風信標扇貝的性腺發(fā)育與繁殖周期規(guī)律研究*

朱星海， 孫紅振， 楊祖晶， 孫貴東，邢 強**， 劉 劍， 包振民,3

(1.中國海洋大學海洋生命學院，海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003； 2.煙臺海益苗業(yè)有限公司，山東 煙臺 265600；3.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋生物學與生物技術功能實驗室，山東 青島 266071)

貝類產業(yè)是中國海水養(yǎng)殖產業(yè)的重要組成部分,養(yǎng)殖產量超過海水養(yǎng)殖總產量的72%[1]。據(jù)2015年《中國水產》統(tǒng)計，中國共引進貝類10余種[2]，如海灣扇貝(Argopectenirradias)[3]、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[4]、紫扇貝(A.purpuratus)[5]和大扇貝(Pectenmaximus)[6]等。自從1980年代引進國外優(yōu)質扇貝種質以來，中國扇貝養(yǎng)殖產量/產值實現(xiàn)跳躍式增長，扇貝養(yǎng)殖總產量從1984年的0.38萬t增加到2016年的178.53萬t；扇貝養(yǎng)殖總產值從1984年的0.06億美元增長至2016的25.00億美元[7]；中國海水養(yǎng)殖業(yè)構建了新的養(yǎng)殖模式，海灣扇貝與海帶輪養(yǎng)能降低產業(yè)成本，提高利潤率[8]。可見，優(yōu)質扇貝種質的引進在促進中國水產養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展的同時，創(chuàng)造了巨大的產業(yè)價值和經濟價值。

風信標扇貝(Patinopectencaurinus)隸屬于軟體動物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Lamellibranchia)，異柱目(Anisomyaria)，扇貝科(Pectinidae)，盤扇貝屬(Patinopecten)，原產于美國北部舊金山(37°N)至阿拉斯加灣(60°N)，自然棲息于深度10～300 m內的白令海和阿米莉亞群島(53°N,174°W)等海域[9-10]。作為商業(yè)養(yǎng)殖貝類個體最大的種類之一，風信標扇貝最大個體殼高可達250 mm[11]，同時因其肉質鮮美、營養(yǎng)價值高，備受北美消費者青睞。自1967年以來，風信標扇貝在阿拉斯加海灣逐漸形成商業(yè)化捕撈，至2012年產出貝肉凈重約為190 t，為當?shù)貏?chuàng)造出約450萬美元經濟價值[11]。重要的是，風信標扇貝與蝦夷扇貝的生物學地位相近，同屬于盤扇貝屬(Patinopecten)，并且生活習性相似，均屬于冷水性貝類，適宜生長水溫為5～20 ℃，分布于底質堅硬、淤沙少的海底等[11]，這使中國引進風信標扇貝并形成大規(guī)模商業(yè)化養(yǎng)殖成為可能。2013—2015年，中國海洋大學與海益水產苗業(yè)有限公司等單位合作，從加拿大(54.32 °N,131.40 °W)引種了風信標扇貝。新的扇貝物種引進將有助于其基因組學研究、重要經濟性狀遺傳基礎和調控機理的解析以及遺傳育種等相關工作的開展。

標準化的人工育苗是實現(xiàn)扇貝大規(guī)模商業(yè)化養(yǎng)殖的前提條件，而親貝培育又是貝類人工育苗的重要技術環(huán)節(jié)，直接影響著雌貝的產卵量、卵子的受精率、受精卵的孵化率以及幼蟲的變態(tài)率[12]等。目前，關于香港巨牡蠣(Crassostreahongkongensis)[13]、斧文蛤(MeretrixlamarkiiDeshayes)[14]、海灣扇貝(A.irradias)[15]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[16]、蝦夷扇貝(P.yessoensis)[17]等性腺發(fā)育與繁殖周期規(guī)律的研究國內外已有報道，但風信標扇貝在中國的的相關研究仍為空白。為此，本課題組于2015年從加拿大引進了風信標扇貝并對其性腺發(fā)育和繁殖周期規(guī)律進行研究，為貝類遺傳育種研究和人工育苗工作提供重要的理論參考和科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

