B族黃曲霉毒素抗原合成設(shè)計及特異性、廣譜性抗體制備與特性分析

張海棠 王曉斐 職愛民 王亞楠 王自良

(1河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003；2河南旭瑞食品有限公司,河南焦作 454150)

目前,在食品污染中已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素(aflatoxin,AF)共有20多種,其中毒性強、污染廣、含量高的是B族AF(B group aflatoxins,BGAFs)。BGAFs具有致癌性、致畸性和免疫抑制性等多種毒害作用,已成為食品AF污染檢測的主要對象[1]。BGAFs包括AFB1和AFB2兩種,兩者與食品污染的關(guān)系密切,若兩者同時存在,以 AFB1污染為主,AFB2污染伴隨AFB1,具有毒性疊加效應(yīng)[2]。食品BGAFs污染最大殘留限量標準(maximum residue limits,MRLs)的規(guī)定有兩種,一是包括我國在內(nèi)部分國家采用AFB1的MRLs,如我國《GB 2761-2017食品中真菌毒素限量》[3]規(guī)定,玉米及其制品≤20 μg·kg-1、稻谷及其制品≤10 μg·kg-1、小麥及其制品≤5 μg·kg-1；二是部分國家采用BGAFs總量(B1+B2)的MRLs,如歐盟≤4 μg·kg-1、日本≤10 μg·kg-1、美國 FDA≤15 μg·kg-1。目前食品BGAFs污染的分析方法主要有儀器分析和免疫分析,基中免疫分析因具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、可大批量篩檢和現(xiàn)場檢測等優(yōu)勢,已成為不可或缺的技術(shù)手段。建立BGAFs免疫分析方法的關(guān)鍵是獲得優(yōu)秀的抗體,而半抗原設(shè)計和抗原合成是制備優(yōu)秀抗體的前提[4]。關(guān)于BGAFs抗原合成方法的研究國內(nèi)外已有相關(guān)報道[5-6],但有關(guān)不同半抗原分子設(shè)計、抗原合成及抗體特性比較分析方面的研究尚鮮見。本研究以AFB1為反應(yīng)起始原料,通過不同AFB1半抗原分子設(shè)計與抗原合成方法制備多克隆抗體(polyclonal antibody,pAb),并對其特性進行分析,篩選出最佳半抗原分子設(shè)計與抗原合成方法,以期為靈敏度高、廣譜、特異性強的BGAFs高質(zhì)量單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標準品,新加坡 Pribolab公司；陽離子化牛血清白蛋白(cationic bovine serum albumin,cBSA)、羊抗兔酶標二抗(GaRIgG-HRP),美國Sigma公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)所用稀釋液為 0.01 mol·L-1pH值7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS),洗液為含 0.5 g·L-1Tween-20(PBST)的PBS；封閉液為含50 g·L-1豬血清的PBST；包被液為0.1 mol·L-1pH值9.6的碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution,CBS)。試驗動物為2月齡,體重1±0.2 kg的雄性新西蘭白兔,共18只,隨機分為6組,每組3只,由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 BGAFs人工抗原合成設(shè)計

根據(jù)AFB1分子結(jié)構(gòu)上存在的活性位點(圖1),擬采用6種方法制備人工抗原AFB1-BSA(表1)。

圖1 AFB1結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of AFB1

1.3 BGAFs人工抗原鑒定

1.3.1 UV掃描 用甲醇溶解AFB1,配制1 mg·mL-1AFB1溶液；用4∶6(v/v)的甲醇 PBS溶液分別溶解BSA和 AFB1-BSA,配制 1 mg·mL-1的 BSA 和 AFB1-BSA溶液。在波長200～500 nm下進行紫外掃描,按照公式計算AFB1與BSA的分子結(jié)合比[18]:

式中,A為吸光值,儀器讀出；ε為摩爾消光系數(shù),是常值；C為溶液中溶質(zhì)濃度；L為光程,由儀器決定。

1.3.2 SDS-PAGE鑒定 選擇濃縮膠與分離膠濃度分別為5%和12%,電壓分別為90 v和60 v,加樣量為每孔10μL,蛋白質(zhì)含量為每孔10 μg。采用 CWD-9403D型紫外分析儀系統(tǒng)軟件(北京六一儀器廠)計算AFB1與BSA的分子結(jié)合比。

1.4 AFB1pAb制備

用6種不同方法合成的人工抗原分別免疫新西蘭白兔,每種抗原免疫1組,共6組,每組3只。免疫劑量按AFB1-BSA中BSA的量計算,每只100 μg,體積1 mL,背部皮下4～6點注射,共免疫5次,每次間隔3～4周,第5次免疫后2周耳緣靜脈采血,5 000 r·min-1離心10 min分離多抗血清,采用飽和硫酸銨鹽析法純化多抗血清,制備AFB1pAb[19]。

