膠體金免疫層析試紙法檢測農(nóng)產(chǎn)品中戊唑醇殘留

許俊麗　劉貝貝　王玉龍　李盼　楊康　吳勤　蔣嵐　張皓然　楊立飛　張存政

摘 要 利用納米金標記高親和、高特異性戊唑醇單克隆抗體，建立了戊唑醇免疫層析快速檢測方法，通過裸眼觀察可快速定性判斷是否超過最大限量值（MRL），實現(xiàn)了樣品現(xiàn)場快速篩查與精準定量分析，具有快速、精準、低成本的優(yōu)點。以20 nm的膠體金顆粒標記抗戊唑醇單克隆抗體作為檢測探針，分別將包被原Teb-OVA（0.3 mg/mL）和羊抗小鼠IgG抗體（1 mg/mL）包被于硝酸纖維膜（NC膜）， 形成檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），組裝成的膠體金免疫層析檢測試紙條裸眼觀察的檢出限為6.25 ng/mL（T線完全消線），可在15 min內(nèi)實現(xiàn)小麥、黃瓜和甘藍中戊唑醇的定性與半定量分析，分析結(jié)果與高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）方法的檢測結(jié)果一致。膠體金免疫檢測方法特異性和準確性好，操作方便，重復性好，可滿足現(xiàn)場快速篩查大量樣品的需求。

關(guān)鍵詞 戊唑醇殘留; 膠體金免疫層析; 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

戊唑醇（Tebuconazole， 1-（4-氯苯基）-3-（1H-1，2，4-三唑-1-基甲基）-4，4-二甲基戊-3-醇）是一種三唑類殺菌劑，能有效防治由白粉菌屬、柄銹菌屬、喙孢屬、核腔菌屬和殼針孢屬引起的病害，廣泛用于小麥、蔬菜、香蕉、蘋果等作物的種子處理和葉面防治[1～5]，是三唑類殺菌劑中使用量與銷售最高的品種之一[6]，防治譜廣，使用廣泛。但戊唑醇對哺乳動物具有毒性，且在肝臟和血液中有毒性蓄積作用，具有潛在的非遺傳致癌毒性作用及環(huán)境激素內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[7～9]。美國環(huán)保署（EPA）已將三唑類殺菌劑中的戊唑醇、烯效唑、己唑醇、丙環(huán)唑和氟環(huán)唑列入潛在的人類致癌物名單[10]，歐盟委員會和我國規(guī)定了部分農(nóng)作物和蔬菜中戊唑醇的最大殘留限量（0.05 mg/kg）[11，12]。因此，研發(fā)快速、精準的戊唑醇殘留分析方法，是進行有效監(jiān)管的重要環(huán)節(jié)。

戊唑醇殘留的儀器檢測方法包括氣相色譜法（氮磷檢測器，GC-NPD）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）和毛細管氣相色譜法等。Dong等[13]采用LC-MS/MS測定戊唑醇及其代謝產(chǎn)物在土壤、葡萄中的殘留動態(tài)與風險評估，方法的檢出限為0.1 mg/kg。 Zhang等[14]建立了HPLC方法對土壤沉積物中的戊唑醇等3種手性三唑類殺菌劑的同分異構(gòu)體的降解情況進行研究，手性化合物的消長分布符合一級動力學方程，且與沉積物的性質(zhì)相關(guān)聯(lián)。Wang等[15]建立了固相萃取-超高效液相/串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水中戊唑醇殘留，不同基質(zhì)檢出限為0.001～41.27 ng/L，回收率為76%～97%。劉軍等[16]采用分散固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法測定水稻及土壤中戊唑醇殘留量，檢測范圍為5～200 μg/L，檢出限為2.5 ×10-11 g。