用于組織切片觀察和性腺指數(shù)測定的風信標扇貝樣本，為2016年1月—2016年12月采自蓬萊海頭村浮筏養(yǎng)殖區(qū)(37.72°N,121.02°E)3～5 m水深的3齡貝(2013—2015年由中國海洋大學與海益水產苗業(yè)有限公司等單位合作從加拿大引進)，除1、2月份外(分別為4、2次)每月采樣3次(上旬、中旬、下旬),每次采集樣本雌雄各6只并進行編號記錄。

1.2 方法

1.2.1 水溫測量 在2016年周年采樣期間，除1、2月份外(分別為4、2次)每月使用海水水溫表(WQG-17)3次定期測量蓬萊浮筏養(yǎng)殖海區(qū)風信標扇貝養(yǎng)殖水層3～5 m的水溫。

1.2.2 樣本測量 使用游標卡尺(0～150 mm、0.02 mm、Ⅱ型)分別測量樣本殼長、殼高、殼寬(精確到0.01 mm)。用電子天平(PS200A)稱取樣本鮮重、軟體部重和性腺重(精確到0.01 g)，觀察其性腺發(fā)育程度、性別、顏色，并計算性腺指數(shù)：

1.2.3 組織切片的制作與觀察 首先，根據(jù)肉眼觀察性腺顏色(雌性為橘黃色、雄性為乳白色)區(qū)分扇貝性別并做好標記；其次，將風信標扇貝性腺組織切成每塊大小5 mm×5 mm，波恩氏(Bouins)液固定24 h，75%乙醇脫水，以石蠟為介質將其進行包埋成塊，德國SLEE石蠟切片機(CUT6062)切片，切片厚度為4～7 μm，蘇木素伊紅HE染色，樹膠封片保存，二甲苯透洗切片，尼康生物熒光顯微鏡(Nikon ECLIPS E600)下對染色的性腺組織切片進行觀察并通過高分辨率顯微鏡相機(Nikon DS-Ri1)拍照。

1.2.4 分析方法 對試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行處理，利用SPSS 23.0軟件(IBM Corp, Armonk, USA)Pearson相關分析法(雙側T檢驗)對風信標扇貝性腺指數(shù)與海水溫度兩個變量的相關性進行分析。

2 結果

2.1 風信標扇貝性腺指數(shù)與海區(qū)水溫的關系

由2016年1月1日—2016年12月31日為期一周年的浮筏養(yǎng)殖風信標扇貝性腺指數(shù)變化的連續(xù)觀測可見(見圖1)，2月上旬至8月中旬海水溫度呈上升趨勢，而8月下旬至12月下旬海水溫度則平穩(wěn)回落。1—4月上旬風信標扇貝的性腺指數(shù)呈現(xiàn)穩(wěn)定連續(xù)增長趨勢，4月中旬到12月中旬則呈現(xiàn)逐漸下降趨勢：1月初性腺指數(shù)逐漸上升，至4月上旬達到最大值(24.25)，與之對應的海水溫度變化趨勢則顯現(xiàn)為“V”型，由1月初的4.2 ℃下降至2月上旬的1.3 ℃(為全年最低水溫)；2月中旬至4月上旬海水溫度從2.2 ℃逐漸上升至9.0 ℃；4月中旬到12月中旬性腺指數(shù)呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢，并在10月中旬出現(xiàn)全年最小值(3.80)，與之對應的海水溫度變化趨勢則呈現(xiàn)倒“V”型，期間水溫從4月中旬的11.8 ℃升至8月中旬的26.8 ℃，之后逐漸回落。周年統(tǒng)計期間，蓬萊海頭村海水溫度的波動與風信標扇貝性腺指數(shù)的變化呈現(xiàn)顯著負相關(r=-0.483，P< 0.05)，說明海水溫度變化顯著影響風信標扇貝的性腺發(fā)育和繁殖周期。

