遮陰對油用牡丹葉片衰老生理指標的影響

韓晨靜 王 磊 王 琦 張宏寶 張 琮 周繼磊 董合忠

(1山東省農業(yè)科學院棉花研究中心,山東濟南 250100；2山東省林木種苗和花卉站,山東濟南 250012；3山東省林木種質資源中心,山東濟南 250102)

牡丹(PaeoniaSect.MoutanDC.)原為山區(qū)野生灌木,喜涼惡熱,在高溫高光強的夏季有臨時休眠的習性[1-2]。自2011年,牡丹籽油被批準作為新資源食品以來,油用牡丹,尤其是鳳丹牡丹的栽培面積逐漸擴大,已由山地栽培轉變?yōu)榇筇镌耘郲3-4]。然而,大田內的油用牡丹葉片在7月中下旬通常會出現枯黃、卷曲、干焦等現象[1,5],尤其是1-2年生幼苗,在7月上旬便開始出現葉片發(fā)黃,隨后逐漸脫落,進入休眠。葉片是植物進行光合作用的主要器官,是干物質積累的主要來源。高溫高光強下,油用牡丹葉片早衰勢必會減少光合產物的積累。遮陰可以降低太陽輻射強度和空氣溫度[6-7]。如前期研究發(fā)現,光照強度平均減少18.4%、58.6%和82.1%時,溫度平均分別降低5.5%、6.2%和6.4%[5]。

遮陰降低光照強度的同時,勢必會影響植物的光合性能和相關生理生化特性,進而影響植物的生長指標、產量和品質[8-9]。如,對少花桂幼苗進行不同程度的遮陰,其凈同化率變化趨勢為一層遮陰＞自然光照＞二層遮陰＞三層遮陰[10]；牡丹觀賞品種大胡紅在夏季進行遮陰處理后,其葉片中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)的含量顯著減少[11]；杜鵑花幼苗在遮陰31.28%時,植株光飽和點、凈光合速率和生物量積累得到了顯著提高,且植株幼苗的株高和葉面積也得到了提高[12]；此外,遮陰還可以提高斑葉海棠枝條的產量和品質[13]。前期研究也發(fā)現,輕度遮陰顯著提高了牡丹籽的產量和品質[5]。

牡丹籽收獲前28 d測定不同遮陰處理下葉片的光合性能和生理指標,結果顯示,輕度遮陰下葉片的光合性能、葉綠素含量等顯著高于對照,推斷輕度遮陰可能延緩葉片衰老,增加光合產物積累從而提高牡丹籽的產量和品質[5],但遮陰后葉片生理指標的變化,輕度遮陰延緩葉片衰老、提高光合性能等的初始時期尚不明確,本研究分析遮陽對葉片生理指標動態(tài)變化規(guī)律的影響,以期揭示輕度遮陰提高牡丹籽產量和品質的生理機制,明確最佳遮陰時間。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和試驗材料

在2015年和2016年試驗基礎上[5],2017年繼續(xù)在山東省濟南市長清區(qū)雙泉鎮(zhèn)油用牡丹種植基地(36.35°N,116.72°E；海拔 111 m)開展遮陰試驗。 該基地油用牡丹生長主要集中在5-7月份,平均最高氣溫31.38℃,平均最低氣溫 21.69℃,平均降水量108.73 mm。所選油用牡丹品種為鳳丹牡丹,為2013年移栽的2年生苗,株行距為40 cm×60 cm。盛花期后28 d,在鳳丹牡丹長勢一致的地塊,用3種不同密度遮陽網進行遮陰處理,遮光率分別為18.4%、58.6%和82.1%,對應輕度、中度、重度遮陰3種處理。遮陽網尺寸為8 m×4 m,每個遮陽網設定高1.4 m,用6根鍍鋅鋼管和6個地錨進行固定。采用完全隨機區(qū)組試驗,每個處理3個重復。選相同面積不遮陰區(qū)域作為對照。

每個處理隨機選擇5株進行生理指標的測定。在搭建遮陽網后14 d(即盛花期后42 d)開始采集葉片,每隔14 d采集一次。葉片采集后立即保存于液氮中,用于生理生化指標的測定。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 光合性能的測定 選取完全展開的成熟葉片,選擇晴朗的天氣,于正午12:00用Li-6400便攜式光合測定系統(tǒng)(Li-Cor,Lincoln,NE,USA)測定葉片的凈光合速率(Pn,遮陽網下葉片的瞬時凈光合速率)。

