強(qiáng)心合劑對糖尿病心肌病大鼠心肌結(jié)構(gòu)及膠原蛋白表達(dá)的影響

宋春暉　龔志剛　李林　付建平　唐娜娜　 劉中勇

[摘要]目的 構(gòu)建糖尿病心肌?。―CM）大鼠模型，探討強(qiáng)心合劑對DCM大鼠心肌組織膠原蛋白表達(dá)的影響。方法 以高糖高脂飼料對大鼠進(jìn)行喂養(yǎng)，輔助注射鏈脲佐菌素（STZ）予以造模，隨機(jī)將SD大鼠劃分成6個(gè)組：空白組、強(qiáng)心合劑高、中、低劑量組、DCM模型組以及卡托普利組，每組各30只。通過葡萄糖氧化酶法對空腹血糖進(jìn)行測定;以放免法來檢測胰島素;HE染色測定大鼠心肌病變情況;運(yùn)用免疫組化法對大鼠體內(nèi)的心肌組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen Ⅲ）以及Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）的表達(dá)進(jìn)行測定。結(jié)果 強(qiáng)心合劑高、中、低劑量組、卡托普利組的空腹血糖水平均低于DCM模型組，胰島素水平均高于DCM模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;強(qiáng)心合劑高、中、低劑量組、卡托普利組大鼠的MMP-9、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅰ IOD值均低于DCM模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;強(qiáng)心合劑中、低劑量組和卡托普利組大鼠的MMP-9、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅰ IOD值均高于強(qiáng)心合劑高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 強(qiáng)心合劑有助于緩解大鼠心肌損傷、降低血糖、升高胰島素，下調(diào)大鼠心肌組織MMP-9、Collagen Ⅲ以及Collagen Ⅰ膠原蛋白的表達(dá)，為DCM大鼠心肌提供保護(hù)，且高劑量的作用更加明顯。

[關(guān)鍵詞]糖尿病心肌病;強(qiáng)心合劑;膠原蛋白;基質(zhì)金屬蛋白酶

[中圖分類號(hào)] R541.61? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）10（a）-0007-05

[Abstract] Objective To establish the rat model of diabetic cardiomyopathy and explore the effect of Qiangxin Mixture? on collagen expression in myocardial tissue in diabetic cardiomyopathy rats. Methods The rats were fed with high-fat and high-sugar diet and induced by Streptozotocin （STZ） for modeling. The SD rats were randomly divided into blank group， DCM model group， Qiangxin Mixture high， Qiangxin Mixture medium and Qiangxin Mixture low dose group， and Captopril group， with 30 rats in each group. The fasting blood glucose was determine with glucose oxidase method， the insulin was measure by radio-immuno-assay. The histopathological changes of rat myocardium were detected by HE staining， and the myocardial tissue in rats of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9）， Collagen Ⅲ， Collagen Ⅰ expression were detected with immunohistochemical detection. Results The fasting blood glucose level of Qiangxin Mixture in the high， medium， low dose groups and Captopril group were lower than those of the DCM model group， and the insulin level were higher than those of the DCM model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MMP-9， Collagen Ⅲ， Collagen Ⅰ IOD values of Qiangxin Mixture high， medium， low dose group and Captopril group were lower than those of DCM model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MMP-9， Collagen Ⅲ， Collagen Ⅰ IOD values of Qiangxin Mixture medium， low dose groups and Captopril group were higher than those of Qiangxin Mixture high dose group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Qiangxin Mixture can alleviate rat myocardial damage， reduce blood sugar and increase insulin in rats and inhibit MMP-9， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ protein expression in rats myocardial tissue. Qiangxin Mixture has protective effect on myocardium of DCM rats， and the effect of high dose is more obvious.

