化條件，建立了高效液相色譜法檢測(cè)白酒中非法添加物“頭痛粉”含量，該法具有簡(jiǎn)單、快捷、重復(fù)性好、回收率高等特點(diǎn)，以期填補(bǔ)白酒中非法添加檢測(cè)方法的空白，為市場(chǎng)監(jiān)管部門執(zhí)法提供有力的技術(shù)支撐，從而達(dá)到保障人民的飲食用藥安全的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品、對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（純度≥98%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；10個(gè)不同廠家白酒：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD））：日本島津公司；Milli-Q Reference 超純水儀：美國(guó)Millipore公司；SG-1501系列電熱板：上海碩光電子科技有限公司；Dor Yang JA-M系列電子分析天平：德國(guó)Sartorius公司；0.22 μm有機(jī)濾膜：上海欽森實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 定性分析中色譜條件優(yōu)化

分別準(zhǔn)確稱取50.0 mg阿司匹林、50.0 mg對(duì)乙酰氨基酚、37.5 mg咖啡因標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（精確至0.01 g）于100 mL容量瓶中，流動(dòng)相溶解并定容至刻度，配制成3種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/mL、0.5 mg/mL、0.375 mg/mL。

選擇Shim-paekCLC-ODS色譜柱（150mm×6mm，5μm），將預(yù)先配制好的3種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，分別按流動(dòng)相甲醇∶水（30∶70，V/V），甲醇∶水∶冰醋酸（34∶65∶1，V/V），甲醇∶水∶冰醋酸（30∶65∶5，V/V），在其他條件相同情況下進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 前處理方法的優(yōu)化

直接將未經(jīng)任何處理白酒樣品，按1.3.1優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣，與預(yù)先將酒樣先100 ℃加熱30 min，冷卻后，加樣到堿性硅藻土固相萃取柱凈化處理后按相同色譜條件進(jìn)樣結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.3 定量分析方法

（1）檢出限與定量限：采取空白樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。取未檢出頭痛粉的白酒樣品3份，分別加入適量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，采用3倍信噪比（S/N）作為檢出限最低響應(yīng)值，計(jì)算出對(duì)乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因的檢出限；10倍信噪比（S/N）作為定量限最低響應(yīng)值，計(jì)算“頭痛粉”中3個(gè)組分的定量限。

（2）線性關(guān)系考察：分別稱取50.0 mg阿司匹林、50.0 mg對(duì)乙酰氨基酚、37.5 mg咖啡因標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（精確至0.01 g）于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，進(jìn)一步稀釋配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（3）儀器精密度實(shí)驗(yàn)：分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為5.0μg/mL、50.0 μg/mL、200.0 μg/mL的對(duì)乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液作為低、中、高質(zhì)量濃度溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算三者的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

（4）加標(biāo)回收及方法精密度實(shí)驗(yàn)：采用樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。取陰性白酒樣品18份，分別加入適量對(duì)照品溶液，使3種組分加標(biāo)的濃度分別達(dá)到定量限、2倍定量限以及10倍定量限3個(gè)添加水平，采用上述檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算“頭痛粉”中3個(gè)組分加標(biāo)回收率。

1.3.4 樣品含量測(cè)定

（1）樣品的處理[20]：準(zhǔn)確量取酒樣10 mL，100 ℃加熱30 min，冷卻至室溫，將樣品加載到堿性硅藻土固相萃取柱上，在真空條件下，樣品溶液將緩慢滲入固相萃取小柱中，靜置平衡10 min。經(jīng)20 mL正己烷淋洗后，再用20 mL 10%乙酸乙酯-乙醚溶液（10∶90，V/V）（約1 mL/min流速）進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)約5 g無水硫酸鈉（經(jīng)400 ℃灼燒）脫水后，收集于50 mL比色管中，40 ℃條件下氮?dú)饩徛抵两?，再用流?dòng)相定容至10.0 mL，制成測(cè)定液，供上機(jī)分析用。

（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)建立的方法，對(duì)待測(cè)酒樣非法添加物進(jìn)行定性定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析中色譜條件的優(yōu)化

通過對(duì)甲醇∶水（30∶70，V/V）、甲醇∶水∶冰醋酸（34∶65∶1，V/V）、甲醇∶水∶冰醋酸（30∶65∶5，V/V）3組流動(dòng)相色譜條件比較，發(fā)現(xiàn)采用甲醇∶水∶冰醋酸（30∶65∶5，V/V）作為流動(dòng)相峰形較好，分離效果佳，因此選擇其作為建立檢測(cè)方法的流動(dòng)相。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

圖1 白酒經(jīng)優(yōu)化前處理方法處理前（A）、后（B）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Baijiu before (A) and after (B)treatment by optimized pretreatment method