圖1 風信標扇貝性腺指數(shù)與海區(qū)水溫的變化Fig.1 Monthly change curves of the gonad-somatic index in Weathervane scallop and water temperature

2.2 風信標扇貝性腺發(fā)育分期

基于生殖細胞自身發(fā)育規(guī)律以及不同發(fā)育階段生殖細胞在濾泡中所占的比例，對2016年1月—2016年12月收集到的樣品性腺組織切片進行觀察,將風信標扇貝的性腺發(fā)育劃分為4個時期,分別為增殖期、生長期、成熟期、休止期。

增殖期(12—次年1月)：該時期的濾泡腔多為空腔，并有原始生殖細胞在生殖腺的濾泡壁上堆積(見圖2B、F)。

生長期(2—3月)：雄貝濾泡腔內出現(xiàn)不同發(fā)育階段的生殖細胞(見圖2G)，雌貝濾泡中存在游離的卵母細胞，濾泡壁內充滿成熟的長柄狀或不規(guī)則橢圓型卵母細胞，此時期的卵母細胞較上一時期體積更大(見圖2C)。

成熟期(4—6月)：雌雄性腺顏色差異較大,雌性為橘黃色,而雄性為乳白色。濾泡此時期最為發(fā)達，濾泡之間的空隙已基本消失，整個濾泡腔內充滿生殖細胞。雌性濾泡內成熟卵占65%～5%，成熟卵細胞和處于生長后期的卵母細胞游離在濾泡腔中，卵母細胞在泡腔內相互擠壓，形狀各異(見圖2D)。雄性濾泡內充滿密集排列的精細胞，呈現(xiàn)輻射狀(見圖2H)。

圖2 風信標扇貝性腺不同發(fā)育時期的組織切片觀察
Fig.2 Histological observation of different gonadal development stages in Weathervane scallop

休止期(7—11月)：處于該時期的性腺發(fā)育程度最低，濾泡腔為空腔且性腺體積很小，但濾泡壁內可見及少量精細胞或卵細胞(見圖2A、E)；

2.3 風信標扇貝繁殖規(guī)律

根據(jù)人工繁育試驗和性腺組織切片的周年觀察結果，筆者發(fā)現(xiàn)風信標扇貝的繁殖周期為一年。性腺發(fā)育程度與浮筏養(yǎng)殖海區(qū)水溫變化密切相關，并且處于不同發(fā)育時期的性腺，在其形體特征上存在差異。

12月—次年1月,蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)海水溫度逐漸降低，從7.9 ℃平穩(wěn)下降至2.4 ℃，此時期風信標扇貝性腺體積逐漸增大，腺體內有少量內含物，性腺指數(shù)從5.24快速上升至10.32，性腺發(fā)育處于增殖期。

2—3月,蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)海水溫度從全年最低的1.3 ℃緩慢上升至6.8 ℃，此時期風信標扇貝性腺體積接近其最大值，腺體內內含物逐漸增多，濾泡內生殖細胞逐漸增多。肉眼可區(qū)分性別，雄貝性腺為乳白色，雌貝性腺則呈現(xiàn)杏黃色。性腺指數(shù)從2月上旬的14.31陡然上升至3月底的22.63，性腺發(fā)育處于生長期。

4—6月,蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)海水溫度從9.0 ℃逐漸上升至21.3 ℃，此時期風信標扇貝性腺中的濾泡腔充滿了生殖細胞，濾泡間幾乎沒有空隙。因此性腺狀態(tài)飽滿圓潤，而且體積相比其它器官大。4月性腺發(fā)育進入成熟期，平均性腺指數(shù)22.70為全年最高，風信標扇貝進入繁殖盛期。