測定前,將葉片在光合作用飽和光強下至少誘導30 min。測定時使用大氣CO2濃度,用6400-02B LED紅藍光源控制光強,依次設定光合光量子通量密度(photosynthetic photon flux density,PPFD)為 2 000、1 500、1 000、800、600、400、200、100、0 μmol·m-2·s-1,每一光強下至少停留200 s。以PPFD為橫軸,Pn為縱軸,繪制光合作用光響應曲線,采用光合統(tǒng)計軟件計算最凈光合速率(Pmax)。

1.2.2 生理指標的測定 用乙醇∶丙酮混合液(1∶2,v/v)提取葉綠素(Chl)。分別采用蘇州科銘生物技術有限公司生產的MDA含量試劑盒(硫代巴比妥酸法)、脯氨酸(proline,Pro)含量試劑盒(酸性茚三酮法)、H2O2含量試劑盒(硫酸鈦法)測定葉片中MDA、Pro、H2O2的積累。分別按照蘇州科銘生物技術有限公司生產的過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒、過氧化物酶(peroxidase,POD)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒說明書測定CAT、POD、SOD活性。

1.2.3 內源激素的測定 采用酶聯免疫吸附測定法[14]測定生長素(auxin,IAA)、赤霉素(gibberellic acid,GA3)、脫落酸(abscisic acid,ABA)含量。提取液為含有1 mmol·L-1二叔丁基對甲苯酚(2,6-Di-tertbutyl-4-methylphend,BHT)的80%甲醇溶液。葉片組織加入提取液后冰浴研磨,低溫下充分提取5 h,離心,收集上清液。氮吹,樣品稀釋液定容后,向酶標板中加入標準樣品、待測樣品和抗體。用酶聯免疫分光光度計(Biotek Epolch2,美國)測定標準樣品和待測樣品在490 nm處的吸光值。

1.3 數據分析

試驗數據為每個處理的3個重復的平均值,使用SPSS 16.0軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 遮陰對光合性能的影響

由圖1可知,油用牡丹葉片的 Pn、Pmax、Chl含量均隨發(fā)育進程呈逐漸降低的趨勢,且遮陰對Pn、Pmax、Chl含量有顯著影響。輕度遮陰下,在花后70 d前,Pn低于對照,70 d后Pn高于對照,且隨著生育進程推進差異逐漸增大,并在112 d時,與對照相差最大,較對照高215.5%,平均較對照高51.7%；Pmax僅在56 d時較對照低6.5%,其余時期均高于對照,并在112 d時差異最大,較對照高265.6%,平均較對照高78.1%；Chl含量始終高于對照,且差異逐漸增大,在112 d時,較對照高178.5%,平均較對照高63.1%。中度遮陰下,Pn在遮陰初始顯著低于對照,隨后差異縮小,最終高于對照,平均較對照低1.3%；Pmax在70 d前低于對照,70 d后顯著高于對照,并在112 d差異最大,較對照高186.5%,平均較對照高46.8%；Chl含量始終高于對照,且差異在112 d達到最大,較對照高247.4%,平均較對照高86.4%。重度遮陰下,Pn在84 d前顯著低于對照,但隨著發(fā)育進程推進差異逐漸減??；Pmax在84 d前顯著低于對照,84 d后顯著高于對照；Chl含量始終顯著高于對照,且差異逐漸增大,整個過程中,Pn平均較對照低 24.3%,Pmax平均較對照高36.3%,Chl含量平均較對照高113.1%。

圖1 遮陰對油用牡丹葉片Pn、Pmax、Chl含量的影響Fig.1 Effects of shading on the Pn， Pmaxand Chl content of oilseed peony leaves

2.2 遮陰對脂質過氧化的影響

油用牡丹葉片中MDA、H2O2及Pro含量均隨發(fā)育進程逐漸增加,遮陰對MDA、H2O2、Pro的含量影響顯著(圖2)。輕度遮陰下,MDA、H2O2、Pro含量均低于對照,其中,MDA、H2O2含量在98 d時與對照差異最大,分別較對照低26.0%和28.5%,平均分別較對照低22.9%和25.2%；Pro含量在42 d時與對照相差最大,較對照低27.7%,平均較對照低19.0%。中度遮陰下,MDA、H2O2含量低于對照,并在112 d時與對照相差最大,分別較對照低28.6%和23.0%,平均分別較對照低23.8%和18.1%；Pro含量在84 d時與對照相差最大,較對照低21.1%,平均較對照低17.3%。重度遮陰下,MDA、H2O2含量始終低于對照,MDA在42 d時與對照差異最大,較對照低22.2%,平均較對照低 12.1%；H2O2含量在98 d時較對照最低,為14.1%,平均較對照低10.4%；Pro含量均高于對照,在98 d時與對照差異最大,較對照高13.0%,平均較對照高10.1%。

