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    β-欖香烯聯(lián)合卡鉑對結(jié)腸癌SW480細胞放療增敏作用的實驗研究

    2019-12-17 03:43:48文蘭香覃世運陳麗君田雯劉旭初陳鐘勇
    疑難病雜志 2019年12期
    關(guān)鍵詞:香烯卡鉑結(jié)腸癌

    文蘭香,覃世運,陳麗君,田雯,劉旭初,陳鐘勇

    自20世紀80年代以來,癌癥已成為人類健康的主要威脅,癌癥的發(fā)病率逐年上升。結(jié)直腸癌全球每年有超過100萬例新病例和50萬例死亡[1]。在我國,每年有15萬例患者被診斷出結(jié)腸癌,并且有5萬人死于該疾病,其5年存活率為60%[2]。放射療法是結(jié)腸癌的治療策略[3-4]。喜樹堿、長春堿、紫杉醇等天然抗腫瘤藥物通常存在明顯的不良反應(yīng)和耐藥性,因此人們越來越重視開發(fā)一種不良反應(yīng)輕的抗腫瘤藥物[5]。β-欖香烯是從姜科植物中分離出來的一類天然萜烯類化合物,具有廣泛的生物活性,可治療再生障礙性貧血、抗腫瘤、改善骨髓功能、誘導(dǎo)細胞凋亡、體外抗HSV21病毒等[6-7]。Caspase-6是凋亡信號級聯(lián)中的關(guān)鍵半胱天冬酶。已經(jīng)在由多種凋亡信號誘導(dǎo)的細胞凋亡中檢測到Caspase-3、Caspase-6,包括死亡受體激活、生長因子剝奪、電離輻射、不同化學(xué)治療劑[8-10]。本研究擬探討β-欖香烯聯(lián)合卡鉑對結(jié)腸癌SW480細胞放療增敏作用,為結(jié)腸癌的治療提供理論依據(jù),報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料 (1)實驗細胞、試藥試劑:人結(jié)腸癌SW480細胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)。RIzol試劑盒(美國Invitrogen公司);改良Eagle's培養(yǎng)基(DMEM)(美國HyClone公司);胎牛血清(FBS)(美國卡爾斯巴德公司);β-欖香烯、卡鉑(99.9%,美國Sigma公司);胰蛋白酶、96孔板、二甲基亞砜、膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠雙染色試劑盒、乙二胺四乙酸酯、聚偏二氟乙烯膜、化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);碘化丙啶(PI)(南京生興生物技術(shù)有限公司);3%瓊脂糖凝膠電泳膜、BCA蛋白定量分析試劑盒(BCA Protein Assay Kit)、二級山羊抗兔IgG抗體(美國Thermo Fisher Scientific公司);多克隆兔抗Caspase-3蛋白、小鼠Caspase-6蛋白[圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司]。(2)儀器設(shè)備:ED-98X射線發(fā)生器(美國瓦里安技術(shù)中國有限公司);ELx800酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司);FACSCalibur96X流式細胞儀(美國BD公司);AccessQuick RT-PCR系統(tǒng)(美國Promega公司);GelDoc 2000 System/QuantityOne Software數(shù)字凝膠記錄系統(tǒng)[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)]。

    1.2 實驗方法 2019年3— 5月于海南省第三人民醫(yī)院腫瘤中心分子生物實驗室進行實驗。SW480組:取結(jié)腸癌細胞系SW480細胞液(細胞濃度為5×106個/ml)10 ml于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、20% O2);放療組:細胞培養(yǎng)方法同SW480組,使用X線發(fā)生器進行X線照射,以4 Gy/min的固定劑量率發(fā)射,照射孵育時間為24 h;β-欖香烯及卡鉑組:培養(yǎng)方法同SW480組,分別加入β-欖香烯、卡鉑,使其最終濃度分別為80.0 μg/ml、100 μg/ml;β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組: 細胞培養(yǎng)方法同SW480組,加入β-欖香烯、卡鉑(濃度分別為80.0 μg/ml、100 μg/ml),使用X線發(fā)生器進行X線照射,以4 Gy/min的固定劑量率發(fā)射;用于照射細胞的X射線的能量分級為8 Gy,照射孵育時間為24 h。以上各組每孔設(shè)6個平行樣,培養(yǎng)72 h。

