毛紅椿凋落葉水浸液自毒作用研究

郭曉燕 陶國峰 張 露 易 敏 程子珊 黃 若

(1江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院/江西特色林木資源培育與利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心,江西南昌 330045；2縉云縣括蒼山林場,浙江麗水 321404)

毛紅椿(Toona ciliatavar.pubescens)為楝科(Meliaceae)香椿屬(Toona)高大落葉喬木,是國家二級保護瀕危物種,結(jié)實量豐富,但結(jié)實母樹周圍鮮見其實生幼苗[1],有性繁殖更新能力極低[2]。

自毒作用是植物通過釋放次生代謝物對自身或種內(nèi)其他個體產(chǎn)生危害的一種現(xiàn)象[3-4],會導致作物連作障礙[5]或限制植物的更新[6]。毒性物質(zhì)幾乎可以由植物的任何組織或器官合成,通過殘體腐解、根系分泌、雨霧淋溶和自然揮發(fā)等方式進入環(huán)境,影響周圍植物的生長發(fā)育[7-8]。通常天然林內(nèi)具有較厚實的枯枝落葉,且這些凋落物是自毒物質(zhì)的重要來源,對森林更新的影響較大[9-10]。林下凋落物自毒作用的研究多集中在地中海松(Pinus halepensis)[11]、青海云杉(Picea crassifolia)[12]等針葉樹種。近年來越來越多闊葉樹種如云南藍果樹(Nyssa yunnanensisW.C.Yin)[13]、大樹杜鵑[Rhododendron protistumvar.giganteum(Forrest)D.F.Chamberlain][14]等的凋落物被證實對自身種子萌發(fā)和幼苗生長有自毒作用,冠層下累積凋落物的自毒作用是導致冠層下同種幼苗難以存活的主要原因[6,15]。

毛紅椿天然林內(nèi)通常有2～4 cm厚的枯枝落葉凋落物,林內(nèi)鮮見其實生幼苗,林下凋落物的自毒作用是否會導致毛紅椿自然再生失敗尚不明確。前期研究發(fā)現(xiàn)毛紅椿落葉腐解物浸提液會影響自身種子發(fā)芽和幼苗生長[16],而作為自毒物質(zhì)重要來源的毛紅椿枯枝落葉凋落物,是否會通過淋溶、揮發(fā)途徑對其種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生自毒影響尚不清晰。為此,本研究模擬凋落物在自然生境中淋溶過程,設(shè)置不同濃度毛紅椿凋落葉水浸液處理毛紅椿種子,觀察種子萌發(fā)和幼苗生長狀況,采用氣相色譜質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用技術(shù)分析凋落物水浸液中的化學成分,明確其自毒物質(zhì)類型,旨在為探明毛紅椿凋落物對其天然更新影響的化學機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在毛紅椿林內(nèi)收集其凋落葉,曬干備用。試驗用種采自江西官山國家級自然保護區(qū)毛紅椿天然林,種子千粒重11.907 g。

1.2 試驗設(shè)計與測定方法

1.2.1 毛紅椿凋落葉水浸液制備 稱取100 g毛紅椿凋落葉于燒杯中,加入500 mL蒸餾水,室溫(25℃)下浸提48 h(每隔15 h搖動10 min),過濾后 5 000 r·min-1離心 10 min,取上清液,得到 200 g·L-1毛紅椿凋落葉水浸液母液。將母液用蒸餾水稀釋配制成3種濃度(10、100、200 g·L-1)待用,以蒸餾水為對照(control,CK)。

1.2.2 毛紅椿凋落葉水浸液自毒作用的生物檢測利用3種濃度(10、100、200 g·L-1)水浸液和蒸餾水,分別浸泡毛紅椿種子24 h；將3種濃度水浸液和蒸餾水分別加入鋪有2 cm厚棉花和1層濾紙的發(fā)芽盒內(nèi),每個發(fā)芽盒內(nèi)置放100粒種子；采用隨機區(qū)組設(shè)計,4種處理,各3次重復。

將發(fā)芽盒放入25℃光照培養(yǎng)箱進行發(fā)芽試驗,每隔2 d添加1次相應(yīng)濃度的水浸液或蒸餾水。每天觀察種子發(fā)芽及幼苗生長情況,當胚根突破種皮1～2 mm時計為發(fā)芽,統(tǒng)計發(fā)芽粒數(shù),記錄存活幼苗數(shù),待幼苗開始出現(xiàn)大量死亡時結(jié)束試驗。20 d后測量幼苗根長、莖長和干重,計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI)、幼苗存活率及化感效應(yīng)指數(shù)(response index,RI)[16]:

式中,Dt為發(fā)芽日數(shù),Gt為與Dt相對應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)。

式中,T為處理值,C為對照值,分別代表處理組和對照組種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)；RI＞0表示促進作用,RI＜0表示抑制作用,RI的絕對值代表化感作用的強度。

1.2.3 毛紅椿凋落葉水浸液成分分析 在4支試管中分別加入毛紅椿凋落葉水浸液母液10 mL,濾紙封口,置于-80℃冰箱冷凍至固態(tài),取出置于冷凍干燥機內(nèi)去除水分,再向4支試管內(nèi)分別加入5 mL色譜純石油醚、乙醚、氯仿、甲醇4種極性由低到高的有機溶劑進行萃取,萃取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后用于GC-MS(美國安捷倫科技有限公司)分析[17]。GC-MS系統(tǒng)配自動進樣器,氦(純度99.999%)用作載氣,流速 1.0 mL·min-1,進樣 1μL,分流比 20∶1,進樣口溫度250℃,色譜柱為Agilent 123-1334 DB-624毛細管柱(30 m×0.32 mm×1.8 μm),柱溫箱初始溫度為 70℃,保持3 min,然后以15℃·min-1升至200℃,保持3 min,再以5℃·min-1升至300℃,保持5 min；質(zhì)譜條件為全掃模式,離子源為EI源,離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,離子化能量 70 eV,掃描范圍為 29～650 amu,掃描頻率2次·s-1；用Agilent MSD化學工作站(G1701EA,Agilent Technologies America)進行數(shù)據(jù)處理,應(yīng)用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST11.L,通過計算機檢索系統(tǒng)進行物質(zhì)的鑒定,采用峰面積歸一法進行相對含量的測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析,并用Student-Newman-Keuls法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛紅椿凋落葉水浸液對毛紅椿種子萌發(fā)的影響

由表1可知,隨著水浸液濃度的升高,毛紅椿種子萌動時間逐漸推遲,種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均逐漸降低,其中100和200 g·L-1水浸液處理與CK間差異顯著?；兄笖?shù)均為負值,表現(xiàn)為抑制作用,抑制強度隨著水浸液濃度升高而增大。100 g·L-1水浸液對種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)的抑制率分別為18%、31%和31%；200 g·L-1水浸液對種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)的抑制率分別達到33%、55%和44%。表明毛紅椿凋落葉水浸液能夠抑制毛紅椿種子發(fā)芽,且水浸液濃度越高其抑制作用越強。

2.2 毛紅椿凋落葉水浸液對毛紅椿幼苗生長的影響

由表2可知,不同濃度毛紅椿凋落葉水浸液對毛紅椿幼苗的根長、莖長、干重的影響存在差異。毛紅椿幼苗莖長、根長、干重均隨著水浸液濃度的升高而逐漸減小；化感指數(shù)均為負值,表現(xiàn)為抑制作用,且抑制強度隨著水浸液濃度的升高而增大。其中,10 g·L-1水浸液處理的毛紅椿幼苗根長顯著低于CK,對幼苗根長的抑制率為25%,幼苗莖長、干重與CK無顯著性差異；100 g·L-1水浸液處理下,毛紅椿幼苗莖長、根長、干重均顯著低于CK,對幼苗莖長、根長的抑制率分別為17%和46%；200 g·L-1水浸液處理的幼苗莖長顯著低于CK和100 g·L-1水浸液處理,對幼苗莖長、根長的抑制率分別為23%和53%。結(jié)果表明,毛紅椿凋落葉水浸液能夠抑制幼苗芽長、根長和干重的增加,且水浸液濃度越高其抑制作用越強。

表1 毛紅椿凋落葉水浸液處理下種子發(fā)芽情況Table1 Seed germination of T.ciliata var.pubescens treated with aqueous extracts from leaf litter

表2 毛紅椿凋落葉水浸液處理下幼苗莖長、根長、干重Table2 Root length，shoot length，dry weight of seedling of T.ciliata var.pubescens treated with aqueous extracts from leaf litter

2.3 毛紅椿凋落葉水浸液對毛紅椿幼苗存活的影響

由表3可知,不同濃度水浸液處理的毛紅椿幼苗發(fā)生數(shù)、存活數(shù)及存活率均隨著水浸液濃度的升高而降低,10 g·L-1水浸液處理下毛紅椿幼苗發(fā)生數(shù)、存活數(shù)及存活率與CK無顯著性差異,而100和200 g·L-1水浸液處理下毛紅椿幼苗發(fā)生數(shù)、存活數(shù)及存活率均顯著低于CK,幼苗存活率分別降低10.5%和23.5%。結(jié)果表明,毛紅椿凋落葉水浸液能夠降低幼苗存活率。

