4-硝基苯甲酰氯柱前衍生-超高效液相色譜/質(zhì)譜法測定煙葉中氨基酸

黃曼艷　陳森林　林云　陶紅　阿文偉　胡玉玲　葉為民　李攻科

摘 要 建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生、超高效液相色譜/質(zhì)譜法測定煙葉中氨基酸的方法。樣品經(jīng)超聲輔助提取后，提取液與4-硝基苯甲酰氯可快速發(fā)生衍生化反應。優(yōu)化后的衍生化條件為： NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液（pH=9.0）， 室溫下振蕩衍生1 min。此反應具有反應條件溫和、衍生時間短等優(yōu)點。通過優(yōu)化多通道反應監(jiān)測參數(shù)，進一步提高了方法的靈敏度。方法的線性相關(guān)系數(shù)R2在0.9951～0.9998之間，檢出限為0.01～2.10 μg/L，加標回收率為81.7%～103.6%，相對標準偏差為0.5%～8.0%，具有良好的穩(wěn)定性和精密度。采用本方法測定3種不同產(chǎn)地煙葉樣品中氨基酸含量，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法進行分析，分類效果良好。

關(guān)鍵詞 4-硝基苯甲酰氯; 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用; 衍生; 氨基酸; 煙葉

1 引 言

氨基酸是煙葉中的初級和次級代謝產(chǎn)物，在陳化過程中，與還原糖發(fā)生酶及非酶催化反應或自身降解生成致香成分，是煙葉中重要的香氣前體物質(zhì)。煙葉中氨基酸的組成和含量與煙葉的品質(zhì)有關(guān)，每種氨基酸對香味的貢獻值不同?？偘被岷颗c評吸總得分呈現(xiàn)二次曲線的相關(guān)關(guān)系，與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)。因此，常作為檢測煙葉品質(zhì)的重要指標，在煙葉中品質(zhì)研究中具有重要作用[1，2]。

煙葉中氨基酸測定方法主要有氣相色譜法[3，4]、離子色譜法[5，6]、液相色譜法[7]和氨基酸流動分析法[8]等。由于氨基酸不易揮發(fā)，當采用氣相色譜檢測時，常與N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N，O-bis（trimethylsilyl） trifluoroacetamide， BSTFA）等衍生化試劑反應生成易揮發(fā)物質(zhì)后進行測定。由于BSTFA遇水易失效，對反應條件要求較苛刻，穩(wěn)定性較差[9]。采用離子色譜測定時，基質(zhì)離子干擾較大，會影響定量分析的準確性。而氨基酸不具有紫外和熒光吸收，雖可采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定，但氨基酸極性大，不易保留，離子化效率較低[10，11]。因此，柱前衍生仍是目前氨基酸檢測的重要手段。食品和煙葉中氨基酸的檢測主要采用茚三酮作為柱前衍生試劑結(jié)合氨基酸流動分析儀進行測定，而柱前衍生結(jié)合液相色譜進行檢測較為簡便、靈敏和快速。常用的柱前衍生試劑主要有熒光胺（Fluorescamine， FA）、丹磺酰氯（Dansyl chloride， dansyl-Cl）[12，13]，在衍生的過程中，會產(chǎn)生副產(chǎn)物，影響衍生產(chǎn)物的測定。氯甲酸-9-芴基甲酯（Fluorene methyl chloroformate， FMOC-Cl）[14]水解產(chǎn)物有熒光干擾，過量的衍生化試劑需用戊烷除去，操作繁瑣，定量結(jié)果偏差較大; 2，4-二硝基氟苯（2，4-Dinitrofluorobenzene， DNFB）[15]衍生過程中需要避光處理，容易產(chǎn)生副產(chǎn)物; 6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯（AQC）[16]是氨基酸衍生化試劑，加熱衍生5 min即可完成，但試劑較昂貴，且多余的衍生化試劑水解后也會產(chǎn)生較強的紫外吸收，其保留時間與丙氨酸接近，對丙氨酸的測定產(chǎn)生干擾。為提高衍生反應速率，減少實驗操作步驟，實現(xiàn)批量煙葉樣品的快速測定，發(fā)展氨基酸衍生化新方法具有重要意義。 4-硝基苯甲酰氯作為醇類、胺類物質(zhì)等[17～19]的衍生化試劑，其酰氯基團可與氨基酸中的氨基迅速發(fā)生?；磻?，而硝基又可降低衍生試劑的水解速度，因此具有反應條件溫和、衍生時間短、簡便快速等特點。