免疫分析技術(shù)廣泛用于現(xiàn)場檢測和高通量篩選，具有簡單、便攜、快速、低成本等優(yōu)點，是儀器分析方法的補充[17]，包括酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）、免疫層析試紙條和免疫傳感器等[18～21]。其中以納米金作為信號輸出的膠體金試紙條實用性強， 操作簡單， 裸眼即可判定結(jié)果，應(yīng)用廣泛。目前，對戊唑醇的免疫分析報道不多，主要是由于不易獲得高質(zhì)量抗體，其中基于膠體金試紙條的殘留檢測方法未見報道。Danks 等[22]報道了基于多克隆抗體的ELISA方法，對戊唑醇的檢測范圍為0.02～20 mg/L; Qi等[23]利用分子印跡電化學傳感器等方法（ECA），通過信號的放大作用實現(xiàn)對戊唑醇的檢測，靈敏度達到3.85 ng/mL; Chen等[24]通過設(shè)計半抗原獲得特異性抗體，建立的免疫分析方法對水樣中的戊唑醇的檢測靈敏度為0.197～0.297 ng/mL。本研究以前期設(shè)計的新型半抗原制備的抗戊唑醇的高特異性、高親和力單克隆抗體為材料，建立了半定量膠體金免疫層析試紙條分析方法，實現(xiàn)裸眼觀察確定戊唑醇殘留，經(jīng)ELISA鑒定此抗體對戊唑醇的檢測靈敏度為0.07 ng/mL（IC20），IC50為 0.19 ng/mL[25]; 同時，建立了基于LC/MS-MS的檢測方法，以小麥、黃瓜和甘藍等樣品為對象，進行了方法的驗證，表明兩種檢測方法配合使用可以實現(xiàn)對戊唑醇的精準、快速檢測，優(yōu)勢互補。其中，免疫層析試紙快速、方便，能用于現(xiàn)場檢測，LC-MS/MS方法準確、靈敏，可用于大量樣品的高通量定量檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

XYZ3050TM試紙條噴膜儀（Bio-Dot公司）; ZQ2000微電腦試紙條自動切割儀（上海金標生物科技有限公司）; Lambda25 UV-vis Spectrometer雙光束紫外-可見分光光度計（美國Perkin Elmer公司）; Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）; Multiscan ascent 酶標儀（美國Thermo公司）; H-7650透射電子顯微鏡（日本日立公司）; 硝酸纖維素膜（NC膜）、金標結(jié)合墊、吸水墊（美國Millipore公司）; 聚氯乙烯（PVC）底板、樣品墊（上海金標科技生物有限公司）; 超純水凈化儀（美國Labconco公司）。

戊唑醇標準品（農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津））; 戊唑醇單克隆抗體（Teb McAb）及半抗原、包被原（Teb-OVA）由本實驗室制備。羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）; 牛血清蛋白（BSA）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、二水合檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）（美國Sigma公司）; 其它試劑均為分析純（西隴化工股份有限公司）。小麥粉產(chǎn)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院試驗田，甘藍、黃瓜購于南京某超市。

2.2 抗原的制備

2.2.1 半抗原的合成 戊唑醇半抗原的合成如圖1所示， 以C5H10COOH基團取代戊唑醇苯環(huán)上的p-Cl，引入偶聯(lián)臂和活性COOH基團，合成半抗原。

2.2.2 包被原的制備 采用混合酸酐法將合成的戊唑醇半抗原與卵清蛋白OVA（BSA）偶聯(lián)制備包被原。將0.05 mmol（19.4 mg）半抗原溶于1 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，再依次加入20 μL三正丁胺和10 μL氯甲酸異丁酯，4℃條件下攪拌反應(yīng)1 h，得到反應(yīng)混合物; 將0.5 μmol（30 mg）OVA溶于5 mL碳酸鹽緩沖溶液中，再逐滴緩慢加入上述混合物，攪拌反應(yīng)2 h; 將得到的反應(yīng)物透析，分裝后于-20℃保存，備用。

2.3 膠體金的制備與鑒定

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[26]： 500 mL三角瓶中加入200 mL二次蒸餾水，再加入1 mL 1% HAuCl4混合均勻，置于微波爐中加熱5 min至沸騰; 取出三角瓶，迅速順時針輕輕晃動，快速加入經(jīng)濾膜過濾的1%檸檬酸三鈉水溶液5 mL，快速混勻，放入微波爐中加熱4～5 min至沸騰，制備的酒紅色液體即為膠體金溶液。室溫避光冷卻后，用超純水定容至200 mL，4℃避光保存。紫外分光光度計掃描測定波長400～600 nm的最大吸收峰（λmax=519 nm）。透射電子顯微鏡（TEM）觀察鑒定膠體金顆粒的粒徑及分散性，結(jié)果顯示，膠體金顆粒分散均勻、無聚集，粒徑約為20 nm。