表3 毛紅椿凋落葉水浸液處理下幼苗發(fā)生數(shù)、存活數(shù)及存活率Table3 Total seedling emergence， final seedling survlve number and seedling survive rate of T.ciliata var.pubescens treated with aqueous extracts from leaf litter

2.4 毛紅椿凋落葉水浸液化學成分分析結(jié)果

毛紅椿凋落葉水浸液石油醚萃取相GC-MS分析圖譜如圖1所示。由表4可知,經(jīng)譜庫分析,水浸液石油醚萃取相中匹配度大于90%的主要成分為順-9-十八烯酸酰胺(72.88%)、反式-9-十八碳烯酸(15.60%)、十八碳烷酸(4.22%)、齊墩果腈(4.31%)、水楊酸甲酯(1.24%)和細辛醚(1.01%)。

圖1 毛紅椿凋落葉水浸液石油醚萃取相GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion flow diagram of the petroleum ether extraction phase of aqueous extracts from leaf litter of T.ciliata var.pubescens

表4 毛紅椿凋落葉水浸液石油醚萃取相的主要化學成分Table4 Major chemical constituents in the petroleum ether fraction of aqueous extracts from leaf litter of T.ciliata var.pubescens

毛紅椿凋落葉水浸液乙醚萃取相GC-MS分析圖譜如圖2所示。由表5可知,經(jīng)譜庫分析,水浸液乙醚萃取相中匹配度大于90%的主要成分為順-9-十八烯酸酰胺(67.09%)、順式-十八碳烯酸(16.75%)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(6.38%)、2,4-二叔丁基苯酚(5.43%)、十八碳烷酸(3.17%)、γ-松油烯(1.28%)。

圖2 毛紅椿凋落葉水浸液乙醚萃取相GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion flow diagram of the diethyl ether extraction phase of aqueous extracts from leaf litter of T.ciliata var.pubescens

表5 毛紅椿凋落葉水浸提液乙醚萃取相的主要化學成分Table5 Major chemical constituents in the diethyl ether fraction of aqueous extracts from leaf litter of T.ciliata var.pubescens

毛紅椿凋落葉水浸液氯仿萃取相GC-MS分析圖譜如圖3所示。由表6可知,經(jīng)譜庫分析,水浸液氯仿萃取相中匹配度大于90%的主要成分為順-9-十八烯酸酰胺(54.23%)、十八碳烯酸(19.65%)、十八碳烷酸(5.30%)、二甲苯(8.20%)、烷烴(1.64%)、芥酸酰胺(1.46%)。

毛紅椿凋落葉水浸液甲醇萃取相GC-MS分析圖譜如圖4所示。由表7可知,經(jīng)譜庫分析,水浸液甲醇萃取相中匹配度大于90%的的主要成分為順式-9-十八烯酸酰胺(18.27%)、順式-13-十八碳烯酸(15.18%)、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(6.60%)、十八碳烷酸(3.43%)、十六烷酸(2.89%)等。

圖3 毛紅椿凋落葉水浸液氯仿萃取相GC-MS總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion flow diagram of the chloroform extraction phase of aqueous extracts from leaf litter of T.ciliata var.pubescens

表6 毛紅椿凋落葉水浸液氯仿萃取相的主要化學成分Table6 Major chemical constituents in the chloroform fraction of aqueous extracts from leaf litter of T.ciliata var.pubescens

圖4 毛紅椿凋落葉水浸液甲醇萃取相GC-MS總離子流圖Fig.4 GC-MS total ion flow diagram of the methanol extraction phase of aqueous extracts from leaf litter of T.ciliata var.pubescens