本研究采用4-硝基苯甲酰氯作為衍生化試劑，與LC-MS/MS聯(lián)用測定煙葉中的氨基酸，并探究了不同產(chǎn)地煙葉中氨基酸含量的差異。結(jié)果表明，4-硝基苯甲酰氯可作為一種新型氨基酸衍生化試劑，應用于煙葉中氨基酸的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC-MS 8050超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（日本島津公司）; H1850高速離心機（湖南湘儀離心機有限責任公司）; AB204-S電子天平、Mettler-Toledo FE20 臺式酸度計 （瑞士梅特勒-托利公司）; KQ5200數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）; 0.22 μm聚四氟乙烯過濾器（上海安譜科學儀器有限公司）; 色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ（200 mm × 2.0 mm，2.2 μm， 日本島津公司）。

20種氨基酸分析標準品（純度>98%，上海源葉生物科技公司）， 均為L構(gòu)型; 乙腈（色譜純，DIMA公司）; 甲酸（色譜純， Sigma公司）; 4-硝基苯甲酰氯、3，5-二硝基苯甲酰氯、3-硝基苯甲酰氯（色譜純，北京百靈威科技有限公司）; 其它試劑均為分析純。實驗用水均為超純水（18.25 MΩ·cm，美國Millipore公司）。煙葉樣品由廣東中煙公司提供。

2.2 標準溶液和樣品的制備

分別稱取10.0 mg氨基酸標準品，用水溶解并定容至10.0 mL，稀釋配成10.0 mg/L混合母液，于4℃避光保存，待用。采用 0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液（pH 9.0）稀釋，配制二級標準儲備液，采用逐級稀釋法配成一系列濃度的混合標準溶液。4-硝基苯甲酰氯采用無水乙腈配成10.0 mg/L的衍生試劑溶液。

按照YC/T31-1996《煙草及煙草制品試樣的制備和水分測定烘箱法》[20]處理煙葉樣品。 準確稱取100.0 mg樣品，加水萃取10 min后，離心分離后所得的上清液用0.22 μm的水相濾膜過濾，得到萃取液。取100 μL萃取液，采用0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液（pH 9.0）稀釋至10.0 mL，待用。

2.3 衍生化反應

室溫下，取900 μL 10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液，加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化試劑，振蕩1 min后進樣分析，完成萃取衍生，經(jīng)0.22 μm 聚四氟乙烯 （PTFE） 濾膜過濾后進行測定。其反應方程式如下式。

NO2+H2NCHRCOOHpH=9NO2ONHCHRCOOH

2.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ（200 mm×2.0 mm， 2.2 μm）; 流動相A為0.1%甲酸，B為乙腈; 梯度洗脫： 0～15 min， 5%～70% B; 15～20 min， 70%～5% B，流速為0.3 mL/min，柱溫35℃，進樣量20 μL。

電噴霧離子源（ESI）; 毛細管電壓3.0 kV; 離子源溫度300℃; 脫溶劑氣溫度400℃; 脫溶劑氣流量650 L/h; 錐孔氣流量50 L/h; 負離子掃描模式，選擇多反應監(jiān)測（MRM）模式分析。

2.5 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS-24軟件進行主成分分析和判別分析。煙葉香型由廣東中煙提供，其中1～11號產(chǎn)自貴州，12～23號產(chǎn)自湖南，24～37號產(chǎn)自云南。

