ClassⅠ新城疫病毒單克隆抗體的制備

楊少華　張琳　崔寧　黃慶華　黃艷艷　許傳田

摘要：本試驗(yàn)以純化的新城疫病毒（NDV）弱毒株D58為免疫原免疫6～8周齡BALB/c小鼠，分離脾臟淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)多次ELISA鑒定和血凝抑制試驗(yàn)（HI）篩選和亞克隆培養(yǎng)，獲得了4株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞并制備了單抗。經(jīng)鑒定，4株單抗均有ELISA效價(jià)，其中1株單抗有中和活性和HI活性，只與ClassⅠNDV反應(yīng)，與ClassⅡNDV不反應(yīng)。該單抗與不同群NDV反應(yīng)的差異性為NDV的鑒別診斷和不同毒株抗原差異性研究奠定了一定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞;新城疫病毒;單克隆抗體;HN蛋白

中圖分類號(hào)：S852.65+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）10-0135-04

Preparation of Monoclonal Antibody against

Class Ⅰ Newcastle Disease Virus

Yang Shaohua， Zhang Lin， Cui Ning， Huang Qinghua， Huang Yanyan， Xu Chuantian

（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural

Sciences/Shandong Key Lab of Animal Disease Control and Breeding， Jinan 250100， China）

Abstract The lentogenic NDV D58 strain purified by differential centrifugation was immunized to 6～8-week BALB/c mice. The spleen cells of the mice were hybridized with SP2/0 three days after the last immunization. After screened by indirect ELISA and HI assay， and cloned by limiting dilution， four hybridoma cells secreting antibodies stably were obtained and the monoclonal antibodies were prepared. All four McAbs had ELISA titers， and one of them had neutralization and HI activities and could react with ClassⅠNDV specifically. The differences of the reaction between McAb and different groups of NDV lays a foundation for the clinical identification of NDV and the differential study of antigens in different strains of NDV.

KeywordsChicken; Newcastle disease virus; Monoclonal antibody; HN protein

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種禽的急性、高度傳染性疾病，國際獸疫局（OIE）將其列為動(dòng)物A類疫病[1，2]。自1926年被確診以來，新城疫在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，目前我國由于疫苗的廣泛使用，新城疫的發(fā)病率逐年降低，但非典型性ND仍零星散發(fā)，ClassⅠ弱毒株在禽群中廣泛存在[3-5]。ClassⅠ毒株在雞群中存在毒力返強(qiáng)和散毒的風(fēng)險(xiǎn)，因此有必要加強(qiáng)雞群中此類毒株的監(jiān)測。

盡管NDV只有一個(gè)血清型，但不同亞型的病毒間存在較大的抗原差異。單克隆抗體具有針對單個(gè)抗原決定簇的特異性，可以識(shí)別不同的抗原位點(diǎn)，因此可以用來檢測不同毒株之間的抗原差異。本研究以純化的ClassⅠNDV弱毒株為免疫原，擬研制具有中和活性和血凝抑制活性的單抗，以期為NDV的鑒別診斷和抗原差異研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新城疫ClassⅠ弱毒株D58（KF055276）及其它NDV分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存;小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0），購自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心;雞胚成纖維細(xì)胞（DF1）由本實(shí)驗(yàn)室保存;BALB/c小鼠，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;9～10日齡SPF雞胚，購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所;DMEM培養(yǎng)基、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基購自Sigma公司。

1.2 主要試劑

新生牛血清、胰酶均由Gibico公司生產(chǎn);辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG、IgM購自Sigma公司。

1.3 病毒的純化與濃縮

新城疫病毒D58經(jīng)稀釋液1∶1 000稀釋后接種9～10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，37℃溫箱孵育，棄去24 h內(nèi)的死亡雞胚，此時(shí)收集尿囊液測病毒效價(jià)，96 h后再收集尿囊液測病毒HA效價(jià)。尿囊液經(jīng)三次凍融后在4℃條件下進(jìn)行離心，3 000 r/min離心30 min，棄沉淀，取上清，8 000 r/min離心30 min，棄沉淀，上清25 000 r/min離心1 h，棄上清，沉淀以適量PBS重懸，20%～50%（w/w）蔗糖連續(xù)密度梯度離心，25 000 r/min離心4 h。收集病毒帶于透析袋中，透析脫糖，PEG8000濃縮病毒，檢測HA效價(jià)和蛋白濃度，分裝后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單克隆抗體的制備