    1.3 觀測指標(biāo)與方法

    1.3.1 SW480細胞增殖水平測定:用對數(shù)生長期的SW480細胞進行胰蛋白酶消化,并以5×103個/ml細胞密度接種于96孔板中。孵育24 h,添加MTT溶液200 μl,并繼續(xù)孵育4 h。隨后,棄去細胞上清液,并加入二甲基亞砜100 μl。將96孔板在室溫下輕輕搖動15 min,并用酶標(biāo)儀測量570 nm處的吸光度(OD)值。細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)。

    1.3.2 SW480細胞克隆形成數(shù)目測定:選擇處于對數(shù)生長期的細胞并通過移液將其懸浮于培養(yǎng)液中,然后接種到10 cm培養(yǎng)皿中,用梯度因子進一步稀釋細胞懸浮液。 將約500個細胞加入培養(yǎng)皿中,在37℃下培養(yǎng)2~3周直至出現(xiàn)可見的細胞克隆形成數(shù)目。用PBS輕輕洗滌培養(yǎng)皿2次。將細菌用甲醇5 ml固定15 min,用吉姆薩染色10~30 min,然后計數(shù)。計數(shù)含有至少50個細胞的細胞克隆形成數(shù)目。

    1.3.3 SW480細胞凋亡測定:使用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠雙染色檢測細胞凋亡。收集每組細胞,消化并重懸于PBS中。根據(jù)試劑盒提供方案,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。在流式細胞術(shù)圖中,左下象限代表細胞碎片,而右下象限分別代表早期和晚期凋亡細胞。 左上象限代表死細胞。根據(jù)以下公式計算每組的凋亡率:細胞凋亡率(%)=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%,進行3次獨立測量取平均值。

    1.3.4 SW480細胞周期測定:將對數(shù)生長期的細胞離心5 min,用PBS洗滌2次,并在70℃下用70%乙醇固定12 h。然后離心并收集細胞,將細胞用RNA酶A 50 μg/ml在PBS 100 μl中室溫下消化30 min,然后用碘化丙啶(PI)5 μl染色30 min,通過流式細胞術(shù)分析樣品。

    1.3.5 SW480細胞Caspase-3、Caspase-6基因及蛋白表達測定:使用TRIzol試劑提取總RNA,并進行第1次ToRT反應(yīng)。 總RNA 1 μg使用AccessQuick RT-PCR系統(tǒng)進行RT-PCR實驗。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成,序列如下:Caspase-3,正向5’-AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG-3’和反向5’-GACTTGGGAGGTATCCACATCC-3’;Caspase-6,正向5’-GAAATCGTGCGTGACATTA-3’和反向5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3’;β-catenin,正向5’-ATTCGATGACCTTGGAA-3’和反向5’-CCTGAGTCGTACTCCCTTCGT-3’。Caspase-3、Caspase-6、β-catenin擴增產(chǎn)物的預(yù)期長度分別為132、259、475 bp,在熱循環(huán)儀上進行PCR;94℃保溫2 min,然后在94℃保溫45 s,55℃保溫45 s,72℃保溫45 s,共32個循環(huán),最后在72℃保溫5 min。使用3%瓊脂糖凝膠電泳對結(jié)果進行半定量分析,并以數(shù)字凝膠記錄系統(tǒng)進行可視化。