3 討論

許多學者發(fā)現(xiàn)森林凋落物數(shù)量通常與天然更新幼苗數(shù)量呈負相關(guān)關(guān)系[15,17]。凋落物對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響是一個物理、化學共同作用的過程。物理原因是過厚的凋落物層或因減少種子萌發(fā)所需的光照從而影響種子萌發(fā),或因機械障礙作用阻斷種子與土壤的接觸,導致萌發(fā)幼苗難于扎根或生長；化學原因是凋落物中存在的豐富的化感物質(zhì)抑制了種子萌發(fā)和成苗[13,18]?？萋湮锖穸群头N子位置會顯著影響毛紅椿種子萌發(fā)和幼苗生長,證明了毛紅椿凋落物對其天然更新的物理影響[19]；本研究發(fā)現(xiàn)毛紅椿落葉水浸液對種子發(fā)芽和幼苗的生長表現(xiàn)為抑制作用,水浸液濃度越高抑制作用越強,幼苗的存活率越低,表明毛紅椿凋落葉中含有水溶性自毒物質(zhì),且自毒作用具有一定的濃度依賴性。加上前期研究證實腐解3個月后的毛紅椿落葉腐解物浸提液(采用無水乙醇∶丙酮∶水=2∶2∶1混合液提取)對毛紅椿種子發(fā)芽具有抑制作用[16],在一定程度上揭示了毛紅椿凋落物對其天然更新影響的化學機制。前人研究表明,自毒效應(yīng)與凋落物質(zhì)量分數(shù)有關(guān),一般表現(xiàn)為凋落物質(zhì)量分數(shù)越高自毒作用越強。如 Warrag[20]研究牧豆樹(Prosopis juliflora)自毒作用發(fā)現(xiàn),牧豆樹干葉水提取液極大降低了牧豆樹種子發(fā)芽率、胚根和下胚軸長度,且隨著提取液濃度的增加,下降趨勢逐漸增強。這與本研究結(jié)果相同。

化感物質(zhì)主要是在植物體內(nèi)通過生物途徑合成的次生代謝物質(zhì),貯存于植物體內(nèi)、周圍根際土壤及其凋落物中,能促進或抑制自身或周圍其他生物的生存及生長發(fā)育,具有種內(nèi)抑制作用[7]。研究表明,植物的不同組織器官對化感物質(zhì)的敏感度存在差異[21-22]。本研究中,毛紅椿落葉水浸液對幼苗根長的影響強于對幼苗莖長和種子芽率的影響。前期研究表明毛紅椿腐葉及腐葉土浸提液對根生長的化感指數(shù)高于對莖生長的化感指數(shù)[16],這與本研究結(jié)果一致,說明根的生長對化感物質(zhì)更敏感。王麗紅等[12]研究表明,青海云杉凋落針葉水提物顯著抑制了青海云杉幼苗胚根和胚軸的生長,4.00 g·L-1針葉水提物處理組的發(fā)芽率較對照降低48.1%,而幼苗胚根和胚軸分別較對照降低57.5%和73.5%；Chon等[23]對苜蓿自毒生物測定靈敏度的研究發(fā)現(xiàn),苜蓿幼苗根長較種子萌發(fā)或子葉下軸長度對自身毒素更敏感,且年長幼苗的根因有更多的分枝可逃避自身毒素,較種子或年輕幼苗的根更能耐受苜蓿葉提取物,因此利用對自身毒素更敏感的吸脹種子萌發(fā)的幼根進行自毒作用的生物測定效果更明顯。研究表明,植物器官釋放的自毒物質(zhì)能夠抑制根毛的形成、破壞根皮和內(nèi)根組織,從而使根喪失功能,嚴重的自毒效應(yīng)導致幼苗存活率降低[6,24]。本研究中,毛紅椿凋落葉水浸液處理下的幼苗存活率降低也證明自毒物質(zhì)對胚根的毒害作用導致幼苗存活率降低。有研究者認為,成年大樹附近實生幼苗難以存活,也與林內(nèi)低光照有關(guān)[25-26],而Fernandez等[11]研究發(fā)現(xiàn)光照不會影響地中海松種子的萌發(fā)和幼苗的早期生長速率,但在幼樹階段起著重要作用；Devaney等[15]在紅豆杉(Taxus baccataL.)冠層下的盆栽試驗表明,低光照下紅豆杉幼苗的存活率最高,而冠層下幼苗難以存活主要與針葉通過淋溶或腐解釋放的自毒物質(zhì)有關(guān)。