7—11月,蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)海水溫度穩(wěn)定在20.0 ℃左右，此時期風信標扇貝性腺體積相比其它器官相對較小，且呈現(xiàn)萎縮、透明、退化狀態(tài)。這5個月平均性腺指數(shù)約為5.10，性腺發(fā)育處于休止期。

總體而言，水溫較低時，低溫使冷水貝類的性腺快速發(fā)育，此時性腺指數(shù)相對較高；反之，水溫較高時，性腺發(fā)育受到溫度協(xié)迫，性腺指數(shù)較低。

此外，課題組進行的風信標扇貝的人工繁育工作也取得了階段性進展。2016年2月，選擇體型健壯的、性腺發(fā)育處于生長期的風信標扇貝入池，進行人工促熟。在性腺發(fā)育的繁殖期，挑選性腺發(fā)育較好的雌貝和雄貝(性腺體積大，形態(tài)圓潤飽滿)陰干刺激45～60 min。之后，雌貝和雄貝先后(時間間隔30 min)放入5～12 ℃的新鮮海水中(變溫刺激，持續(xù)45～60 min)，直至風信標扇貝產卵/精。在該溫度下進行人工授精、孵化，選優(yōu)后幼蟲培育水溫逐漸升高至13 ℃，恒溫培育直到稚貝出庫。

3 討論

3.1 年度水溫和性腺指數(shù)變化趨勢

在雙殼貝類的生長過程中，溫度是諸多水生環(huán)境因子中最重要的發(fā)育調控因素[18-19]。在適溫范圍內，貝類的新陳代謝旺盛，這對其攝食、生長、性腺發(fā)育、繁殖等生理活動產生積極的作用[20]。風信標扇貝屬于冷水性貝類，在水溫較低的冬季，性腺發(fā)育迅速[10]。蓬萊浮筏養(yǎng)殖海區(qū)1—3月海水溫度均低于7.0 ℃，月均性腺指數(shù)上升2.44；4月風信標扇貝在水溫達到9.0℃時性腺發(fā)育開始進入成熟期，并在4月上旬出現(xiàn)全年性腺指數(shù)峰值(24.25)；4月下旬—6月上旬為該扇貝繁殖盛期，期間平均水溫為14.1 ℃；這與大連塔河灣海區(qū)和黃海北部蝦夷扇貝相關研究結論有所差異：黃海北部海區(qū)全年最低海水溫度出現(xiàn)在2月份(該月平均水溫為1.3 ℃)，此時期的性腺發(fā)育速度快；繁殖期為3月中旬—5月中旬，其中3月份的平均性腺指數(shù)25.89為全年最高，繁殖期水溫為8.6 ℃左右[21]；大連塔河灣海區(qū)蝦夷扇貝的繁殖期為4—5月，其性腺指數(shù)峰值(17.27)出現(xiàn)在3月上旬，繁殖期水溫為5.0～6.8 ℃[16]?？梢姡退疁赜兄陲L信標扇貝和蝦夷扇貝的性腺發(fā)育。雖然蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)風信標扇貝的繁殖期與中國不同養(yǎng)殖海區(qū)蝦夷扇貝的繁殖時期接近，但繁殖期的水溫存在一定差異，這可能是養(yǎng)殖區(qū)地理位置以及水文條件的差異造成的。海水溫度和性腺指數(shù)在3個不同海區(qū)的變化趨勢，均呈現(xiàn)相對明顯的負相關。