圖2 遮陰對油用牡丹葉片Pro、MDA、H2O2含量的影響Fig.2 Effects of shading on the Pro， MDA and H2O2content of oilseed peony leaves

2.3 遮陰對抗氧化酶活性的影響

油用牡丹葉片中CAT、POD、SOD活性均隨發(fā)育進程逐漸降低,遮陰顯著影響CAT、POD、SOD活性(圖3)。輕度遮陰下,CAT、POD、SOD活性始終高于對照,且差異逐漸增大。其中,CAT活性在98 d時與對照相差最大,較對照高18.0%,平均較對照高11.4%；POD、SOD活性在112 d時與對照差異最大,分別較對照高40.8%、17.5%,平均分別較對照高 19.5%、12.5%。中度遮陰下,CAT、POD、SOD活性均高于對照,且CAT活性在98 d、POD活性在112 d、SOD活性在42 d時與對照差異最大,分別較對照高16.0%、15.5%、13.4%。整個過程中,CAT、POD、SOD活性平均分別較對照高9.6%、9.2%、9.2%。重度遮陰下,CAT活性僅在42 d時高于對照,平均較對照低3.5%；POD活性在98 d前較對照低,之后高于對照,平均較對照低3.6%；SOD活性僅在84 d時低于對照,平均較對照高2.5%。

圖3 遮陰對油用牡丹葉片CAT、POD、SOD活性的影響Fig.3 Effects of shading on the CAT，POD and SOD activity of oilseed peony leaves

2.4 遮陰對內源激素含量的影響

油用牡丹葉片中IAA、GA3含量隨發(fā)育進程逐漸降低,ABA含量隨發(fā)育進程逐漸增加。遮陰對IAA、GA3、ABA含量有顯著影響(圖4)。輕度遮陰下,IAA、GA3含量始終高于對照,且差異隨著生育進程有逐漸增大的趨勢,ABA含量始終低于對照,其差異隨著生育進程呈逐漸減小的趨勢。其中IAA含量在84 d時與對照差異最大,較對照高38.0%,平均較對照高25.1%；GA3含量在98 d時與對照差異最大,較對照高13.3%,平均較對照高6.0%；ABA含量在56 d時與對照差異最大,較對照低 12.5%,平均較對照低9.6%。中度遮陰下,IAA、GA3含量高于對照,與對照的差異隨著生育進程呈逐漸增大的趨勢,ABA含量低于對照,其差異隨著生育進程表現為先增大后減小的趨勢；在98 d時,IAA含量較對照高54.3%,平均較對照高 34.9%；GA3含量在 112 d時較對照最高,為21.5%,平均較對照高10.8%；ABA含量在70 d時較對照最低,為19.7%,平均較對照低14.4%。重度遮陰下,內源激素含量變化趨勢與中度遮陰相似,IAA、GA3含量在98 d時與對照差異最大,分別較對照高54.3%、21.5%,平均分別較對照高 43.2%、13.4%；ABA含量在70 d時較對照最低,為29.7%,平均較對照低20.4%。

圖4 遮陰對油用牡丹葉片IAA、GA3、ABA含量的影響Fig.4 Effects of shading on the IAA，GA3and ABA content of oilseed peony leaves

3 討論

我國牡丹野生種質主要分布于河南、甘肅、陜西、安徽等海拔1 100～2 800 m的懸崖、山區(qū)灌叢和次生闊葉林[15]。因部分品種種子含油量較高,且α-亞麻酸含量高,具有較高的油用價值,在低海拔的平原地區(qū)也被推廣種植。油用牡丹在由山區(qū)生長轉向大田種植過程中,通常會出現葉片枯黃、早衰甚至脫落等現象,這與其他由高海拔種植轉向低海拔種植的植物表現相似[6,16]。因此,種植環(huán)境與原生境差異較大通常會引起植株生長不良,甚至死亡。

為避免植物生長期內高溫、高光強危害,一般通過遮陰來提供適宜的生長環(huán)境。如對獼猴桃葉片進行不同程度遮陰發(fā)現,樹冠微氣候顯著改善,溫度大幅下降,濕度上升,葉片光合作用“午休”現象消除,自然條件下的全天Pn顯著低于各遮陰處理,蒸騰速率也有所下降,有效緩解了葉片、果實的生理脅迫,減少了落葉落果的發(fā)生[6]。遮陰可有效降低光照強度、氣溫和土壤溫度,提高土壤水分含量、空氣濕度,因此遮陰下的金蓮花生長健壯,觀賞期明顯延長[16]。