[Key words] Diabetic cardiomyopathy; Qiangxin mixture; Collagen; Matrix metalloproteinase

社會(huì)在穩(wěn)步發(fā)展，居民的生活水平有了顯著提升，糖尿病的患病率也隨之快速增長。截至2045年，世界糖尿病人口數(shù)量將達(dá)到6.93億[1]，糖尿病將成為對人類健康有極大威脅的流行性疾病[2]。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是典型的特異性心肌病，是由糖尿病引起而不伴有其他基礎(chǔ)冠心病、高血壓等心臟疾病[3]。病理變化為心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積或是間質(zhì)纖維化[4]。如今，DCM的發(fā)病機(jī)理尚未明確。本研究擬用溫陽活血利水法組方之強(qiáng)心合劑干預(yù)DCM大鼠，觀察膠原蛋白在大鼠心肌組織中的表達(dá)情況，旨在探討強(qiáng)心合劑對DCM大鼠心肌組織的保護(hù)作用，為深入闡明DCM的形成機(jī)制和對DCM的防治提供新思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級SD大鼠，數(shù)量180只，源自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)公司（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK湘2016-002），體重（160±20）g，雌雄各半。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行分組：空白組30只，給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng);其余150只給予高脂高糖高熱量飼料（其飼料營養(yǎng)配備比例為豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鹽1%，常規(guī)飼料66.5%）進(jìn)行喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，全部大鼠均可自由飲水、進(jìn)食。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

強(qiáng)心合劑（組成：制附片、桂枝、紅花、桃紅、澤蘭、五加皮、葶藶子各10 g，炙黃芪、丹參、茯苓、北山楂、白芍各20 g，益母草15 g，生姜3片，大棗6枚），江西省中醫(yī)院藥劑室煎制，藥物經(jīng)水煎、過濾、濃縮至終濃度分別為1.5、3.0、6.0 g/ml的強(qiáng)心合劑低、中、高劑量組各150 ml，裝瓶封蓋、滅菌后放入-4℃冰箱保存?zhèn)溆??？ㄍ衅绽ㄈA中藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20140910，規(guī)格：25 mg/片）換算為大鼠等效劑量，用純凈水溶解，現(xiàn)用現(xiàn)溶。

1.3試劑及儀器

兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen Ⅲ）以及Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）多克隆抗體（一抗，美國Abcam公司，ab38898、ab34710、ab7778）;DAB顯色和HE染色試劑盒（上海博谷生物科技）;病理切片機(jī)（德國RM公司，型號(hào)：LEICA RM2135）;組織包埋機(jī)（SAKURA，型號(hào)：5235，日本）;光學(xué)顯微鏡（Olympus-BH2日本，購自O(shè)lympus公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及處理

大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周，禁食12 h，實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)腹腔注射鏈尿佐菌素（Streptozotocin，STZ）35 mg/kg，（STZ融合到滅菌0.1 mmol/L pH 4.2的檸檬酸緩沖液，其濃度為2%）。空白組大鼠注射給予劑量同等的檸檬酸緩沖液。注射STZ 72 h后，測定每只大鼠的血糖濃度。若血糖濃度≥11.1 mmol/L，提示糖尿病大鼠模型復(fù)制成功，將DCM模型復(fù)制成功的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為DCM模型組、溫陽活血利水法組方強(qiáng)心合劑高劑量組、強(qiáng)心合劑中劑量組、強(qiáng)心合劑低劑量組及卡托普利組，每組各30只。

空白組、DCM模型組大鼠灌服劑量相同的蒸餾水。強(qiáng)心合劑高、中、低劑量組灌服劑量分別為3、2、1 g/（kg·d）?？ㄍ衅绽M大鼠給予卡托普利片，4 mg/（kg·d）。連續(xù)灌服12周。

實(shí)驗(yàn)過程中，空白組、DCM模型組、強(qiáng)心合劑高、中、低劑量組以及卡托普利組大鼠死亡的數(shù)量分別為0、6、4、5、5、5只。

1.5觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1血糖及胰島素的測定? 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠禁食12 h，眼眶取血，EDTA抗凝，分離血清，通過葡萄糖氧化酶法來對空腹血糖進(jìn)行測定，運(yùn)用放免法檢測血清胰島素水平。

