p16異常甲基化聯(lián)合高危人乳頭瘤病毒檢測(cè)在早期宮頸癌診斷中的臨床價(jià)值

鮑統(tǒng)惠，郭桂蘭，李武芬，祁璘

宮頸癌是臨床上最為常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率極高，僅次于乳腺癌，位居第2位，多見(jiàn)于發(fā)展中國(guó)家的中老年女性，但是隨著社會(huì)的發(fā)展及人們生活水平的提高，宮頸癌的發(fā)生正趨于年輕化并有明顯上升趨勢(shì)[1]。調(diào)查顯示，全球每年大約有48萬(wàn)女性被確診為宮頸癌，有大約25萬(wàn)的宮頸癌患者死亡[2]。宮頸癌患者的預(yù)后與其臨床分期存在很大的關(guān)系，在美國(guó)，宮頸癌患者從確診以后計(jì)算，5年的病死率大約為30%，如果患者能夠被早期確診，病死率可降低20%[3]。另外由于宮頸癌的發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期量變產(chǎn)生質(zhì)變的過(guò)程，前期病變也是可以逆轉(zhuǎn)的，所以宮頸癌的早期診斷在降低病死率、提高生存率方面有著重要的意義[4]。目前，臨床上已公認(rèn)高危人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)性感染是宮頸癌癌前病變及進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵，但是高危HPV感染并不一定能夠促使形成宮頸癌[5]。有研究顯示，機(jī)體抑癌基因表達(dá)的失活通常是通過(guò)相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化引起的，在腫瘤發(fā)展的整個(gè)過(guò)程中，甲基化是早期發(fā)生的事件，可作為一種新型的腫瘤分子標(biāo)志物[6]。現(xiàn)分析p16異常甲基化聯(lián)合高危HPV檢測(cè)在早期宮頸癌診斷中的價(jià)值，為其臨床診斷提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年3月—2019年3月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院婦科行門診活檢、子宮全切術(shù)及宮頸環(huán)形電刀切除術(shù)患者100例(病例組)作為研究對(duì)象，根據(jù)其宮頸上皮是否存在異性細(xì)胞、細(xì)胞核分裂相、極性及異型細(xì)胞侵犯上皮細(xì)胞的程度分為宮頸癌亞組20例，年齡31～75(45.32±6.27)歲，按照我國(guó)2016年FIGO規(guī)定的的臨床分期[7]，Ⅰ期3例，Ⅱ期7例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例；高度病變亞組(CINⅡ～Ⅲ期)35例，年齡30～74(44.98±6.17)歲；低度病變亞組45例，年齡31～74(45.20±6.41)歲。另取正常人宮頸組織30例作為健康對(duì)照組，年齡31～73(44.53±6.39)歲。4組受試者年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均為已婚女性，存在完整的宮頸；②均同意行宮頸癌活性病理檢查；③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①心肝腎等功能障礙、精神障礙及并發(fā)有其他腫瘤疾病者；②長(zhǎng)時(shí)間使用激素及免疫制劑者；③已接受生物、化療及放療者；④嚴(yán)重感染及自身免疫病史者；⑤已有顯著的宮頸癌臨床癥狀者；⑥依從性差，中途退出者。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 p16異常甲基化檢測(cè)[8]：提取所有受試者宮頸組織的DNA，之后對(duì)其進(jìn)行甲基化處理：①取宮頸組織的DNA 1～2 μg ，加入20 μl生理鹽水，再加入NaOH溶液3 mol/L調(diào)節(jié)濃度至0.3 mol/L，置于37℃條件下15 min；②加入新配濃度為10 mmol/L氫醌溶液調(diào)節(jié)濃度至5 mmol/L，再加入濃度為3.6 mol/L新配置的亞硫酸氫鈉調(diào)整為3.1 mol/L的最終濃度，最后加入礦物油，置于50℃條件下16 h；③再向上述樣品中加入適量3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)濃度至0.3 mol/L，置于37℃條件下15 min；④加入濃度為20 μg/μl糖原1 μl，加入濃度為8 mol/L醋酸氨溶液，調(diào)節(jié)樣品溶度為3 mol/L，按照樣品體積，加入2.5倍量的無(wú)水乙醇，-20℃條件下過(guò)夜。之后再通過(guò)甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)。陽(yáng)性對(duì)照選用Sssl甲基轉(zhuǎn)移酶修飾的胎盤DNA，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書執(zhí)行。亞硫酸氫鹽修飾完全判斷：同一DNA在修飾前后均用非甲基化特異性引物和甲基化特異性引物擴(kuò)增，即如果修飾前無(wú)目的條帶發(fā)生擴(kuò)增現(xiàn)象，而修飾后存在目的條帶擴(kuò)增現(xiàn)象，則為修飾完全。相關(guān)引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 MSP引物序列

