miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p在甲狀腺癌中的表達(dá)及其診斷價(jià)值分析

梅士娟，張雙元，張易青，馬淑梅，孔令達(dá)

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤，全球每年約新發(fā)30萬(wàn)例，死亡4萬(wàn)例[1-2]。甲狀腺乳頭狀癌是最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，占所有甲狀腺癌的80%～90%，10年生存率超過(guò)90%，但若發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(在5%～20%的甲狀腺全切除術(shù)患者中可觀察到區(qū)域復(fù)發(fā)) ，尤其是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(占所有患者的20%～50%)，易導(dǎo)致生存率降低[3-4]。由于甲狀腺癌患者存活和腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素存在差異，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后的影響存在爭(zhēng)議。因此，急需尋求生物敏感標(biāo)志物解決這一問(wèn)題[5]。微小RNA(miRNA)是小的(19～25個(gè)核苷酸)非編碼單鏈RNA，其在癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)過(guò)程中起重要作用。與未受影響的甲狀腺組織相比，已顯示幾種miRNA在甲狀腺癌中轉(zhuǎn)錄失調(diào)[6-8]。miR-221-3p過(guò)表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，隨后證實(shí)與其他類型癌癥的轉(zhuǎn)移發(fā)展相關(guān)。miR-125b-5p上調(diào)與非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[9]。相反，miR-125b-5p下調(diào)也與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、胃癌和復(fù)發(fā)性漿液性乳頭狀卵巢腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。miR-183-5p是最早被發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，它的上調(diào)與多種癌癥相關(guān)?，F(xiàn)分析miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p在甲狀腺癌中的表達(dá)及其診斷價(jià)值，為甲狀腺癌的治療提供臨床及理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年4月—2018年12月青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科確診并有完整隨訪資料的甲狀腺乳頭狀癌患者138例，經(jīng)臨床頸部超聲診斷及甲狀腺全切除或次全切除術(shù)后病理檢查確診，術(shù)前均未接受化療或放療。其中男69例，女69例，年齡47～68(57.5±10.8)歲；病程4～25個(gè)月，平均(6.5±2.4)月；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期88例，Ⅲ～Ⅳ期50例。手術(shù)切除標(biāo)本后行病理檢查以判定腫瘤大小、復(fù)發(fā)、臨床分期、血管間隙浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。選擇同期于醫(yī)院診治的甲狀腺結(jié)節(jié)患者138例作為對(duì)照組(自愿提供甲狀腺組織用作分析miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p的表達(dá))。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：患者的預(yù)計(jì)生存期均>3個(gè)月。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：同步接受其他腫瘤放療的患者；服用或可能服用致肝損害藥物的患者；存在其他重大器官疾病的患者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法 通過(guò)TRIzol試劑(碧云天科技公司)提取總RNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳和UV分光光度計(jì)(美國(guó)HyClone公司)檢查RNA樣品的純度和濃度。使用2 μg總RNA及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Sigma公司)合成cDNA。引物由上海生工科技公司合成。miR-221-3p正向引物為5'-CCTGAGATGCAGGGTCCGAGGTAGGTCTA-3'，反向引物為5'-TTGCGGACATTGCTTGCTA-3'；miR-125b-5p正向引物為5'-CCTGACCTGCTAGGTAGCCTG-3'，反向引物為5'-CTGATCGTAGCTTGCTATTGCTGA-3'；miR-183-5p正向引物為5'-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3'，反向引物為5'-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3'；內(nèi)源性對(duì)照GAPDH正向引物為5'-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3'，反向引物為5'-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3'。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，95℃ 30 s，58℃ 30 s和72℃ 60 s，72℃10 min。PCR反應(yīng)系統(tǒng)：cDNA 2 μl +每種引物3 μl +Taq聚合酶(Sigma公司生產(chǎn))0.5 μl +dNTP 1 μl +10×緩沖液2 μl，加入生理鹽水以使最終體積為20 μl。以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照，以2-ΔΔCt作為計(jì)算方法[10]，依據(jù)miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p mRNA 2-ΔΔCt計(jì)算結(jié)果，確定miR-221-3p>3.76、miR-125b-5p>5.43、miR-183-5p>6.21為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床資料比較 與對(duì)照組比較，病例組患者性別、年齡、基礎(chǔ)病、家族遺傳史、身高、體質(zhì)量、TG、HDL-C、LDL-C、舒張壓、收縮壓比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 2組一般情況比較