1.5 AFB1pAb特性分析

1.5.1 效價測定 間接ELISA[20]。第一步,包被酶標板,用CBS稀釋包被抗原AFB1-OVA,每孔100μL,37℃溫育2 h,用 PBST洗板3次；第二步,封閉酶標板,加封閉液,每孔250μL,37℃溫育1 h,洗板3次；第三步,加抗血清,加入用PBS倍比稀釋的抗血清,每孔50μL,37℃溫育15 min,洗板3次；第四步,加酶標抗體,加入工作濃度的GaMIgG-HRP,每孔50μL,37℃溫育25 min,洗板3次；第五步,加酶底物,每孔60μL,室溫下顯色15 min；第六步,終止反應(yīng),加終止液2 mol·L-1H2SO4,每孔 100μL,用酶標儀讀值,記錄結(jié)果。反應(yīng)設(shè)陰性對照(negative control,NC)和PBS空白對照(black control,BC),每次檢測3個重復(fù)。酶標儀測定 A450值,以陽性/陰性(P/N)＞2.1,且 P-N＞0.2為標準,計算抗體效價。

1.5.2 敏感性鑒定 間接競爭ELISA(indirect competitive ELISA,icELISA)測定AFB1pAb對 AFB1的半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC50),以此判定敏感性[21]。

1.5.3 特異性鑒定 以 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2為抑制劑,icELISA法測定各抑制劑的IC50,然后按照公式計算交叉反應(yīng)率(cross reaction percentage,CR)[22]:

2 結(jié)果與分析

2.1 BGAFs人工抗原鑒定結(jié)果

2.1.1 UV鑒定結(jié)果 由圖2可知,在200～500 nm波長范圍內(nèi),BSA的特征峰位于278 nm,AFB1的特征峰位于363 nm,OAE、MOA、MA、SA、EP、EED 6 種方法合成的人工抗原AFB1-BSA均含有BSA和AFB1的特征峰,說明以上6種方法均可合成人工抗原AFB1-BSA。BSA與AFB1的分子結(jié)合比計算結(jié)果見表2。由表可知,以上6種方法合成的人工抗原AFB1-BSA,其分子結(jié)合比不同,其中,OAE和MA兩種方法效果較好。

2.1.2 SDS-PAGE鑒定結(jié)果 由圖3可知,6種人工抗原AFB1-BSA的條帶均滯后于BSA的條帶,說明AFB1-BSA的分子量大于BSA,由此可以判定AFB1-BSA合成成功。

2.2 AFB1pAb特性分析

2.2.1 效價測定 免疫結(jié)束后每組挑選1只間接ELISA效價最高的免疫兔進行比較分析,由圖4可知,6只免疫兔的間接ELISA效價均達到了1∶(1×104),表明6種方法合成的AFB1-BSA均具有良好的免疫原性,其中,以O(shè)AE組和MA組免疫效果最好,效價達到了 1∶(1.28×104)。

表1 AFB1半抗原設(shè)計與抗原合成方法Table1 The hapten design and antigens synthesis of AFB1

圖2 AFB1-BSA的UV圖Fig.2 UV spectra of AFB1-BSA

表2 6種方法所制備AFB1-BSA的分子結(jié)合比Table2 Molecular binding ratio of AFB1-BSA prepared by six methods

2.2.2 敏感性分析 由圖5可知,6只免疫兔的icELISA抑制曲線具有良好的線性關(guān)系,OAE組敏感性最好,IC50為10.32 μg·kg-1,其他各組敏感性均遜色于OAE組。

圖5 AFB1pAb對AFB1的icELISA敏感性測定Fig.5 The sensitivity measurement of AFB1pAb to AFB1by icELISA

2.2.3 特異性與廣譜性分析 由表4可知,6種方法所制備的抗體均能100%識別AFB1,其中OAE法的特異性和廣譜性最好,IC50為 10.32 μg·kg-1,與 AFB2的CR為75.21%；與 AFG1、AFG2的 CR分別為 44.13%和14.72%。其他方法制備的抗體特異性很好,均能100%識別AFB1,但其敏感性和廣譜性不如OAE法所制備的抗體。綜上表明,制備針對BGAFs敏感性高、特異性強、廣譜性好的抗體,最好的抗原合成方法是OAE法。

表3 AFB1pAb對AFB1icELISA測定曲線的回歸方程、R2值和 IC50值Table3 The regression equation， R2and IC50 of AFB1pAb to AFB1by icELISA