1.4.1 免疫BALB/c小鼠以上述提純的D58病毒為免疫原，腹腔注射免疫6～8周齡BALB/c雌性小鼠，劑量為每只50 μg。首免用弗氏完全佐劑充分乳化病毒抗原，二免至四免用弗氏不完全佐劑乳化病毒抗原，共免疫4次，免疫間隔期為兩周。三免一周后，小鼠眼眶采血，測血清抗體效價(jià)。四免兩周后，選擇效價(jià)最高的小鼠，以不加佐劑的病毒腹腔注射加強(qiáng)免疫1次，3 d后取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。

1.4.2 細(xì)胞融合取免疫BALB/c小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，融合劑為PEG4000，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞，HAT為選擇性培養(yǎng)基，分裝于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，7～10 d后以HT培養(yǎng)基全部置換HAT培養(yǎng)基。逐日觀察，待融合的雜交瘤細(xì)胞長至孔底十分之一，取細(xì)胞上清液檢測。

1.4.3 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選與建株參照文獻(xiàn)[6]的方法采用間接ELISA方法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選，陽性克隆采用有限稀釋法亞克隆3～5次，篩選出能穩(wěn)定分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞作為建株細(xì)胞。

1.4.4 制備腹水8～10 周齡BALB/c雌性小鼠腹腔注射無菌液體石蠟油，每只0.5 mL，7 d 后，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，每只50萬個(gè)。每天觀察小鼠腹部，待明顯膨大時(shí)抽取腹水，離心取上清備用。

1.5 單克隆抗體生物學(xué)特性的鑒定

1.5.1 特異性測定以H9N2禽流感病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽腺病毒、傳染性法氏囊病毒及SPF雞胚尿囊液包被96 孔酶標(biāo)板，間接ELISA 鑒定各株單抗反應(yīng)特異性。

1.5.2 ELISA效價(jià)測定以純化的病毒包被酶標(biāo)板，加入單抗腹水，倍比稀釋，間接ELISA方法檢測。

1.5.3 單抗的血凝抑制特性血凝抑制試驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行。首先以D58為HI抗原， 鑒定單抗的HI特性。對于有HI特性的單抗， 再分別以不同NDV毒株為HI抗原， 進(jìn)行檢測。

1.5.4 單抗中和活性測定采用細(xì)胞中和試驗(yàn)鑒定單抗中和活性，單抗無菌處理后用PBS緩沖液（pH=7.4）1∶10 稀釋，再與等體積的200 TCID50病毒液混合，37℃作用1 h，接種80%～90%滿的DF1細(xì)胞，37℃培養(yǎng)72 h后取細(xì)胞培養(yǎng)液測定HA效價(jià)，以HA≥2log2判為感染。

1.5.5 單抗亞型鑒定參照試劑盒說明書用單克隆抗體分型試劑盒對試驗(yàn)得到的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞型鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的增殖和純化

D58接種雞胚后收集24～20 h雞胚尿囊液，HA效價(jià)為9log2～10log2，病毒經(jīng)純化后HA效價(jià)為14log2～17log2。

2.2 雜交瘤細(xì)胞系的建立

以純化的D58病毒作為免疫原，經(jīng)融合和間接ELISA 篩選，共篩選出4株能穩(wěn)定分泌特異性抗NDV單抗的雜交瘤細(xì)胞，并分別命名為雜交瘤細(xì)胞3F3、2F10、3G8、3C9。

2.3 單抗特性鑒定

2.3.1 特異性4株單抗與SPF雞胚尿囊液、禽流感病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽腺病毒、傳染性法氏囊病毒均不反應(yīng)，具有良好的特異性。

2.3.2 ELISA效價(jià)單抗2F10的ELISA效價(jià)為8.00×104，3F3、3G8、3G9的則分別為6.40×104、3.20×104、1.28×104 （表1）。

2.3.3 單抗血凝抑制性經(jīng)檢測單抗2F10 有血凝抑制性，單抗3F3、3G8、3G9無血凝抑制性（表1）。2F10與目前流行的基因2型、基因3型及基因10型ClassⅠNDV毒株的血凝抑制活性為陽性，與基因Ⅰ型、基因Ⅱ型、基因Ⅵ型、基因Ⅶ型及基因Ⅸ型ClassⅡNDV毒株的血凝抑制活性為陰性（表2）。