迄今為止,已知植物釋放的化感物質(zhì)大概分為14類,包括簡單不飽和內(nèi)酯,萘醌、蒽醌和復合醌,長鏈脂肪酸和多炔,水溶性有機酸、直鏈醇、脂肪族醛和酮,簡單酚、苯甲酸及其衍生物等[27]。本研究從毛紅椿凋落葉水浸液中鑒定出酰胺類、長鏈脂肪酸及其酯類、酚類、苯甲酸衍生物、烷烴類、腈類、二甲苯、松油烯及谷甾醇共9類化合物,其中酰胺類和長鏈脂肪酸在各萃取相中均有檢出,且含量分列第一和第二。毛紅椿凋落葉水浸液氯仿萃取相中含有2種酰胺類物質(zhì):順式-9-十八烯酸酰胺和芥酸酰胺。也有其他研究者在植物葉片、果實和土壤有機質(zhì)中檢測到高含量的十八烯酸酰胺(油酸酰胺)和芥酸酰胺[28-31],韋瑋[30]研究表明不同濃度的順式-9-十八烯酸酰胺對馬尾松種子的活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)以及胚根長均具有抑制作用。毛紅椿凋落葉水浸液中檢測出十八碳烯酸、十八碳烷酸、十六烷酸屬長鏈脂肪酸,是已報道的化感物質(zhì)[27]。酚類物質(zhì)是重要的植物次生代謝物質(zhì)之一,對植物生長發(fā)育有一定的調(diào)節(jié)作用,其中一元酚會抑制植物的生長,而二元酚或多元酚對植物生長有促進作用[32]。毛紅椿凋落葉水浸液乙醚萃取相中檢測到2,4-二叔丁基苯酚,甲醇萃取相中檢測到4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(對乙烯基愈瘡木酚)等酚類物質(zhì)。2,4-二叔丁基苯酚存在于某些植物葉片及根系分泌物中[33-34]。周寶利等[34-35]研究發(fā)現(xiàn)2,4-二叔丁基苯酚是茄子根系分泌物中特征性化合物,對番茄種子的萌發(fā)、幼苗的株高、莖粗、地上和地下部鮮重、葉綠素含量、根系活力和幼苗體內(nèi)保護酶活性表現(xiàn)為低濃度(0.01～0.1 mmol·L-1)促進高濃度(0.5 mmol·L-1)抑制。 對乙烯基愈瘡木酚為植物的揮發(fā)性成分[36],是GB 2760-2014[37]規(guī)定允許使用的食品用香料。毛紅椿凋落葉水浸液乙醚萃取相中含有鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯,據(jù)報道鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯普遍存在于環(huán)境及動植物體內(nèi),是具有全球性的環(huán)境有機污染物,但對植物產(chǎn)生危害的可能性較低[38-39]。凋落葉水浸液氯仿萃取相檢測出十二碳烷和十四碳烷2種烷烴類物質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)烷烴類物質(zhì)多為結(jié)構(gòu)復雜的化合物在質(zhì)譜儀中斷裂生成,而不完全歸屬于化感自毒成分[40]。毛紅椿凋落葉水浸液中還含有齊墩果腈、水楊酸甲酯、細辛醚和γ-松油烯。齊墩果腈[41]和水楊酸甲酯[42]是某些植物的香氣組分；水楊酸甲酯屬苯甲酸衍生物,是已報道的化感物質(zhì)；細辛醚(α-細辛腦)是中藥石菖蒲的主要有效成分,具有多種生物活性[43]；γ-松油烯為植物精油成分[44],其生理活性尚不明確。毛紅椿樹葉具有芳香氣味與其所含有的揮發(fā)油成分有關(guān),其生理活性有待進一步研究。前期研究在毛紅椿腐葉浸提液中鑒定出36種物質(zhì),其主要成分為谷甾醇、豆甾-4-烯-3-酮、棕櫚酸等脂肪酸及其酯類[16],種類多于毛紅椿凋落葉水浸液,除十八碳烯酸、十六烷酸、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯及γ-谷甾醇外大多數(shù)為新檢測出的物質(zhì),說明凋落葉通過淋溶方式釋放的化感物質(zhì)與分解釋放的化感物質(zhì)有所不同。

4 結(jié)論

毛紅椿凋落葉水浸液能夠降低毛紅椿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù),抑制幼苗的莖長、根長和干重的增加,降低幼苗的存活率,水浸液濃度越高其對毛紅椿種子發(fā)芽率、幼苗生長和存活的負作用越強；毛紅椿凋落葉水浸液中含有的酰胺類、長鏈脂肪酸、酚類、苯甲酸衍生物等可能為自毒物質(zhì)。以往毛紅椿成熟冠層下實生幼苗缺乏,通常歸因于林內(nèi)環(huán)境蔭蔽與林地枯枝落葉層的機械阻隔,使毛紅椿失去了對瞬時土壤種子庫保存與種子萌發(fā)的有利環(huán)境。本研究結(jié)果表明,毛紅椿幼苗更新失敗還與凋落葉浸出液中的植物毒性物質(zhì)有關(guān)。今后還需要對毛紅椿植株中存在的其他化感物質(zhì)及釋放到環(huán)境后的轉(zhuǎn)變過程進行深入研究,以便更好地從化學生態(tài)學角度闡述植物-土壤-植物之間的復雜關(guān)系。