    用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3組SW480細胞(SW480細胞組、放療組、β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組)并用裂解緩沖液(NaCl 150 mmol/L, Tris 50 mmol/L,1%脫氧膽酸鈉)裂解,加入十二烷基硫酸鈉、1% Triton X-100、乙二胺四乙酸酯5 mmol/L在冰上保持20 min,離心10 min。根據(jù)試劑盒提供方案,使用BCA蛋白定量分析試劑盒(BCA Protein Assay Kit)測定蛋白質(zhì)水平。將等份的細胞裂解物試樣在10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠上電泳,再電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,用5%脫脂奶粉封閉,在Tween 緩沖鹽水4℃下保持2 h。將膜與多克隆兔抗Caspase-3蛋白和小鼠Caspase-6蛋白抗體在4℃下過夜,然后用二級山羊抗兔IgG抗體在室溫下保持2 h。化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測Caspase-3、Caspase-6蛋白的表達水平,β-肌動蛋白作為內(nèi)部參考。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組SW480細胞OD值、存活率比較 與SW480細胞組比較,放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組細胞SW480細胞OD值、存活率水平均降低(P<0.05);與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組SW480細胞OD值、存活率水平降低(P<0.05);放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,SW480細胞OD值、存活率水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    表1 各組SW480細胞OD值、存活率比較

    注:與SW480細胞組比較,aP<0.05;與放療組比較,bP<0.05;與β-欖香烯組比較,cP<0.05;與卡鉑組比較,dP<0.05

    2.2 各組SW480細胞克隆形成數(shù)目比較 與SW480細胞組比較,放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組細胞克隆形成數(shù)目降低(P<0.05);與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組細胞克隆形成數(shù)目降低(P<0.05);放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,SW480細胞克隆形成數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2及圖1(封3)。

    表2 各組SW480細胞克隆形成數(shù)目的比較個)

    注:與SW480細胞組比較,aP<0.05;與放療組比較,bP<0.05;與β-欖香烯組比較,cP<0.05;與卡鉑組比較,dP<0.05

    2.3 各組SW480細胞凋亡率、G1期比例比較 與SW480細胞組比較,放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組凋亡率、G1期比例升高(P<0.05);與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組凋亡率、G1期比例升高(P<0.05);放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,SW480細胞凋亡率、G1期比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3及圖2(封3)。

    表3 各組SW480細胞凋亡率、G1期比例的
    表達比較

    組 別復(fù)孔數(shù)凋亡率G1期SW480細胞組63.10±0.3466.38±0.95放療組64.65±0.21a68.66±1.08aβ-欖香烯組64.71±0.26a69.05±1.03a卡鉑組64.69±0.25a69.01±1.05aβ-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組68.22±0.38abcd75.32±0.84abcdF值15.65418.598P值0.0000.000

    注:與SW480細胞組比較,aP<0.05;與放療組比較,bP<0.05;與β-欖香烯組比較,cP<0.05;與卡鉑組比較,dP<0.05

    2.4 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA表達水平比較 與SW480細胞組比較,放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組Caspase-3、Caspase-6 mRNA表達升高(P<0.05);與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組Caspase-3、Caspase-6 mRNA表達升高(P<0.05);放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表4。

    表4 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA
    表達水平比較

    組 別復(fù)孔數(shù)Caspase-3 mRNACaspase-6 mRNASW480細胞組60.89±0.290.87±0.29放療組61.91±0.17a2.08±0.17aβ-欖香烯組61.93±0.19a2.11±0.18a卡鉑組61.92±0.20a2.03±0.21aβ-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組63.59±0.28abcd4.21±0.29abcdF值19.98725.654P值0.0000.000

    注:與SW480細胞組比較,aP<0.05;與放療組比較,bP<0.05;與β-欖香烯組比較,cP<0.05;與卡鉑組比較,dP<0.05

    2.5 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平比較 與SW480細胞組比較,放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組Caspase-3、Caspase-6蛋白表達升高(P<0.05);與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組Caspase-3、Caspase-6蛋白表達升高(P<0.05);放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較,SW480細胞Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表5及圖3。

    表5 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6
    蛋白表達水平比較

    組 別復(fù)孔數(shù)Caspase-3/β-actinCaspase-6/β-actinSW480細胞組61.65±0.540.96±0.54放療組62.98±0.87a3.54±0.54aβ-欖香烯組63.01±0.98a3.51±0.65a卡鉑組63.02±0.94a3.58±0.78aβ-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組64.99±0.86abcd5.65±0.49abcdF值32.36526.987P值0.0000.000