1.5.2 HE染色光鏡檢測心肌組織的結(jié)構(gòu)變化? 收集各組大鼠的左心室心肌組織，將其置入10%中性甲醛液中進(jìn)行浸泡固定、脫水，然后用石蠟進(jìn)行包埋，切成4 μm切片，行HE染色，顯微鏡下觀察大鼠心肌組織的結(jié)構(gòu)改變。

1.5.3心肌組織MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平的檢測? 將心肌組織4 μm石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗并進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗滌后加入山羊血清封閉，MMP-9、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)均選擇免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行測定。高倍鏡下觀察并計(jì)算其平均IOD值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1強(qiáng)心合劑干預(yù)后各組大鼠空腹血糖、血清胰島素的變化

強(qiáng)心合劑干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組各組大鼠的空腹血糖水平均高于空白組，胰島素水平均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;強(qiáng)心合劑高、中、低劑量組、卡托普利組大鼠的空腹血糖水平均低于DCM模型組，胰島素水平均高于DCM模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;強(qiáng)心合劑中、低劑量組和卡托普利組大鼠的空腹血糖均高于強(qiáng)心合劑高劑量組，胰島素水平低于強(qiáng)心合劑高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;強(qiáng)心合劑中、低劑量組和卡托普利組的空腹血糖、胰島素水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2強(qiáng)心合劑干預(yù)后各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

HE染色結(jié)果顯示：空白組大鼠體內(nèi)的心肌結(jié)構(gòu)未見異常，心肌細(xì)胞胞漿著色相對均勻，其胞核處在細(xì)胞中央，形圓或橢圓，大小一致，肌纖維均衡地排列;DCM模型組有少數(shù)心肌纖維斷裂，不規(guī)則;強(qiáng)心合劑高劑量組、中劑量組大鼠的心肌結(jié)構(gòu)有顯著好轉(zhuǎn)，肌纖維排列較緊密整齊;卡托普利組與強(qiáng)心合劑低劑量組大鼠心肌纖維排列不規(guī)整，部分肌纖維斷裂（圖1）。

2.3各組大鼠心肌組織MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達(dá)水平的比較

各組大鼠心肌組織MMP-9、Collagen Ⅰ以及Collagen Ⅲ均有不同強(qiáng)度地表達(dá)，與空白組比較，各組大鼠MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的 IOD值均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;強(qiáng)心合劑高、中、低劑量組、卡托普利組大鼠MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 的IOD值均低于DCM模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;強(qiáng)心合劑中、低劑量組和卡托普利組大鼠的MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的 IOD值均高于強(qiáng)心合劑高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;強(qiáng)心合劑中、低劑量組與卡托普利組大鼠MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的 IOD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2、圖2）。

3討論

中醫(yī)古籍上雖無DCM的名稱記載，但可納入“消渴病”并發(fā)“心悸”或是“胸痛”等諸病范疇。筆者恩師劉中勇教授認(rèn)為DCM的病機(jī)實(shí)質(zhì)是心痛陽虛水停，陰乘陽位，二者相互搏結(jié)，氣血運(yùn)行不暢，瘀血阻滯而成，治療上，強(qiáng)調(diào)溫陽活血利水法，并且以此法立方-強(qiáng)心合劑，在臨床上治療心肌病及心力衰竭患者中取得了滿意的效果[5-6]。全方振陽以附子為主，補(bǔ)氣血以炙黃芪為主，二者聯(lián)用視作君藥;桂枝性溫，能夠助陽化氣;桃仁、丹參以及紅花三藥合用，能夠達(dá)到活血祛瘀之目的，加速生血;澤蘭和益母草均有活血、利水之雙重功效;茯苓、葶藶子及五加皮能夠達(dá)到利水去濕之效;山楂能夠祛瘀消食，調(diào)補(bǔ)胃氣;佐以白芍、桂枝及制附子等藥熱毒之效;大棗、生姜能夠?qū)ζ⑽高M(jìn)行調(diào)和。諸藥配伍，內(nèi)合五苓散、真武湯、葶藶大棗瀉肺湯等方之意，可達(dá)到益氣升陽、活血利水之功。

