骨橋蛋白促進SKOV3卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力

徐邱鴻等

[摘要] 目的 探討外源性骨橋蛋白（OPN）對卵巢癌細胞（SKOV3）生長及遷移侵襲能力的影響。 方法 選用SKOV3及人正常卵巢上皮細胞（IOSE80）。應用Elisa及蛋白印跡方法檢測OPN含量。CCK8方法測定細胞增殖。劃痕實驗及小室穿梭實驗評價細胞遷移侵襲能力。蛋白印跡的方法檢測細胞信號通路活化及蛋白表達量。 結果OPN的分泌量及表達量在SKOV3細胞中均高于IOSE80（P均<0.05）。OPN濃度分別為20、50、80、110 ng/mL時，均促進了SKOV3的增殖（P均<0.05）?？瞻讓φ战M及OPN（50 ng/mL）組細胞運動面積分別為（26.1±0.9）%和（42.9±1.5）%（P<0.05）。空白對照組與OPN（50 ng/mL）組跨膜細胞數(shù)量分別為（165±7.63）個/孔和（333.3±8.8）個/孔（P<0.05）。OPN（50 ng/mL）干預15 min明顯上調磷酸化Akt及MMP2表達量。應用PI3K抑制劑預處理后，OPN（50 ng/mL）干預對磷酸化Akt及MMP2表達量沒有明顯影響。 結論 SKOV3比IOSE80表達分泌更多OPN。外源性OPN促進了SKOV3的增殖、遷移侵襲能力。OPN激活PI3K通路上調MMP2是可能機制之一。

[關鍵詞] 卵巢癌；骨橋蛋白；基質金屬蛋白酶

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）36-0001-04

Osteopontin promote proliferation， migration and invasion of the ovarian cancer cell line

XU Qiuhong1 LU Qingling1 CHEN Hongyu1 WANG Mingfang1 MA Xiuyan1 LOU Xiuhui1 YU Xin2 SONG Lixin2 WANG Qian2 WANG Li1

1.Department of Gynaecology and Obstetrics， Heilongjiang Provincial Hospital， Harbin 150030，China； 2.Harbin University of Science and Technology， Harbin 150080， China

[Abstract] Objective To investigate the impact of osteopontin（OPN） on proliferation and invasion of ovarian cancer cell line （SKOV3）. Methods Routinely cultured SKOV3 cells were treated with OPN for certain times. And cell numbers were measured using CCK8. The cell migration and invasion were assessed by wound healing test and transwell chamber assay， respectively. Elisa and western blotting were used to detect the protein expressions of p-Akt， Akt and MMP2. Results Compared with IOSE80 cells， SKOV3 secreted and expressed more OPN （P<0.05）. Compared with control group， 20， 50， 80， 110 ng/mL OPN promote proliferation of SKOV3 cells（P<0.05）. SKOV3 cells treated with 50 ng/mL OPN showed increased ability of migration and invasion （both P<0.05）. 50 ng/mL OPN treated for 15 minutes significantly increased the phosphorylation of Akt and the protein expressions of MMP2 of SKOV3. Specifically blocked the phosphorylation of PI3K inhibited the phosphorylation of Akt and the protein expressions of MMP2 when treated with OPN. Conclusion OPN could promote the migration and invasion of SKOV3 cells possibly by regulating the phosphorylation of PI3K and the expression of MMP2.

[Key words] Ovarian cancer；Osteopontin；Matrix metalloproteinase

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，轉移早、復發(fā)率高，嚴重影響疾病治療及預后。CA125是目前卵巢癌的主要血清學標志物，但仍有約30%患者表達陰性[1]。近年來多種新的卵巢癌標志物被提出，其中骨橋蛋白（osteopontin， OPN）備受關注[2]。但是，OPN對卵巢癌細胞的生長及遷移侵襲能力所起作用至今仍未明確闡明。本實驗通過體外實驗探討OPN對卵巢癌細胞SKOV3生長及遷移侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