2.2 2組miRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，病例組miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p水平明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.3 miRNA在甲狀腺癌患者中的變化特征 miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p在甲狀腺癌的腫瘤較大、有復(fù)發(fā)、臨床Ⅲ～Ⅳ期、血管間隙浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中均升高(P均<0.01)，見(jiàn)表3。

表2 2組血清相關(guān)miRNA表達(dá)水平比較

表3 相關(guān)miRNA在甲狀腺癌患者中的變化特征 [例(%)]

2.4 診斷甲狀腺癌ROC曲線分析 miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p聯(lián)合篩查方法AUC、約登指數(shù)、敏感度、特異度、準(zhǔn)確度均高于miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p單獨(dú)篩查方法(P<0.05)；miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p單獨(dú)篩查方法AUC、約登指數(shù)、敏感度、特異度、準(zhǔn)確度相近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌具有生物惰性，預(yù)后相對(duì)較好，然而，有10%～30%的甲狀腺乳頭狀癌病例表現(xiàn)出進(jìn)展性并導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，確定其發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的正確治療至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)是一類含有約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小RNA，其通過(guò)靶向3'非翻譯區(qū)(3'UTR)上的序列來(lái)干擾蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程。 通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)其靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，miRNA可能成為診斷、治療甲狀腺癌的潛在分子靶點(diǎn)。

圖1 miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p診斷甲狀腺癌ROC曲線分析

miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p是與腫瘤相關(guān)的miRNA，據(jù)報(bào)道在許多類型的癌癥中發(fā)揮促進(jìn)作用[10-12]。miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p通過(guò)上調(diào)不同的致癌基因可在大多數(shù)類型的癌癥中起腫瘤促進(jìn)劑的作用。miR-221-3p可通過(guò)直接靶向SOX4促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程而在前列腺癌進(jìn)展中充當(dāng)腫瘤促進(jìn)因子[13]；miR-221-3p通過(guò)促進(jìn)樁蛋白(PXN)的表達(dá)，作為腫瘤轉(zhuǎn)移和胃癌侵襲的腫瘤促進(jìn)因子發(fā)揮作用；miR-221-3p通過(guò)靶向SMAD2縮短細(xì)胞在G1/S期轉(zhuǎn)變中的停滯并促進(jìn)細(xì)胞增殖，以及宮頸癌細(xì)胞中的EMT遷移和侵襲[14]。最近的一項(xiàng)研究表明，miR-221-3p通過(guò)靶向hedgehog信號(hào)通路受體patched-1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。

表4 miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p診斷甲狀腺癌ROC曲線分析

注： 與miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p比較,aP<0.05

miR-125b-5p的生物學(xué)功能與miR-221-3p相近。miR-125b-5p通過(guò)促進(jìn)EGFR表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤和乳腺癌細(xì)胞系的遷移和侵襲[15]。在胰腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，miR-125b-5p通過(guò)靶向MMP16促進(jìn)遷移和侵襲，MMP16是一種對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)具有蛋白水解活性的蛋白酶。另一方面，miR-125b-5p的過(guò)表達(dá)顯著增加了肝癌中的細(xì)胞遷移和侵襲性，其過(guò)表達(dá)與高風(fēng)險(xiǎn)和肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)。miR-183-5p上調(diào)與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、胃癌和肺癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)[16]。在胃癌中，高水平miR-183-5p可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1和p27表達(dá)，而周期蛋白D1和p27是明確的致癌因子[17]。本次研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，病例組miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p表達(dá)水平明顯升高。miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p陽(yáng)性率與腫瘤進(jìn)展相關(guān)明顯。這與上述討論符合，說(shuō)明miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p在甲狀腺癌中表達(dá)增加，且與甲狀腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)。

miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p聯(lián)合篩查方法敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、AUC、約登指數(shù)均高于miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p單獨(dú)篩查方法。說(shuō)明三者聯(lián)合篩查甲狀腺癌具有較高的價(jià)值。

綜上，miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p在甲狀腺癌中表達(dá)增加，且與甲狀腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)，miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p可能為甲狀腺癌的診斷、治療靶點(diǎn)。miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p聯(lián)合篩查甲狀腺癌具有較高的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度，適合臨床推廣應(yīng)用。