2.4 膠體金標記抗體探針的制備

2.4.1 最佳標記pH值條件優(yōu)化 取10個1.5 mL 離心管，分別加入1 mL膠體金溶液，依次編號為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9; 向各離心管中加入與編號數(shù)相同體積（μL）的0.1 mol/L K2CO3溶液，迅速充分混勻，調(diào)節(jié)溶液pH值; 向各離心管中加入20 μL 0.62 mg/mL戊唑醇單克隆抗體，輕輕搖勻，室溫下靜置反應(yīng)2 h; 測定未出現(xiàn)沉淀的溶液在400～600 nm的吸收光譜，并以K2CO3溶液加入量為橫坐標、各溶液最大吸收值為縱坐標，選取吸收值最大時對應(yīng)的K2CO3加入量，確定最佳標記pH值條件。

2.4.2 抗體最佳標記量的優(yōu)化 取12個1.5 mL的離心管，分別加入1 mL膠體金溶液，再以7 μL 0.1 mol/L K2CO3調(diào)至溶液pH值（如2.3.1節(jié)）; 依次加入戊唑醇單克隆抗體，使溶液終濃度為0、0.62、1.24、1.86、2.48、3.1、3.72、4.34、4.96、5.58、6.20和6.82 μg/mL，混勻后，室溫靜置5 min; 每管分別加入10%（m/V）NaCl溶液100 μL，靜置5 min，觀察記錄溶液的顏色變化，判斷抗體的最適標記量。

2.4.3 膠體金標記抗體探針 取5 mL膠體金溶液，加入35 μL 0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH值，加入8 μL抗體（0.62 mg/mL），室溫下攪拌反應(yīng)30 min; 加入10% （m/V） BSA溶液至BSA終濃度為0.01 g/mL， 室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min，12000 r/min離心35 min，棄上清液，加入0.5 mL重懸液（0.01%硼酸， 0.2% PEG 20000，0.02% NaN3）重懸沉淀，即得到膠體金標記戊唑醇單克隆抗體探針溶液，4℃避光保存，備用。

2.5 膠體金免疫試層析紙條的組裝與結(jié)果判定

2.5.1 試紙條的組裝 完整的試紙條包括聚氯乙烯（PVC）底板、吸水墊、NC膜、金標墊和樣品墊（圖2）。將NC膜貼在PVC底板的中間，用噴膜儀在NC膜上分別噴涂戊唑醇包被原（Teb-OVA）和羊抗鼠抗體（IgG），作為檢測線（T）和質(zhì)控線（C），T線和C線間隔4 mm; 金標結(jié)合墊和吸水墊于NC膜兩端重合1～2 mm貼在PVC底板上，金標結(jié)合墊貼在近檢測線（T）端，吸水墊近質(zhì)控線（C）端; 樣品墊與金標結(jié)合墊重合1～2 mm貼在PVC底板上，組裝完畢的PVC底板用切條儀切割成3.5 mm×60.0 mm試紙條。 37℃干燥箱干燥2 h，密封保存。

2.5.2 試紙條檢測結(jié)果的判定 將1 μL膠體金免疫探針固定于膠體金墊，干燥保存，待用，使用時，向樣品墊中滴加75 μL待測樣品液或不同濃度的戊唑醇標準品溶液（5%甲醇-PBS緩沖液稀釋配制），15 min后裸眼觀察判定檢測結(jié)果，結(jié)果如圖3所示。（1）當待測液中不含戊唑醇或濃度極低， 不足以檢出時，金標抗體與固定于T線上的包被原結(jié)合，形成肉眼可見的紅色條帶，同時，過量的金標抗體與C線上固定的羊抗鼠IgG抗體結(jié)合，形成肉眼可見的紅色條帶，此時T線與C線均為紅色條帶，當T線顯色等同或深于C線時，結(jié)果判定為陰性; （2）當待測液中存在戊唑醇（可檢出，濃度<6.25 ng/mL），或濃度高于6.25 ng/mL時，戊唑醇與金標抗體結(jié)合， T線顏色變淺或不顯色，免疫復合物或者多余的金標抗體與C線二抗結(jié)合顯紅色，此時T線顏色變淡（淺于C線顏色）或無色（戊唑醇濃度≥6.25 ng/mL），結(jié)果判斷為陽性; （3）當C線不顯色時，無論T線是否顯色，均判為試紙條失效。