OPN（4264，Sigma）、anti-OPN（ab91655，Abcam）、AKT（9272，cell signaling technology）、p-AKT（9271，cell signaling technology）、MMP2（ab110186，Abcam），GAPDH（上海威奧生物）、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（碧云天）、PI3K抑制劑（LY294002， Cell Signaling Technology）、OPN ELISA Kit（上海信然生物），DMEM高糖培養(yǎng)液（吉諾生物）、澳洲牛血清（Biosun），PBS（吉諾生物）、0.25%胰酶-EDTA（吉諾生物）、吉姆薩染液（南京建成生物公司）、CCK8 Kit（碧云天）、RIPA、PMSF、磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白印跡配膠試劑盒（碧云天）。

1.2 細胞株

SKOV3卵巢癌細胞株及IOSE80人正常卵巢上皮細胞購于上海斯信生物。

1.3 細胞培養(yǎng)上清液收集

接種培養(yǎng)細胞至覆蓋約85%～90%，PBS洗3遍，無血清DMEM培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)液，于-20℃保存。

1.4 細胞增殖測定

按4×103個/mL將單細胞懸液0.1 mL接種至96孔板，加入不同濃度的OPN培養(yǎng)液（20、50、80、110 ng/mL）培養(yǎng)， OPN（0 ng/mL）培養(yǎng)液為對照組。在不同時間點應用CCK8法測量450 nm波長的吸光度值以反映細胞增殖情況。每組3個復孔。

1.5 細胞遷移侵襲能力測定

遷移實驗：接種培養(yǎng)細胞至覆蓋約85%～90%，無菌10 μL槍頭均勻劃痕，以OPN（50 ng/mL）培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，觀察細胞遷移，OPN（0 ng/mL）培養(yǎng)液為對照組，每組3個復孔。采用ImageJ軟件分析細胞運動面積。侵襲實驗：Matrigel在4℃自然融化過夜，用預冷的無血清培養(yǎng)液以1∶8比例稀釋。取稀釋后的Matrigel加入transwell小室，將小室放入24孔板，37℃孵育4 h呈凝膠狀。取對數(shù)生長期細胞，用無血清培養(yǎng)液稀釋調整濃度到1×106個/mL，每上室加入0.2 mL。下室加入10%血清培養(yǎng)液，每組3個復孔，培養(yǎng)24 h后取上室，棉簽擦去Matrigel膠及上室內細胞，多聚甲醛固定10 min。吉姆薩染色20 min后拍照，計數(shù)細胞量。

1.6 蛋白印跡測定細胞信號通路

OPN（50 ng/mL） 培養(yǎng)液作用15 min，在冰上裂解細胞并提取細胞總蛋白。OPN（0 ng/mL）培養(yǎng)液為對照組。測定蛋白濃度，每孔蛋白上樣量約50 μg。根據(jù)說明書配置SDS-PAGE膠（濃縮膠為5%，分離膠為12%）。恒壓電泳（120V）至溴酚藍脫落，4℃下恒壓（100V）轉膜3 h。5%TBSA室溫封閉1 h，4℃一抗（1∶1000）過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。二抗（1：4000）室溫1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，用化學發(fā)光試劑（ECL）于凝膠成像系統(tǒng)曝光，ImageLab3.0定量分析結果。

1.7 細胞培養(yǎng)上清液OPN測定

加入稀釋好的標準品于反應孔中。立即加入50 μL的生物素標記抗體。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去液體，用吸水紙拍干。重復操作4次。加入底物50 μL，輕輕振蕩均勻，避光37℃溫育5 min。取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，立即上機測定450 nm波長的各孔吸光值。每孔3個復孔。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。計量資料比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SKOV3及IOSE80細胞株OPN表達量測定

取兩種細胞培養(yǎng)上清液應用ELISA測定OPN含量，結果SKOV3分泌量（23.79±0.48）ng/mL顯著高于IOSE80（11.09±0.76）ng/mL（t=15.31，P<0.05）。SKOV3細胞OPN蛋白表達量亦高于IOSE80細胞。見表1、圖1。

圖1 人正常卵巢上皮細胞株與卵巢癌細胞株OPN表達量比較

注：左圖為Elisa測定細胞培養(yǎng)液中分泌OPN的含量，SKOV3分泌量（23.79±0.48）ng/mL顯著高于IOSE80（11.09±0.76）ng/mL，（t=15.31，P<0.05）；右圖為蛋白印跡法測定兩細胞株總蛋白中OPN的表達量，SKOV3表達量高于IOSE80