3 討論

3.1 BGAFs抗原合成方法設(shè)計

BGAFs中AFB1、AFB2的分子量分別為312.27和314.29,屬于小分子半抗原,無免疫原性。依據(jù)半抗原-載體效應(yīng)理論,只有與大分子蛋白質(zhì)載體結(jié)合成人工抗原,才能獲得針對半抗原的特異性抗體,因此,抗原合成方法至關(guān)重要[23]。由于選擇不同活性位點和引入不同連接臂長度均會對小分子的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響,進而影響產(chǎn)生抗體的質(zhì)量[24]。本研究根據(jù)BGAFs的分子結(jié)構(gòu)特征,分別選擇1位羰基、2位活潑氫、3位羥基和醛基、3位與4位之間雙呋喃環(huán)作為活性基團,通過不同的化學(xué)反應(yīng)方式,分別引入可以利用的羧基、羥基、氨甲基等活性基團,實現(xiàn)了與載體蛋白偶聯(lián)合成人工抗原的目的。

表4 AFB1pAb 與 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2 的交叉反應(yīng)Table4 The percent cross-reactivity of AFB1pAb with AFB1、AFB2、AFG1、AFG2

3.2 BGAFs人工抗原的合成路線

目前,關(guān)于BGAFs人工抗原合成方法的研究仍停留在經(jīng)驗層面,多采用試錯法,盡管建立了多種人工抗原鑒定方法,但所制備人工抗原的免疫原性如何,最終還需通過動物免疫的效果得以證實[25]。本研究在參考大量相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上,以AFB1作為反應(yīng)起始物,采用 OAE、MOA、MA、SA、EP 和 EED 6種方法合成人工抗原,并通過UV、SDS-PAGE進行抗原鑒定,用動物免疫進行抗體特性分析,篩選出BGAFs抗體制備最為理想的抗原合成方法是OAE法,其優(yōu)點在于反應(yīng)體系易于構(gòu)建,反應(yīng)條件溫和,操作步驟簡單,產(chǎn)物產(chǎn)率較高。但就本研究所采用的技術(shù)路線的先進性而言,分子模擬、計算機輔助等技術(shù)方面的研究與應(yīng)用仍有待提高[26-27]。

3.3 BGAFs人工抗原的免疫效果分析

本研究旨在篩選出BGAFs人工抗原合成方法,為靈敏度高、特異性強、識別譜廣的BGAFs高質(zhì)量抗體的制備奠定物質(zhì)和技術(shù)基礎(chǔ),這就要求在BGAFs抗原合成設(shè)計中,一方面要考慮抗體對AFB1的特異性和敏感性,以滿足AFB1限量標準下的檢測技術(shù)要求；另一方面要考慮抗體對AFB2的敏感性和廣譜性,以滿足BGAFs限量標準下的檢測技術(shù)要求[28]。謝琿等[29]采用MA法合成AFB1-BSA,篩選出雜交瘤細胞3B9獲得AFB1mab,該抗體特異性識別AFB1,靈敏度達到1.04 μg·kg-1,與 AFB2、AFG1、AFG2、AFM1的 CR 分別為2.2%、33.9%、1.8%和 5.12%,與 AMF2無 CR,廣譜性較差。肖智等[30]采用 SA法合成AFB1-BSA,篩選出雜交瘤細胞3A12獲得AFB1mab,該抗體特異性識別 AFB1,靈敏度達到 6.1 μg·kg-1,與 AFB2、AFG1、AFG2、AMF1的 CR 分別為 7.8%、20.2%、0.6%和3.68%,與AFM2無CR,同樣存在廣譜性差的問題。本研究通過6種不同抗原合成方法合成BGAFs人工抗原AFB1-BSA,結(jié)果表明,OAE法效果最好,所產(chǎn)生AFB1pAb抗體效價高,間接ELISA效價達到1∶(1.28×104)；對 AFB1敏感性好,IC50為 10.32 μg·kg-1；特異性強,可 100%識別 AFB1,與 AFB2、AFG1、AFG2、AMF1、AFM2的 CR 分別為75.21%、44.13%、14.72%、16.36%和1.44%。本研究所設(shè)計的其他5種方法存在不同程度的缺陷,因此建議除開展研究工作之外,一般不予采用。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)AFB1的分子結(jié)構(gòu)特征和已有活性位點,設(shè)計出6種BGAFs抗原合成方法,通過UV、SDSPAGE鑒定和免疫動物所產(chǎn)生的AFB1pAb特性分析,獲得了高效價、敏感、特異、廣譜的AFB1pAb。表明抗原合成設(shè)計是制備高質(zhì)量抗體的前提,OAE法是實現(xiàn)BGAFs高質(zhì)量抗體制備的有效途徑,這為BGAFs免疫檢測方法的建立奠定了物質(zhì)和技術(shù)基礎(chǔ)。