2.6 戊唑醇LC-MS/MS檢測方法的建立

2.6.1 儀器檢測條件 （1）液相色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱（150 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）; 流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液（9∶1， V/V）; 流速： 0.4 mL/min; 進樣體積為5 μL; 柱溫40℃。（2）質(zhì)譜條件 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式掃描; 電噴霧正離子源（ESI+）; 離子化電壓：4000 V; 霧化氣溫度為350℃; 噴霧氣壓力為25 psi，流速為10 L/min。詳細質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

2.6.2 標準品溶液配制及標準曲線 稱取標準品，用乙腈溶液配制成濃度為100 mg/mL的標準儲備溶液。使用時用乙腈逐級稀釋成濃度為0、2.5、5、10、20、50、100和200 ng/mL的標準溶液。以定量子離子峰面積為縱坐標（y），濃度為橫坐標（x），建立LC-MS/MS檢測標準曲線。

2.7 樣品處理

2.7.1 樣品提取溶劑的選擇 將小麥研磨成粉，黃瓜、甘藍用食品粉碎機打碎至泥漿狀，然后取5 g

樣品于50 mL離心管中，添加戊唑醇農(nóng)藥標準品溶液，添加濃度分別為0、0.02、0.05和0.10 mg/kg。分別加入10 mL 5%甲醇-PBS、甲醇、乙腈和丙酮，除5%甲醇-PBS提取液，其它提取溶液中加入3 g NaCl，振蕩提取30 min， 5000 r/min離心5 min。

2.7.2 樣品提取液凈化 準確吸取5 mL上層提取液于10 mL離心管中，氮氣吹干。準確加入2 mL乙腈復溶，小麥樣品再加入1.0 mg C18，渦旋振蕩3 min，用0.22 μm濾膜過濾，通過儀器（LC-MS/MS）檢測戊唑醇，比較各提取溶劑的提取效率。

2.7.3 樣品基質(zhì)影響 選擇提取效率最高的溶劑進行添加回收實驗。在小麥、黃瓜、甘藍樣品中添加戊唑醇，濃度分別為0、0.02、0.05和0.10 mg/kg，每組重復3次，提取后，以氮氣吹干，用5%甲醇-PBS復溶，進行試紙條測試，并與LC-MS/MS結(jié)果進行對比。

3 結(jié)果與分析

3.1 戊唑醇半抗原的鑒定

戊唑醇半抗原分子式： C22H33N3O3，相對分子質(zhì)量為387.25，質(zhì)譜檢測得到m/z 388.3 [M+H]，符合預(yù)期分子量，1H NMR （DMSO）結(jié)果表明羧基偶聯(lián)改造成功： δ 11.98 （s， 1H， COOH）， 8.51 （s， 1H， Ar-H）， 8.01 （s， 1H， Ar-H）， 6.99～7.06 （m， 4H， pH-H）， 4.52 （s， 1H， CH2）， 4.25～4.39 （m， 2H， CH2）， 2.47～2.54 （m， 2H， CH2）， 2.17～2.20 （t， 2H， CH2）， 1.89～1.90 （m， 1H， CH2）， 1.73～1.76 （m， 1H， CH2）， 1.62～1.64 （m， 1H， CH2）， 1.51～1.60 （s， 4H， 2CH2）， 1.31～1.47 （m， 2H， CH2）， 1.29 （s， 9H， 3CH3）。

3.2 免疫原和包被原的鑒定

采用紫外分光光度法（240～400 nm）掃描戊唑醇半抗原、載體蛋白BSA、OVA及偶聯(lián)物免疫原、包被原，結(jié)果表明，免疫原（半抗原-BSA）和包被原（半抗原-OVA）有明顯的吸收峰偏移，表明偶聯(lián)成功。計算免疫原和包被原的摩爾比分別為24和33。

3.3 金標抗體制備條件的優(yōu)化

3.3.1 最佳標記pH值 將戊唑醇單克隆抗體加入到以0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)的不同pH值的膠體金溶液中，測定其吸收值。結(jié)果表明，當1 mL膠體金溶液加入7 μL 0.1 mol/L K2CO3，溶液的吸收值最大，最大吸收峰為521 nm，最大吸收值為0.644，此時膠體金顆粒表面結(jié)合的抗體最多，為膠體金顆粒與抗體結(jié)合的最佳標記pH條件。