生態(tài)因子差異導致葉片脂質過氧化、保護酶活性、激素等的變化[17-18]。氧自由基作用于脂質的不飽和脂肪酸,生成過氧化脂質,后者逐漸分解為一系列復雜的化合物,其中包括MDA,因此MDA含量可以反映脂質氧化的水平,揭示植物遭受逆境傷害的程度[19]。本研究結果表明,輕度遮陰下,油用牡丹葉片MDA含量均低于對照,在整個測定階段,平均較對照低22.9%；而重度遮陰下,油用牡丹葉片MDA含量平均值雖然低于對照,但高于輕度遮陰,表明重度遮陰對油用牡丹形成了弱光脅迫。Pro是一種有機溶質滲透調節(jié)物質,高等植物在受到逆境脅迫時會積累大量的Pro[20-21]。本研究中,遮陰后油用牡丹葉片中的Pro含量下降,說明高溫、高強光已對油用牡丹產生了傷害,植物體通過增加Pro含量來緩解這種脅迫,這與強光脅迫能夠促進Pro積累的結果相一致[22]。SOD、CAT是植物體內活性氧清除酶系統(tǒng),SOD可以使Mehler反應中產生的轉化成 H2O2,后者進一步被 CAT、POD分解,從而使膜脂過氧化維持在一定水平。本研究發(fā)現,在輕度遮陰下,SOD、POD和CAT活性整體高于其他3個處理,H2O2、MDA含量也較低,說明該處理下油用牡丹受到了較好的保護[11,18]。而在重度遮陰下,雖然SOD和POD活性較高,但H2O2和MDA含量也相對較高,表明過度遮陰不利于油用牡丹生長。

激素是植物體內重要的信號物質,環(huán)境因素通過誘導植物產生不同激素來調控葉片衰老,如ABA在逆境下會大量積累[23],促進葉片衰老。朱中華等[24]分析了內源激素對小麥葉片的衰老調控,結果顯示小麥葉片內源激素IAA、GA3、ABA含量與Chl含量的相關性均達到極顯著水平,其中IAA、GA3含量與Chl含量顯著正相關,有延緩衰老的作用,ABA含量與Chl含量呈顯著負相關,會促進葉片衰老。本研究中,對照油用牡丹葉片有較低的IAA和GA3含量、較高的ABA含量和較低的Chl含量,表明內源激素調控著葉片的枯黃,將進一步促進葉片衰老、脫落；在遮陰后,油用牡丹葉片較對照有較高的IAA和GA3含量、較低的ABA含量和較高的Chl含量,表明遮陰通過調控激素水平延緩了油用牡丹葉片的衰老,這在其他植物中也有相似報道[25]。

通過分析牡丹籽的發(fā)育特性及營養(yǎng)物質積累的動態(tài)變化,將其發(fā)育過程分為快速生長期(開花至花后70 d)、緩慢生長期(花后71～98 d)和成熟期(花后99～112 d)3個階段[26]。本研究對油用牡丹葉片光合性能的測定結果顯示,花后84、98、112 d,對照葉片中Pn低于遮陰處理,即在緩慢生長期和成熟期,遮陰處理的葉片尤其是輕度遮陰處理下的葉片始終保持相對較高的Pn,說明輕度遮陰處理下的葉片始終保持較高且穩(wěn)定的光合產物積累。究其原因,可能是因為遮陰避免了強光抑制,延長了葉片功能期[27]。葉片綠色葉面積是判斷光合作用強弱最直接的感官性狀[28],在一定程度上決定了葉片的光合面積和光合時間,進而影響葉片的光合有效期。前期試驗發(fā)現,油用牡丹花后84 d時,對照葉片發(fā)黃并伴有褐色枯焦斑點,而遮陰處理下的葉片仍保持綠色[26]。Chl含量的變化通常被認為是衡量葉片衰老的良好指標,本研究中,Chl含量的測定結果顯示,Chl衰減程度與可視的葉色表現一致,對照葉片的Chl含量遠低于遮陰處理,表明在緩慢生長期和成熟期,對照葉片已衰老,Pn嚴重下降。

4 結論

在油用牡丹盛花期28 d進行輕度、中度、重度遮陰,輕度遮陰下,在緩慢生長期和成熟期Pn、Pmax、Chl含量高于對照,H2O2、MDA、Pro的積累低于對照,CAT、POD、SOD活性高于對照,IAA、GA3含量高于對照,ABA含量低于對照；中度遮陰下,Pn僅在成熟期高于對照；重度遮陰下,Pro的積累始終高于對照。在緩慢生長期和成熟期改善葉片光合性能,延緩葉片衰老是輕度遮陰提高牡丹籽產量和品質的生理學基礎,因此,在緩慢生長期(花后71 d)前后對油用牡丹輕度遮陰是更為有效的栽培方式。