3 結(jié)果與討論

3.1 衍生反應機理

4-硝基苯甲酰氯具有酰氯基團，可用于胺類物質(zhì)的衍生，具有較高的靈敏度[21]。由于酰氯基團較易水解，引入硝基可抑制其水解的速度，當氨基酸與酰氯基團完全反應后，多余的衍生化試劑發(fā)生水解，不影響衍生產(chǎn)物的測定。其部分產(chǎn)物離子掃描圖見圖1，分別代表4種氨基酸，在負離子模式下均出現(xiàn)母離子峰，說明此衍生反應符合取代反應的過程。由圖1A、1B、1C可知，當采用4-硝基苯甲酰氯為衍生化試劑時，均產(chǎn)生m/z 122.0和150.0的碎片離子，增大了離子的響應。此外，由圖2D可知，脯氨酸作為二級氨基酸，也產(chǎn)生m/z 122.0的碎片離子，說明此衍生化方法具有良好的適用性，可用于煙葉中一、二級氨基酸的測定。

3.2 MRM方法的建立

分別取900 μL 10.0 μg/L氨基酸單標準溶液，加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化試劑反應后分別進行母離子和產(chǎn)物離子掃描，得出每個氨基酸衍生特征產(chǎn)物離子碎片。通過優(yōu)化定量離子對、最優(yōu)化碎裂電壓和電離能等，最終得到20種氨基酸多反應監(jiān)測（MRM）參數(shù)見表1。

3.3 衍生條件的探究

3.3.1 衍生試劑的選擇 為了探究硝基苯甲酰氯的衍生效果，在相同的衍生條件下分別考察3-硝基苯甲酰氯、4-硝基苯甲酰氯、3，5-二硝基苯甲酰氯3種不同衍生化試劑的衍生效果，結(jié)果如圖2A所示。對比主要氨基酸衍生產(chǎn)物峰面積可知，4-硝基苯甲酰氯衍生產(chǎn)物峰面積更大，其衍生的效果更好，可能是因為當硝基處于對位時，能減少位阻的影響，更有利于發(fā)生親核取代反應。

3.3.2 緩沖溶液pH值的選擇 考察了衍生化過程中緩沖溶液pH值對衍生化過程的影響。4-硝基苯甲酰氯在堿性條件下可與氨基酸發(fā)生反應，故在堿性條件下研究pH值的影響。取10.0 mg/L氨基酸混合溶液，分別采用pH為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0濃度為0.1 mol/L的NH4HCO3-HN3·H2O緩沖溶液稀釋成10.0 μg/L溶液。采用相同的方法衍生和測定，對比峰面積的差異。由圖2B可見，當pH=9.0時，除了脯氨酸的峰面積下降外，其它氨基酸的衍生效果最好，最終確定最佳pH=9.0。

3.3.3 振蕩輔助衍生 以10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液為分析對象，考察振蕩衍生時間分別為1、5、10、15和20 min時衍生反應結(jié)果。從圖3A可見，隨著時間增長，衍生產(chǎn)物峰面積差異不大，最終選擇振蕩衍生時間為1 min。從圖3B可見，采用振蕩輔助衍生的效果略優(yōu)于室溫下不經(jīng)輔助衍生的方式，脯氨酸在振蕩條件下的衍生效果較好。最終選擇室溫下振蕩輔助衍生作為后續(xù)的衍生方式。

3.3.4 穩(wěn)定性 以10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液為分析對象，在最佳的衍生條件下反應，探究批間和日間8 h內(nèi)衍生反應產(chǎn)物的穩(wěn)定性。通過峰面積的對比，批間相對標準偏差介于1.1%～6.0%，日間衍生產(chǎn)物峰面積變化不大，其相對標準偏差為2.3%～10.5%。結(jié)果表明，此衍生反應產(chǎn)物能夠穩(wěn)定存在，可以保證后續(xù)實驗中氨基酸的定量分析。