近年來，研究證實(shí)，DCM是一種主要表現(xiàn)為心律失常和心功能不全的特異性心臟病[7]。DCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與炎癥、氧化應(yīng)激、葡萄糖代謝障礙、心肌間質(zhì)纖維化等因素密切相關(guān)[8]。在心臟發(fā)育過程中，成纖維細(xì)胞通過產(chǎn)生膠原蛋白分布到組織間隙中從而為心肌細(xì)胞提供支撐結(jié)構(gòu)和維持心肌正常的收縮和舒張功能[9]。心臟組織內(nèi)部的外基質(zhì)成分中，80%以上都是Collagen Ⅰ[10]，表達(dá)上升可加大心肌僵硬度，而Collagen Ⅲ的表達(dá)則決定心肌的順應(yīng)性[11]。在病理狀態(tài)下，心臟成纖維細(xì)胞分泌過多膠原，分布在心肌組織間隙當(dāng)中，誘發(fā)心肌纖維化[12]。本研究構(gòu)建DCM大鼠動(dòng)物模型，采用高糖高脂飼料聯(lián)合注射鏈脲佐菌素方法[13]，旨在先誘發(fā)胰島素抵抗再破壞胰腺β細(xì)胞的部分功能，該方法處理的大鼠心肌組織出現(xiàn)了Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)增多，與相關(guān)研究一致[14-15]，反應(yīng)心肌組織間隙大量膠原沉積是引起DCM的重要因素。強(qiáng)心合劑可減少DCM大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的蛋白表達(dá)，提示強(qiáng)心合劑能夠幫助糖尿病大鼠減輕心肌纖維化。

正常情況下，心肌間質(zhì)膠原處于持續(xù)不斷更新的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。膠原合成和降解同時(shí)進(jìn)行，使細(xì)胞外基質(zhì)成分保持穩(wěn)定。在細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)參與的DCM發(fā)病研究中發(fā)現(xiàn)，DCM患者血清中MMP-2與MMP-9蛋白的表達(dá)水平明顯升高，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）和TIMP-2蛋白的表達(dá)明顯降低，提示細(xì)胞外基質(zhì)的成功降解與重構(gòu)均可介入DCM的病發(fā)過程[16]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性變化，在心肌間質(zhì)纖維化中擔(dān)任極其重要的角色[17]。心肌MMPs作為基質(zhì)降解必備的調(diào)節(jié)因子，其活性增強(qiáng)見于DCM中[18]。MMP-9是心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ膠原完全降解的限速酶[19]，對Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ膠原實(shí)際的降解速度起決定性的作用[20-21]。相關(guān)報(bào)道顯示，DCM大鼠的心肌膠原纖維顯著性增多，MMP-9和TIMP-1的表達(dá)上升，兩者組合而來的MMP-9/TIMP-1復(fù)合物能夠減少和抑制MMP-9降解膠原[22]。

本研究中，各組實(shí)驗(yàn)大鼠的心肌MMP-9表達(dá)情況提示MMP-9參與了DCM的發(fā)生發(fā)展過程，DCM組大鼠心肌組織中表達(dá)增加的MMP-9降低了Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ膠原降解速度，組織間隙中膠原表達(dá)增多，加快了心肌纖維化進(jìn)程。強(qiáng)心合劑能夠明顯下調(diào)大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ膠原和MMP-9的表達(dá)，緩解細(xì)胞纖維化程度，從而提示強(qiáng)心合劑對DCM大鼠的心肌結(jié)構(gòu)及功能，具有保護(hù)作用，且高劑量的作用更加明顯，為中藥溫陽活血利水法防治DCM提供了客觀依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Cho NH，Shaw JE，Karuranga S，et al.IDF diabetes atlas：Global esti-mates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045[J].Diabetes Res Clin Pract，2018，138：271-281.

[2]Bauters C，Lamblin N，Mc Fadden EP，et al.Influence of diabetes mellitus on heart failure risk and outcom[J].Cardiovasc Diabetol，2003，2（1）：1.