3.3.2 抗體最適標記濃度 檸檬酸根保護的膠體金顆粒外層帶有負電荷，在靜電作用下，膠體金溶液為穩(wěn)定的膠體狀，在加入10% （m/V）NaCl時，由于鹽離子的作用，膠體金溶液發(fā)生聚沉，由均一的酒紅色變?yōu)樗{色?？贵w蛋白可通過物理吸附（靜電作用、疏水力及AuS鍵）與檸檬酸根包裹的膠體金結(jié)合，增加分子間距，在較高濃度鹽離子下，使膠體金顆粒仍能保持良好的分散性。鹽析誘導沉聚實驗表明，當抗體標記濃度≥4.96 μg/mL時，在鹽析作用下，膠體金標記的抗體仍保持穩(wěn)定，溶液顏色與原膠體金溶液顏色一致，即戊唑醇單克隆抗體最小標記濃度為4.96 μg/mL。

3.4 試紙條檢測線與質(zhì)控線的優(yōu)化

優(yōu)化了硝酸纖維素膜上C線（羊抗小鼠IgG抗體）和T線（戊唑醇包被原）的噴涂濃度。當C線噴涂1 mg/mL羊抗小鼠IgG，噴涂量為0.6 μL/cm時，C線顯示清晰的紅色條帶。采用棋盤法優(yōu)化T線戊唑醇包被原濃度，得最優(yōu)C線羊抗小鼠IgG濃度為1 mg/mL，噴涂量為0.6 μL/cm; 最優(yōu)T線戊唑醇包被原（Teb-OVA）濃度為0.3 mg/mL，噴涂量為0.6 μL/cm。

3.5 試紙條的靈敏度和特異性

以5% 甲醇-PBS溶液配制系列濃度的戊唑醇標準品溶液，使最終濃度為0、1.50、3.15、6.25、12.5、25.0和50.0 ng/mL。分別取75 μL樣液用于試紙條檢測，T線完全消失時的戊唑醇濃度即為試紙條的檢出限。如圖4所示，隨著戊唑醇濃度升高，T線顏色逐漸變淺，當戊唑醇濃度為6.25 ng/mL時，T線顏色基本完全消失，即為膠體金試紙條的檢出限（6.25 ng/mL， 參照前述樣品前處理稀釋10 ×， 換算后濃度為0.05 mg/kg），滿足國家標準中對小麥、蔬菜中農(nóng)藥最大殘留限量檢測的要求（0.05～1.0 mg/kg， GB2763-2016）[11]。

以5% 甲醇-PBS溶液分別稀釋多效唑、腈菌唑、丙環(huán)唑和己唑醇標準品至終濃度為1.0 μg/mL，用試紙條檢測，觀察試紙條的交叉反應(yīng)情況。結(jié)果表明，只有戊唑醇出現(xiàn)明顯的抑制，T線消失（圖5），表明此試紙條對戊唑醇有較好的特異性。

3.6 樣品提取條件的優(yōu)化

3.6.1 提取溶劑的選擇 樣品添加濃度分別為0、0.02、0.05和0.10 mg/kg，考察乙腈、丙酮、甲醇和5%甲醇-PBS 4種溶劑對戊唑醇的提取效率。 如表2所示， 提取效果為乙腈>丙酮>甲醇>5%甲醇-PBS，因此， 選取乙腈為添加回收實驗的提取溶劑，效率為79.0%～95.5%。

3.6.2 樣品提取液的凈化 以乙腈為提取溶劑進行樣品前處理及凈化，由圖6可見，本研究的凈化方法對小麥、黃瓜和甘藍3種基質(zhì)的凈化效果均較好，樣品峰不受到其它雜質(zhì)因素的影響，滿足戊唑醇在農(nóng)作物樣品中的殘留分析要求。

3.6.3 樣品基質(zhì)對膠體金試紙條的影響 取5 g小麥、黃瓜、甘藍樣品，加入10 mL乙腈，按2.8節(jié)方法操作，取5 mL上清液，經(jīng)氮氣吹干后，加入2.0 mL 5%甲醇-PBS復溶，過濾，得到小麥、黃瓜、甘藍的基質(zhì)混合溶液。將其分別稀釋2、5、10、20倍，得到相應(yīng)稀釋液，用稀釋液配制成濃度為0、 3.13和6.25 ng/mL的戊唑醇基質(zhì)標準溶液，并與5%甲醇-PBS配制的空白溶液比較。由表3可知，小麥樣品稀釋倍數(shù)<5時，試紙條出現(xiàn)假陰性; 當稀釋倍數(shù)>5時，與空白結(jié)果一致。黃瓜和甘藍樣品則在稀釋10倍之后與空白結(jié)果一致，表明可通過稀釋樣品提取液消除基質(zhì)干擾作用。本實驗中3種樣品均選擇稀釋10倍液檢測，以消除基質(zhì)對膠體金免疫層析試紙的影響。