白酒樣品中含有大量乙醇成分，直接進(jìn)樣容易造成溶劑效應(yīng)，因此本實(shí)驗(yàn)通過加熱先揮發(fā)掉乙醇，再用超純水定容至原體積。通過堿性硅藻土固相萃取柱凈化，去除酒中酯類、酸類等成分，以減少對(duì)目標(biāo)物的干擾。白酒優(yōu)化處理前、后的HPLC圖見圖1。從圖1可以看出，酒樣直接進(jìn)樣后得到的色譜圖，非目標(biāo)峰比較多，且峰面積較大，尤其是在靠近目標(biāo)峰時(shí)存在較大的峰，保留時(shí)間稍有偏移，就會(huì)造成目標(biāo)峰識(shí)別錯(cuò)誤，從而引起假陽性結(jié)果。也會(huì)造成目標(biāo)物含量變化，定量結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。

酒樣經(jīng)前處理后，非目標(biāo)峰的數(shù)量大大減少，目標(biāo)峰前后的干擾峰幾乎消失，從而提高了對(duì)目標(biāo)峰識(shí)別的正確率，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果定量的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。

2.3 定量方法學(xué)考察

2.3.1 檢出限與定量限測(cè)定

分別進(jìn)樣一定濃度的3個(gè)組分標(biāo)準(zhǔn)溶液，觀察噪音強(qiáng)度，采用3倍信噪比（S/N）作為檢出限最低響應(yīng)值，稀釋3個(gè)組分標(biāo)準(zhǔn)溶液使得其響應(yīng)強(qiáng)度至3倍噪音值，計(jì)算得到對(duì)乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因檢出限分別為1.0 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL；稀釋3個(gè)組分標(biāo)準(zhǔn)溶液使得其響應(yīng)強(qiáng)度至10倍噪音值，以10倍信噪比（S/N）作為三者的定量限最低響應(yīng)值，計(jì)算定量限分別為3.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.5 μg/mL，說明本研究所建立的實(shí)驗(yàn)方法靈敏度高。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)譜圖及線性關(guān)系

由圖2可知，3種組分標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰型良好，分離效果佳。

圖2 對(duì)乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of paracetamol,aspirin and caffeine standards

圖3 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of paracetamol

圖4 阿司匹林對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of aspirin

圖5 咖啡因?qū)φ掌窐?biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of caffeine

由圖3～圖5可知，在0～200 μg/mL范圍內(nèi)，3種對(duì)照品線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均＞0.999。

2.3.3 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

表1 對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision tests result of paracetamol standard

表2 阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)品的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision tests result of aspirin standard

表3 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision tests result of caffeine standard

由表1～表3可知，3種標(biāo)準(zhǔn)品的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD均＜3.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 對(duì)乙酰氨基酚在不同濃度條件下的加標(biāo)回收率Table 4 Standard recovery rate of paracetamol at different concentrations

表5 阿司匹林在不同濃度條件下的加標(biāo)回收率Table 5 Standard recovery rate of aspirin at different concentrations

表6 咖啡因在不同濃度條件下的加標(biāo)回收率Table 6 Standard recovery rate of caffeine at different concentrations

由表4～表6可知，不同加標(biāo)濃度水平下平均回收率為91.7%～100.6%，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD均＜4.6%。

2.3.5 樣品測(cè)定結(jié)果

采用本研究建立的檢測(cè)方法對(duì)市售的10種白酒進(jìn)行檢測(cè)，只有其中一種檢出“頭痛粉”，經(jīng)定性分析，確認(rèn)其中含有的3種成分為乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因，經(jīng)定量分析，測(cè)得乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因的含量分別為98.8 μg/mL、197.2 μg/mL、30.1 μg/mL，其他9種白酒均未檢出非法添加的“頭痛粉”。

3 結(jié)論

本研究所涉及到的白酒中非法添加物“頭痛粉”是食品安全監(jiān)管部門在日常執(zhí)法監(jiān)督時(shí)的意外發(fā)現(xiàn)。按照上述建立的檢測(cè)方法對(duì)白酒中非法添加物“頭痛粉”進(jìn)行檢測(cè)，方法學(xué)考察驗(yàn)證表明，該方法方便、快捷、準(zhǔn)確，可對(duì)白酒中非法添加的阿司匹林、乙酰氨基酚、咖啡因進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。“頭痛粉”在白酒中的發(fā)現(xiàn)，說明在監(jiān)管上存在一定程度的漏洞，讓一些不法商家有機(jī)可乘。通過建立白酒中非法添加物“頭痛粉”的檢測(cè)方法，一方面填補(bǔ)了白酒中非法添加檢測(cè)方法的空白，另一方面進(jìn)一步擴(kuò)大了監(jiān)督范圍，從而更有效地規(guī)范市場(chǎng)，使食品行業(yè)能夠更加健康有序的發(fā)展。