3.4 分析方法性能和實際樣品的測定

利用逐級稀釋法配制氨基酸混合標準溶液，與LC-MS/MS聯(lián)用進行測定，各氨基酸的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及回收率見表2，其中，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的線性范圍為0.5～500 μg/L， 脯氨酸為0.1～1000 μg/L，其余氨基酸為0.5～100 μg/L，各氨基酸在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性，線性相關(guān)系數(shù)R2在0.9951～0.9998之間，檢出限為0.01～2.10 μg/L，加標回收率為81.7%～103.6%， 滿足前處理和分析檢測方法的要求，可用于煙葉氨基酸的測定。不同氨基酸檢測方法對比結(jié)果如表3所示，此衍生化方法衍生時間短，操作簡便快速，檢出限低，可用于氨基酸含量的檢測。圖4A和4B分別為標準溶液色譜圖和煙葉樣品色譜圖。

3.5 不同產(chǎn)地煙葉樣品的判別分類

選擇3個產(chǎn)地的37份煙葉樣品，采用本方法測定煙葉中氨基酸的含量，并結(jié)合判別分析方法對樣品進行分類和判定。樣品的KMO值為0.811，樣品顯著性較強，前3個主成分累積貢獻率為83.85%，具有初步的分類效果。其樣品的方差分析見電子版文后支持信息表S1所示。在表4中，將貴州、湖南、云南樣品分別設定為1、2、3組，采用判別分析對樣品進行分析。在自身驗證中，樣品均未產(chǎn)生誤判，三者的總平均準確率為100%。在交互驗證中，其中有1份貴州樣品誤判為云南煙葉，湖南煙葉有2份誤判為云南煙葉，云南煙葉有1份誤判為貴州煙葉，判別準確率分別為90.9%、83.3%和85.7%， 而交互驗證的平均準確率為86.5%，說明本方法模型可應用于不同產(chǎn)地煙葉樣品的預測。

4 結(jié) 論

建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生與超高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用測定煙葉中氨基酸的方法。此衍生反應條件溫和，衍生時間僅為1 min，衍生完成后可直接進行測定。采用本方法測定3個不同產(chǎn)地煙葉樣品，結(jié)合多元統(tǒng)計分析對產(chǎn)地進行分析，判別分析的準確率為86.5%，具有良好的實用性。 本方法還可用于研究氨基酸與煙葉其它品質(zhì)的關(guān)系，為煙葉質(zhì)量判定提供依據(jù)。

References

1 Tomita H， Noguchi M， Tamaki E. Agric. Biol. Chem.， 1965， 29： 959-961

2WANG Shu-Sheng， WANG Bao-Hua， LI Xue-Zhen， LI Xin-Feng. Chinese Tobacco Science，? 2002，? 23（4）： 4-7