[3]Schilling JD，Mann DL.Diabetic cardiomyopathy：bench to be dside[J].Heart failure clinics，2012，8（4）：619-631

[4]徐娜，白淑芝.糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（3）：520-524.

[5]李林，方家，劉中勇，等.溫陽活血利水法對充血性心力衰竭患者甲狀腺激素的影響[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012， 12（3）：3-5.

[6]李林，方家，劉中勇，等.溫陽活血利水法治療充血性心力衰竭30例[J].江西中醫(yī)藥，2012，43（2）：14-16.

[7]金智生，王東旭，和彩玲，等.紅芪多糖對db/db小鼠糖尿病心肌病心肌組織TGF-β與Ⅰ型膠原1蛋白表達(dá)的影響[J].中藥藥理與臨床，2017，33（2）：74-77.

[8]Zhao XY，Hu SJ，Li J，et al.Decreased cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase activity contributes to cardiac dysfunction instreptozotocin-induced diabetic rats[J].J Physiol Biochem，2006，62（1）：1-8.

[9]Kakkar R，Lee RT. Intramyocardial fibroblast myocyte communication[J].Circ Res，2010，106（1）：47-57.

[10]Vadla GP，Vellaichamy E.Anti-fibrotic cardio protective efficacy of aminoguanidine against streptozotocin induced cardiac fibrosis and high glucose induced collagen up regulation in cardiacfibroblasts[J].Chem Biol Interact，2012，197（2-3）：119-128.

[11]武利軍.心肌纖維化Ⅰ、Ⅲ型膠原病理形態(tài)及相關(guān)血清標(biāo)志物改變的研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2002.

[12]Lijnen P，Petrov V.Induction of cardiac fibrosis by aldosterone[J].J Mol Cell Cardiol，2000，32（6）：865-879.

[13]Zhang T，Hu Q，Shi L，et al.Equol attenuates atherosclerosis in apolipoprotein E-Deficient mice by inhibiting endoplasmic reticulum stress via activation of Nrf2 inendothelial cells[J].PLoS One，2016，11（12）：e167020.

[14]高俊杰，潘曉黎，吳偉，等.轉(zhuǎn)化生長因子β1和膠原蛋白與糖尿病心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國老年學(xué)雜志，2006，26（4）：505-507.

[15]Zheng WC，Li D，Gao X，et al.Carvedilol alleviates diabetic cardiomyopathy in diabetic rats[J].Exp Ther Med，2019，17（1）：479-487

[16]蘇勝.細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)參與的糖尿病心肌病發(fā)病研究.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，21（12）：1630-1632.

[17]Kim HE，Dalal SS，Young E，et al.Disruption of the myocardial extracellular matrix leads to cardiac dysfunction[J].J Clin Invest，2010，16（1）：857-866.

[18]Tyagi SC，Rodriguez W，Patel AM，et al.Hyperhomocysteinemic diabetic cardiomyopathy：oxidative stress，remodeling，andendothelial-myocyte uncoupling[J].J Cardiovasc Pharmacol Ther，2005，10（1）：1-10.

[19]谷玉紅，李景，王軍，等.MMPs和TIMPs與糖尿病心肌病心室重構(gòu)的關(guān)系及糖心寧的干預(yù)作用[J].世界中醫(yī)藥，2017，12（1）：25-29.

[20]張建，華綺.代謝綜合征[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：23-28，92-98.

[21]Peterson JT，Li H，Bryant JW.Evolution of matrix metalloprotease and tissue inhibitor expression during heart failure progression in theinfracted rat[J].Cardiovase Res，2000， 46（2）：307-315.

[22]Vanlinthout，Seeland U，Riad A，et al.Reduced MMP-2 activity contributes to cardiac fibrosis in experimental diabetic cardiomyopathy[J].Basic Res Cardiol，2008，103（4）：319-327.

（收稿日期：2019-05-10? 本文編輯：閆? 佩）