3.2 風信標扇貝的性腺發(fā)育分期

鑒定動物性腺發(fā)育的分期，有助于筆者掌握其性腺發(fā)育規(guī)律和生殖周期的特征。正確劃分扇貝性腺發(fā)育時期是進行人工繁殖的理論基礎與實踐指導。但是目前，關于雙殼類貝類性腺發(fā)育的分期標準尚未形成統(tǒng)一認識，多為觀察光學顯微鏡下拍攝的性腺組織切片結果而進行分期。如吳洪流等[22]將波紋巴非蛤(Paphiaundulata)性腺發(fā)育分為6個時期，分別為休止期、增殖期、生長期、成熟期、排放期和滯留退化期；於鋒[12]將廣西茅尾海香港巨牡蠣(C.hongkongensis)性腺發(fā)育分期為5個時期，未分化期、分化期、成熟排放期和休止期；高悅勉[16]等將大連塔河灣海區(qū)蝦夷扇貝(P.yessoensis)性腺發(fā)育劃分為休止期、增殖期、生長期、成熟期、排放期。本實驗結合性腺組織切片分析和肉眼觀察的結果將蓬萊海頭村浮筏養(yǎng)殖區(qū)風信標扇貝的性腺發(fā)育分為4個時期，分別為增殖期(12月—次年1月)、生長期(2—3月)、成熟期(4—6月)、休止期(7—11月)。Hennick[23]通過肉眼觀察原產于阿拉斯加灣的風信標扇貝性腺發(fā)育特征，將其分為5個階段，第一階段為性腺排空期，體積縮小，消化管可見，干癟透明狀，雌雄貝性腺幾乎為無色；第二階段為性腺恢復初期，性腺體積增大，充滿1/4～1/2內含物，消化管隱約可見，雄貝性腺中含生殖細胞的部分為乳白色，余下腺體為透明狀，雌貝性腺呈淡粉色或淺橙色；第三階段為性腺生長期，性腺體積接近最大，充滿3/4內含物，雌貝性腺為淺橙黃色，雄貝性腺為蒼白色；第四階段為性腺成熟期，性腺體積較其它器官大，形態(tài)圓潤，雄貝性腺為乳白色，雌貝性腺為橘黃色；第五階段為性腺發(fā)育早期或未成熟期，性腺體積較其它器官小，平滑透明無色。通過觀察，筆者發(fā)現(xiàn)阿拉斯加灣風信標扇貝與蓬萊浮筏養(yǎng)殖海區(qū)風信標扇貝性腺發(fā)育特征相似。例如，雄貝性腺成熟時顏色均為乳白色，雌貝性腺成熟時顏色均為橘黃色、性腺體積大、形態(tài)圓潤等，而且兩種扇貝在生產后，雌雄貝的性腺均逐漸變?yōu)榘T平透明狀[23]。此后，扇貝性腺進入恢復初期，隨著營養(yǎng)物質的吸收，性腺內含物的積累，其體積逐漸增大。但是由于不同地理環(huán)境(水溫等)、取材個體差異，目前引進到中國的風信標扇貝在性腺發(fā)育過程出現(xiàn)了不同于原產地個體的新特征，不同地區(qū)扇貝在生長階段的性腺內含物比例有所不同，阿拉斯加灣風信標扇貝的性腺充滿3/4內含物，而引進中國的風信標扇貝的性腺充滿約1/2內含物等；蓬萊浮筏養(yǎng)殖海區(qū)風信標扇貝的繁殖盛期在為4月下旬—6月上旬(春末夏初)，而阿拉斯加灣風信標扇貝的繁殖期主要集中在夏季初，為6月上旬—7月中旬[23]。

綜上所述，該實驗課題組在引進風信標扇貝的基礎上，探究其性腺發(fā)育與繁殖周期變化規(guī)律。性腺發(fā)育分為4個時期，根據(jù)本文所歸納性腺發(fā)育的特征可以對風信標扇貝的繁殖時間段進行預測。通過獲得海水溫度的實時變化，研究者在一定程度上可以預估該扇貝群體性腺指數(shù)的變化趨勢。研究結果不僅填補了其性腺發(fā)育研究方向上的空缺，同時為風信標扇貝的人工繁育和商業(yè)養(yǎng)殖開發(fā)提供了重要的理論指導。

致謝：本文中風信標扇貝個體的取樣和海水溫度測量工作均在煙臺海益苗業(yè)有限公司的大力協(xié)助下完成，在此表示感謝。