注:U為非甲基化特異性內(nèi)側(cè)引物;M為甲基化特異性內(nèi)側(cè)引物

1.3.2 宮頸組織p16蛋白表達(dá)檢測(cè)[9]：采用Western-blot法檢測(cè)。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將提取處理后的蛋白質(zhì)樣品向樣品孔中點(diǎn)樣30 μg，之后按照電泳操作方法進(jìn)行電泳。再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理，在裝有蛋白的PVDF膜朝上，加入5%的封閉液，在4℃條件下?lián)u床封閉3 h。之后加入兔抗人p16單克隆抗體(1 ∶1 000，購(gòu)自Abcam公司)，為一抗，在4℃條件下孵育過(guò)夜，TBST進(jìn)行洗滌操作，共3次，每次15 min。之后再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1 ∶1 000，購(gòu)于上海信裕生物技術(shù)有限公司)，為二抗。在37℃條件下，孵育1 h，TBST進(jìn)行洗滌操作，共3次，每次15 min。將上述經(jīng)過(guò)處理的PVDF膜浸入到發(fā)光工作液中，室溫條件下，孵育1 min，瀝干后顯影保存，之后通過(guò)Quantity One軟件對(duì)電泳條帶光密度值進(jìn)行分析，將內(nèi)參β-actin與目的條帶光密度值進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算得出p16蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.3.3 高危HPV病毒載量檢測(cè)[10]：通過(guò)第二代雜交捕獲試驗(yàn)(HC-Ⅱ人乳頭狀瘤病毒檢測(cè)技術(shù))測(cè)定。醫(yī)生采集每例患者的宮頸細(xì)胞，做好標(biāo)記；另外，患者自身采用dacron棉簽放入陰道6～7 cm深左右，靜止30 s后，轉(zhuǎn)動(dòng)棉簽取出即可，放置于做好標(biāo)記的試管中。通過(guò)堿性溶液破壞患者體內(nèi)病毒，使DNA雙鏈裂解成單鏈；通過(guò)RNA探針可以與病毒單鏈特異性結(jié)合形成雜交復(fù)合物；再通過(guò)其特異性抗體將復(fù)合物粘合于微孔壁上；之后雜交復(fù)合物會(huì)與堿性磷酸酶的多個(gè)抗體相結(jié)合，放大信號(hào)；最后，由于底物于堿性磷酸酶結(jié)合會(huì)發(fā)光，通過(guò)判定其發(fā)光強(qiáng)弱可以判定堿性磷酸酶的含量，從而確定雜交復(fù)合物的含量。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)于上述2組待檢樣品，其中任何1組發(fā)現(xiàn)檢出的雜交復(fù)合物含量≥1.0 pg/ml時(shí)即可判定為陽(yáng)性感染。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反向點(diǎn)雜交法對(duì)高危HPV病毒載量進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自深圳亞能生物技術(shù)有限公司，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1 4組高危HPV及p16異常甲基化陽(yáng)性率比較 高危HPV和p16異常甲基化的陽(yáng)性率比較，宮頸癌亞組>高度病變亞組>低度病變亞組>健康對(duì)照組(P均<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 4組受試者高危HPV及p16異常

2.2 高危HPV病毒載量、p16蛋白表達(dá)量與宮頸病變程度的關(guān)系 隨著宮頸癌病變程度的不斷加重，其HPV病毒載量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，兩者呈正相關(guān)(r=0.692,P<0.01)。隨著宮頸癌病變程度的不斷加重，p16蛋白表達(dá)量也逐漸增加，兩者呈正相關(guān)(r=0.554,P<0.01)，見(jiàn)表3。

2.3 3種檢測(cè)方法診斷早期宮頸癌的ROC曲線分析 p16異常甲基化、高危HPV及p16異常甲基化+高危HPV的AUC分別為0.62、0.74、0.98；p16異常甲基化+高危HPV的敏感度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及約登指數(shù)明顯高于單項(xiàng)檢查，見(jiàn)表4、圖1。

表3 高危HPV病毒載量、p16蛋白表達(dá)量與宮頸病變程度的關(guān)系 [例(%)]