表1 人正常卵巢上皮細胞株與卵巢癌細胞株OPN（ng/mL）分泌表達量

2.2 OPN對SKOV3增殖影響

培養(yǎng)3 d時，不同濃度OPN對SKOV3增殖均起到促進作用，且與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（OPN濃度為20、50、80、110 ng/mL的四組與對照組比較，t=5.051、22.26、21.64、28.02，P均<0.05）。對OPN濃度為20、50、80、110 ng/mL四組行方差分析，得到P<0.05（F=74.51，df（組間）=4，df（組內）=10）（表3），再采用Bonferroni方法行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)50、80、110 ng/mL組與20 ng/mL組差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.05），而三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。對培養(yǎng)4 d時的細胞增殖結果分析，結果與培養(yǎng)3 d相似。見表2、圖2。

圖2 OPN對SKOV3增殖影響

注：不同濃度組外源性OPN對SKOV3細胞增殖均有明顯促進作用。50、80、110 ng/mL組的促進增殖能力相當，且優(yōu)于20 ng/mL組。圖示為各組與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

表2 OPN對SKOV3增殖影響（x±s）

表3 細胞增殖第4天方差檢驗Bonferroni多組配對檢驗t值

注：*P<0.05，**P<0.01

2.3 OPN對SKOV3細胞遷移、侵襲能力的影響

遷移實驗結果顯示對照組細胞運動面積為總劃痕面積（26.1%±0.9），OPN（50 ng/mL）組細胞運動面積為總劃痕面積（42.9%±1.5）。50 ng/mL OPN明顯促進了SKOV3細胞的遷移距離（t=9.15，P<0.05）。侵襲實驗結果示對照組與OPN（50 ng/mL）組跨膜細胞數(shù)量分別為（165±7.63）個/孔和（333.3±8.8）個/孔。50 ng/mL OPN明顯促進了SKOV3細胞的侵襲能力（t=14.43，P<0.05）。見圖3。

圖3 OPN對SKOV3細胞遷移、侵襲能力的影響

注：上圖：與對照組相比，OPN50 ng/mL顯著提高了細胞遷移面積；下圖：兩組細胞穿越小室細胞染色（吉姆薩染色）

2.4 OPN影響SKOV3細胞信號通路激活并提高MMP2表達

采用蛋白印跡的方法檢測OPN對SKOV3細胞信號通路的影響。結果提示，OPN 50 ng/mL培養(yǎng)15 min時，Akt發(fā)生磷酸化激活。OPN 50 ng/mL培養(yǎng)48 h后提取細胞總蛋白分析，發(fā)現(xiàn)MMP2表達增高。見圖4。

圖4 OPN激活SKOV3 PI3K通路且提高MMP2表達

2.5 阻斷Akt通路激活，抑制OPN引起的MMP2表達提高

對數(shù)生長SKOV3細胞分別應用LY294002（50 μmol/L）和對照DMSO處理6 h，再加用OPN 50 ng/mL處理15 min。提取細胞總蛋白用蛋白印跡檢測p-Akt及MMP2的量。LY294002抑制了OPN對Akt的激活，同時抑制了MMP2表達提高。見圖5。

圖5 阻斷PI3K通路激活，抑制OPN引起的MMP2表達提高

3 討論

卵巢癌患者死亡率一直居高不下，一方面原因是約70%患者在確診時疾病已是晚期，另一方面很重要的原因是腫瘤易發(fā)生早期轉移，且患者在接受手術或化療后，也許經(jīng)過了幾個月或幾年的無疾病間期（disease-free intervals），但是疾病復發(fā)仍難避免。腫瘤細胞的腹腔種植是主要的卵巢癌轉移途徑?，F(xiàn)今，卵巢癌轉移復發(fā)的機制仍未闡明。但是，腫瘤微環(huán)境的改變及其對腫瘤表型的調節(jié)作用在腫瘤細胞的遷移、侵襲上起到重要作用[3]。