王樹聲， 王寶華， 李雪震， 李新峰. 中國煙草科學，? 2002，? 23（4）：4-7

3 Ali H， Ptzold R， Brückner H. Food Chem.，? 2006，? 99（4）： 803-812

4 Li G， Wu D， Xie W Y， Sha Y F， Lin H Q， Liu B Z. J. Chromatogr. A，? 2013，? 1296： 243-247

5 Csomos E， Simon-Sarkadi L. Chromatographia，? 2002，? 56（1）： S185-S188

6 Takano Y， Chikaraishi Y， Ohkouchi N. Int. J. Mass Spectrom.，? 2015，? 379： 16-25

7 Nimbalkar M S， Pai S R， Pawar N V， Oulkar D， Dixit G B. Food Chem.，? 2012，? 134（4）： 2565-2569

8 Zeng Y H， Cai W S， Shao X G. J. Sep. Sci.，? 2015，? 38（12）： 2053-2058

9 Deng C H， Yin X Y， Zhang L J， Zhang X G. Rapid Commun. Mass Spectrom.，? 2005，? 19（16）： 2227-2234

10 Deng P， Zhan Y， Chen X Y， Zhong D F. Bioanalysis， 2012， 4（1）： 49-69

11 Ohno K I， Yamashita K. Bioanalysis，? 2015，? 7（19）： 2489-2499

12 Mottier N， Jeanneret F. J. Agric. Food Chem.，? 2011，? 59（1）： 92-97

13 Zheng G H， Jin W W， Fan P， Bai Y， Tao T， Yu L J. Int. J. Mass Spectrom.，? 2015，? 392： 1-6

14 Rebane R， Oldekop M L， Herodes K. J. Chromatogr. B，? 2014，? 955： 34-41

15Li N N， Liu Y， Zhao Y， Zheng X Q， Lu J L， Liang Y R. Food Anal. Method，? 2016，? 9（5）： 1307-1314

16 Nakamura H， Karakawa S， Watanabe A， Kuwahara T， Shimbo K， Sakai R. Anal. Biochem.，? 2015，? 476： 67-77

17 Blazsek M， Kubi M. J. Pharm. Biomed. Anal.，? 2005，? 39（3-4）： 564-571

18 Nojiri S， Taguchi N， Oishi M， Suzuki S. J. Chromatogr. A，? 2000，? 893（1）： 195-200

19 Kirschbaum J， Rebscher K， Brückner H. J. Chromatogr. A，? 2000，? 881（1-2）： 517-530

20 YC/T31-1996， Tobacco and Tobacco Products-Preparation of Test Sample and Determination of Water Content-Oven Method， Standards for Tobacco Industry of the People's Republic of China

煙草及煙草制品試樣的制備和水分測定烘箱法. 中華人民共和國煙草行業(yè)標準. YC/T31-1996

21 Hori Y， Fujisawa M， Shimada K， Sato M， Kikuchi M， Honda M， Hirose Y. J. Chromatogr. B，? 2002，? 767（2）： 255-262

22 Zhang J J， Zhan C X， Chang Y W， Zhao Y N， Li Q H， Xu G W. J. Sep. Sci.，? 2013，? 36（17）： 2868-2877

23 Ziegler J， Abel S. Amino Acids，? 2014，? 46（12）： 2799-2808

24 Jing Y Q， Zhang B L， Yuan X X， Gao Y Z， Lu P， Wang W F， Xu M. Saudi J. Biol. Sci.，? 2016，? 23（1）： S64-S68

Analysis of Amino Acids by Ultra High Performance Liquid

Chromatography-Electrospray Ion Tandem Mass Spectrometry

Using 4-Nitrobenzoyl Chloride as Precolumn Derivatization

HUANG Man-Yan1， CHEN Sen-Lin2， LIN Yun2， TAO Hong2， A Wen-Wei1，

HU Yu-Ling， YE Wei-Min2， LI Gong-Ke

1（School of Chemistry， SunYat-sen University， Guangzhou 510275， China）

2（China Tobacco Guangdong Industrial Co. Ltd.， Guangzhou 510385， China）

Abstract A pre-column derivatization method for determination of amino acids in tobacco leaves by ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ion tandem mass spectrometry using 4-nitrobenzoyl chloride as derivatization reagent was developed. The sample was extracted by ultrasound-assisted extraction， and then the extracts were rapidly derived with 4-nitrobenzoyl chloride. The derivative reaction was performed in NH4HCO3-NH3·H2O buffer solution at pH 9.0 and room temperature with oscillation assistance for 1 min. To enhance the sensitivity， the parameters of multiple reaction monitoring were also optimized. This method had many advantages including mild reaction condition， simple procedure and short derivatization time. The method showed a good linearity with correlation coefficients of 0.9951-0.9998. The detection limits were 0.56-2.00 μg/L with RSDs of 0.5%-8.0%. This method coupled with multivariate statistical analysis method was successfully employed for determination of amino acids in tobacco leaves from three different geographical origins， showing a good classification results.

Keywords 4-Nitrobenzoyl chloride; Ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry; Derivatization; Amino acid; Classification