表4 3種診斷方法對(duì)早期宮頸癌的cut-off值、敏感度及特異度

圖1 p16異常甲基化、高危HPV及聯(lián)合診斷的ROC曲線分析

3 討 論

大量研究顯示，許多腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)特定區(qū)域的CpG島高甲基化和整體基因組低甲基化，另外也有研究認(rèn)為抑癌基因失活的主要機(jī)制為啟動(dòng)子高甲基化[11]。實(shí)際上，腫瘤發(fā)生的本質(zhì)是抑癌基因的失活及癌基因的激活。p16基因主要位于人類第9號(hào)染色體短臂上，是一個(gè)可直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因，與諸多癌癥的發(fā)生關(guān)系密切[12]。CyclinD1能與p16功能蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合CDK4/CDK6，會(huì)對(duì)pRb蛋白磷酸化產(chǎn)生抑制，促使pRb-E2F復(fù)合物中的E2F難以解離，對(duì)細(xì)胞DNA合成和G1期進(jìn)入S期的啟動(dòng)具有較好的阻止效果，負(fù)反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖周期，另外pRb-E2F復(fù)合物水平的升高也反饋性地對(duì)p16的表達(dá)產(chǎn)生抑制[13]。Tong等[14]研究顯示，p16基因失活與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，p16基因的失活主要包括甲基化、突變及缺失。Stiasny等[15]認(rèn)為諸如垂體瘤、鼻咽癌及肺癌等多種腫瘤發(fā)生主要與p16基因的異常甲基化有關(guān)。本研究正常人和宮頸癌患者p16基因甲基化率分別為0%和45%，也證實(shí)了宮頸癌的發(fā)生與p16基因甲基化有關(guān)。而隨著癌變程度的增加，p16異常甲基化越顯著，提示在宮頸癌發(fā)生之前已有p16基因啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化，并逐漸惡化，有利于對(duì)宮頸癌癌變級(jí)別進(jìn)行預(yù)測(cè)，可作為一種新型的腫瘤分子標(biāo)志物。與Ahmad等[16]的研究結(jié)果相符合。Yildirim等[17]研究顯示，正常宮頸組織中p16蛋白不表達(dá)，而在宮頸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與病變程度呈正相關(guān)，與本研究中結(jié)果相符。對(duì)此，臨床上有2種解釋[18]：(1)宮頸癌發(fā)生時(shí)，Rb基因失活致使功能性pRb蛋白缺失，解除機(jī)體對(duì)p16基因的抑制，升高p16蛋白的表達(dá)；(2)HPV16癌基因E7可誘導(dǎo)pRb蛋白降解或者失活，可通過(guò)pRb與p16之間的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)p16蛋白高水平表達(dá)。

宮頸癌患者宿主細(xì)胞中整合的高危HPV基因組，會(huì)持續(xù)性地對(duì)E6/E7癌基因進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而維持癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。HPV E6/E7主要通過(guò)影響細(xì)胞周期中的Rb蛋白和調(diào)節(jié)因子P53發(fā)生致癌機(jī)制。E7與Rb蛋白相結(jié)合，會(huì)使pRb-E2F中的轉(zhuǎn)錄因子E2F釋放出來(lái)，影響G1/S的啟動(dòng)，進(jìn)而激活細(xì)胞周期，促使細(xì)胞非控制性增長(zhǎng)[20]。E6可與P53蛋白特異性結(jié)合，使其喪失對(duì)細(xì)胞的負(fù)生成調(diào)節(jié)功能[21]。本研究結(jié)果顯示，高危HPV病毒載量與宮頸病變程度呈正相關(guān)，且各病變程度患者HPV陽(yáng)性率與Tsakogiannis等[22]研究相符。而經(jīng)過(guò)ROC曲線分析聯(lián)合診斷的價(jià)值最高，這主要是由于HPV E7和p16基因均作用于以pRb為中心的pRb-E2F通路，而p16在G1～S期增殖過(guò)程中起著重要的作用，p16基因的甲基化會(huì)促使上述通路無(wú)限制進(jìn)行，形成腫瘤[23]。據(jù)研究，人類癌癥細(xì)胞中pRb與p16基因水平呈負(fù)相關(guān)，兩者共同參與癌癥通路的抑制，破壞上述兩種的任一基因，均會(huì)促使細(xì)胞發(fā)生異常增生，兩者同時(shí)缺失會(huì)引起選擇性壓力缺乏[24]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)單一高危HPV感染通常不會(huì)直接引起細(xì)胞發(fā)生癌變。Celewicz等[25]研究發(fā)現(xiàn)不同級(jí)別病變的高危HPV陽(yáng)性宮頸癌亞組中均出現(xiàn)一定程度的p16甲基化，且出現(xiàn)p16甲基化的細(xì)胞大部分病變較為嚴(yán)重，故p16甲基化可能是促使低病變向高病變發(fā)展的誘導(dǎo)因子。

綜上所述，p16異常甲基化聯(lián)合高危HPV檢測(cè)對(duì)早期宮頸癌具有較高的診斷價(jià)值，值得臨床推廣應(yīng)用。