OPN是一種44kDa的帶負電荷的鈣結合糖基化磷蛋白。其在體內廣泛存在且參與多種生理過程，如損傷修復、膠原原纖維形成、骨修復、巨噬細胞與中性粒細胞遷移以及血管形成。然而新的研究發(fā)現(xiàn)，異常升高的血清OPN濃度與包括肺癌、結腸癌及乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生相關[4]。目前在卵巢癌的研究中認為OPN是有效的卵巢癌血清標記物之一，并且與卵巢癌的發(fā)生及進展相關[2]，抑制OPN的表達可抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲能力[5]。我們研究探討了外源性OPN對卵巢癌細胞SKOV3的增殖及遷移侵襲能力的影響，闡明外源性OPN通過激活PI3K通路并提高了MMP2的表達，從而促進了SKOV3的增殖及遷移侵襲能力。

通過比較培養(yǎng)液中的分泌OPN及總細胞蛋白中的胞內OPN含量，我們發(fā)現(xiàn)SKOV3比較于IOSE80表達且分泌更高的OPN。提示盡管OPN在體內表達、分布廣泛，但在卵巢癌細胞中的表達量的確有異常增高。進而，我們研究了外源性OPN對SKOV3增殖能力的影響，結果提示各濃度的外源性OPN對SKOV3均有促進增殖的作用，并且該作用呈濃度依賴性。但是，當外源性OPN濃度達到50 ng/mL時，繼續(xù)提高濃度，其對SKOV3的促進作用不再有明顯增高。與Dan Lu等針對151例卵巢癌患者血清OPN濃度的研究結果相似。該研究結果發(fā)現(xiàn)進展期卵巢癌患者血清OPN濃度均值約55 ng/mL，并且絕大多數(shù)患者血清OPN濃度小于100 ng/mL，而疾病穩(wěn)定的患者其血清OPN均值約35 ng/mL，并且絕大多數(shù)患者血清OPN濃度小于50 ng/mL[6]。

根據(jù)梯度外源性OPN濃度對SKOV3增殖能力實驗的結果，我們選擇采用50 ng/mL濃度檢測OPN對SKOV3細胞遷移侵襲能力的影響。結果提示外源性OPN對SKOV3細胞的遷移、侵襲能力有明顯的促進作用。曾有研究提示OPN促進腫瘤細胞遷移及侵襲能力可能是通過上調MMP2和MMP9的表達[7-9]。MMP2和MMP9屬于鋅離子依賴性內肽酶，主要降解Ⅳ、Ⅴ型膠原、纖維連接蛋白及彈性蛋白。一方面通過降解腫瘤基質使得腫瘤細胞突破基質屏障，促進腫瘤細胞侵襲轉移，另一方面可誘導新生血管形成，促進腫瘤生長和擴散[10]。同樣，我們的實驗結果提示外源性OPN可以上調MMP2，并且可能是其促進SKOV3細胞的遷移及侵襲能力的機制之一。

在對信號通路的研究中，我們的結果提示外源性OPN很可能是增強了Akt的磷酸化激活進而提高了MMP2的表達。曾有研究提示，OPN與其配體CD44配接可募集細胞膜表面的整合素，并分別活化PI3K依賴及PLC-γ依賴的Akt磷酸化激活[11]。本實驗中，我們應用了PI3K特異抑制劑（LY294002），發(fā)現(xiàn)當阻斷了PI3K的激活SKOV3細胞的MMP2表達量隨之下調，提示外源性的OPN主要是引起了PI3K依賴的Akt磷酸化激活并進而提高了SKOV3細胞的MMP2表達量。

近年來，篩選卵巢癌早期診斷的血清學標志物是研究重點，而OPN作為特異性及敏感性均較好的血清學標志物備受矚目。本研究提示，卵巢癌腫瘤細胞分泌的過多的OPN不僅可作為以篩選、診斷的指標，同時也能夠以自分泌的形式作用于腫瘤細胞本身，對其增殖及侵襲產(chǎn)生一定的促進作用。

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（收稿日期：2014-10-24）

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（收稿日期：2014-10-24）

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（收稿日期：2014-10-24）