    注:與SW480細胞組比較,aP<0.05;與放療組比較,bP<0.05;與β-欖香烯組比較,cP<0.05;與卡鉑組比較,dP<0.05

    注:A.SW480細胞組;B.放療組;C.β-欖香烯組;D.卡鉑組;E.β-欖香烯聯(lián)合卡鉑+放療組

    圖3 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平比較

    3 討 論

    放射治療是結(jié)腸癌的一種重要治療方式,特別是局部晚期腫瘤,可誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡,在不影響病變周圍重要器官(例如正常肝組織、小腸和腎)的情況下,難以實現(xiàn)腫瘤自由基輻射劑量。因此,任何在沒有劑量遞增的情況下增加輻射治療功效的化合物(即在較低劑量下的較高治療反應(yīng))將對癌癥治療有益。因此,對這種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的研究是癌癥治療中的主要要求。β-欖香烯對人類癌細胞具有細胞毒活性。研究發(fā)現(xiàn),β-欖香烯通過引起細胞色素P450生物活化誘導(dǎo)MCF7乳腺癌細胞的抗癌活性;β-欖香烯可誘導(dǎo)人肺癌A549細胞G1/S期阻滯和細胞凋亡;β-欖香烯在實驗小鼠中具有放射增敏特性,并通過活性氧(ROS)的產(chǎn)生誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡[11-14]。本結(jié)果與上述討論符合,同時提示β-欖香烯聯(lián)合卡鉑能增加結(jié)腸癌SW480細胞放療敏感性,抑制結(jié)腸癌SW480細胞增殖、侵襲水平,促進腸癌SW480細胞凋亡水平。

    半胱天冬酶是由15個成員組成的半胱氨酸蛋白酶家族,在程序性細胞死亡和炎性反應(yīng)中起著重要作用。其中,Caspase-3、Caspase-6是一種典型的凋亡執(zhí)行者,被啟動子Caspase-8或Caspase-9激活后,切割細胞內(nèi)其他功能關(guān)鍵的蛋白質(zhì),導(dǎo)致細胞凋亡。許多抗癌療法,包括細胞毒性藥物、放射療法或免疫療法都可以通過激活Caspase-3來導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。因此,許多研究人員使用Caspase-3激活作為癌癥治療功效的替代標(biāo)志物[15-16]。增加的Caspase-3、Caspase-6活性通常被認為是細胞凋亡的標(biāo)志,并且是癌癥治療療效的陽性指標(biāo)。最近,有越來越多的證據(jù)表明,Caspase-3、Caspase-6可抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的癌細胞生長、細胞遷移、侵襲和腫瘤血管生成[17]。在人類癌癥治療中,一些研究報道了proCaspase-3、Caspase-6水平較高或活躍的患者預(yù)后高于proCaspase-3、Caspase-6水平較低的患者。最近的一項研究表明,Caspase-3、Caspase-6作為腫瘤抑制因子,在細胞暴露于化學(xué)物質(zhì)和輻射后具有抑癌作用。Caspase-3、Caspase-6通過旁分泌信號通路參與抑制腫瘤再生;Caspase-3、Caspase-6通過抑制血管生成微環(huán)境來抑制腫瘤生長[18];此外,高表達Caspase-3、Caspase-6的膀胱癌細胞化療后其腫瘤抑制效果更佳。本結(jié)果提示β-欖香烯聯(lián)合卡鉑能促進SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA、蛋白表達,增加結(jié)腸癌SW480細胞放療敏感性。

    綜上所述,β-欖香烯聯(lián)合卡鉑能增加結(jié)腸癌SW480細胞放療敏感性,抑制結(jié)腸癌SW480細胞增殖、侵襲水平,促進結(jié)腸癌SW480細胞凋亡水平;其機制與β-欖香烯聯(lián)合卡鉑能促進SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA、蛋白高表達有關(guān)。

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