2.3.4 單抗中和性單抗2F10具有中和性（表1），與37株NDV毒株的中和試驗(yàn)中，2F10與D58等ClassⅠ毒株的中和反應(yīng)為陽性，與ClassⅡNDV毒株的中和反應(yīng)為陰性（表2），這與血凝抑制活性結(jié)果相同。

2.3.5 單抗亞型鑒定結(jié)果通過亞型鑒定發(fā)現(xiàn)，2F10與其它三株單抗均屬于IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈。

3 討論與結(jié)論

單克隆抗體常用于NDV抗原差異性的研究。曹殿軍等[7]篩選的4株單克隆抗體與黑龍江地區(qū)分離的NDV強(qiáng)毒株有特異性反應(yīng)，而且能區(qū)分Lasota和V4弱毒株。孫英杰等[8]制備了ClassⅠ強(qiáng)毒株9a5b的單克隆抗體，其中2株具有IFA和HI效價(jià)，且呈現(xiàn)ClassⅠ毒株特異性。Meulemans等[9]將兩種單抗混合進(jìn)行HI試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們能夠抑制所有NDV被檢毒株。Alexander等[10]應(yīng)用一株單抗在HI試驗(yàn)中能夠抑制多數(shù)NDV分離株，但不能抑制鴿NDV。目前ClassⅠNDV在禽群中的廣泛存在給NDV強(qiáng)弱毒的鑒別診斷帶來一定的困擾。本研究獲得了4株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞并制備了單抗，其中2F10具有中和活性和血凝抑制活性，表明該單抗具有針對NDV HN 蛋白的抗原表位。該單抗只與ClassⅠNDV反應(yīng)，與ClassⅡNDV不反應(yīng)，與其它單克隆抗體配合使用可用于NDV強(qiáng)弱毒的鑒別診斷和不同毒株的抗原差異性研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]De Leeuw O， Peeters B. Complete nucleotide sequence of New-castle disease virus： evidence for the existence of a new genus within the subfamily Paramyxovirinae[J]. Journal of General Virology， 1999， 80（1）： 131-136.

[2]Mayo M. A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J]. Archives of Virology， 2002 ，147（8）：1655-1663.

[3]Meng C， Qiu X， Jin S， et al. Whole genome sequencing and biological characterization of Duck/JS/10， a new lentogenic class Ⅰ Newcastle disease virus[J]. Archives of Virology， 2012， 157（5）：869-880.

[4]Wang J， Lü Y， Zhang Y，et al. Genomic characterizations of a Newcastle disease virus isolated from ducks in live bird markets in China[J]. PLoS ONE， 2016， 11（7）：e0158771.

[5]吳艷濤， 倪雪霞， 萬洪全， 等.我國部分地區(qū)不同動(dòng)物來源新城疫病毒的分子流行病學(xué)研究[ J]. 病毒學(xué)報(bào)， 2002 ， 18（3）：264-269.

[6]Zola H. 單克隆抗體技術(shù)手冊[ M]. 周宗安， 譯. 南京：南京大學(xué)出版社， 1991.

[7]曹殿軍， 盧景良， 王莉林， 等. 應(yīng)用單克隆抗體鑒別新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株的研究[J]. 中國畜禽傳染病， 1996（5）：36-38.

[8]孫英杰， 陳鴻軍， 宋翠萍， 等. 新城疫病毒ClassⅠ強(qiáng)毒株HN單克隆抗體的研制及免疫學(xué)反應(yīng)[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2010， 26（5）：464-466.

[9]Meulemans G C， Letellier C， Gonze M， et al. NDVF glycolprotein expressed from a recombinant vaccine virus vector protects chickens against live-virus-challenge[J]. Avian Dis.， 1988， 17（4）： 821-827.

[10]Alexander D J， Manvell R J， Kemp P A， et al.Use of monoclonal antibodies in the characterization of avian paramyxovirus type 1 （Newcastle disease virus） isolates submitted to an international reference laboratory[J]. Avian Pathology， 1987， 16（4）： 553-565.

收稿日期：2019-06-13

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-42-Z12）

作者簡介：楊少華（1978—），女，山東煙臺(tái)人，碩士，助理研究員，主要從事禽病綜合防控技術(shù)研究。E-mail： ysh7865@163.com

通訊作者：許傳田（1973—），男，博士，研究員，主要從事禽禽病綜合防控技術(shù)研究。E-mail： xcttaian2002@163.com