3.7 方法驗證

3.7.1 戊唑醇LC-MS/MS方法驗證 選取小麥、黃瓜和甘藍樣品進行添加回收實驗，TEB添加濃度為0.02、0.05和0.10 mg/kg。樣品經(jīng)乙腈提取、凈化后，用于LC-MS/MS檢測。如表4所示，平均回收率為75.0%～100.0%，方法的檢出限（LOD）為1.5 ng/mL，相對標準偏差（RSD）小于6.9%，表明建立的戊唑醇LC-MS/MS檢測方法準確，可用于黃瓜、甘藍樣品中戊唑醇的測定，與文獻[27]報道結(jié)果一致。

3.7.2 免疫層析方法驗證 小麥、黃瓜、甘藍樣品中戊唑醇添加濃度分別為0、0.02、0.05和0.10 mg/kg， 靜置2 h。樣品提取過程如前述，基于抗體及NC膜對有機試劑的耐受程度及簡化前處理方法、基質(zhì)干擾（假陽性、假陰性）的考慮，以5%甲醇-PBS稀釋10倍直接用于試紙條檢測。檢測結(jié)果如圖7所示，小麥、黃瓜、甘藍的基質(zhì)在稀釋10倍后對試紙條均無影響，裸眼檢測靈敏度為6.25 ng/mL（結(jié)合前述樣品前處理過程，換算結(jié)果為0.05 mg/kg）， 表明添加濃度≥0.05 mg/kg時，樣品經(jīng)乙腈提取，5%甲醇-PBS復溶并稀釋10倍后，檢測結(jié)果為陽性。

4 結(jié) 論

建立了快速準確檢測小麥、蔬菜樣品中戊唑醇殘留的膠體金免疫層析試紙條檢測方法，并采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）對戊唑醇進行定量分析。所建立的試紙條對戊唑醇的裸眼觀察檢測靈敏度為6.25 ng/mL（結(jié)合樣品前處理過程，換算后為0.05 mg/kg），滿足國家標準中對小麥、蔬菜中農(nóng)藥最大殘留限量檢測的要求（0.05～1.00 mg/kg，GB2763-2016）。此試紙條特異性高，對其它三唑類殺菌劑丙環(huán)唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇無交叉反應(yīng)，LC-MS/MS方法的檢出限為1.0 ng/mL。兩種方法配合使用，可實現(xiàn)對小麥、黃瓜和甘藍樣品中戊唑醇的殘留的快速、準確、定量分析。

References

1 Narayanan C R，Venkatasubramanian N K. Tetrahedron Lett.， 1965， 6（41）： 3639-3646

2 HUA Nai-Zhen. Agrochemicals，? 2013，? 52（11）： 781-786， 809

華乃震. 農(nóng)藥，? 2013，? 52（11）： 781-786， 809

3 Cavariani C， Velini E D， Bicudo S J， Nakagawa J. Pesqui. Agropecu. Bras.，? 1994，? 29（7）： 1035-1039

4 Zhu W， Qiu J， Dang Z， Lv C， Jia G， Li L. Chirality，? 2010，? 19（2）： 141-147

5 Munoz-Leoz B， Ruiz-Romera E， Antiguedad I， Garbisu C. Soil Biol. Biochem.，? 2011，? 43（10）： 2176-2183

6 China PesticideInformantion Network， [2018-12-28] http：//www.chinapesticide.gov.cn/hysj/index.jhtml

中國農(nóng)藥信息網(wǎng)登記公告， [2018-12-28] http：//www.chinapesticide.gov.cn/hysj/index.jhtml

7 YANG Xiu-Hong， AN Fei-Yun， LU Dan. Practical Preventive Medicine，? 2010，? 17（10）： 2084-2087

楊秀鴻， 安飛云， 陸 丹. 實用預(yù)防醫(yī)學，?? 2010，? 17（10）： 2084-2087

8 Li S Y， Wu Q， Sun Q Q， Coffin S， Cui W J， Zhu G N. Aquat. Toxicol.，? 2019，? 211： 116-123

9 Li S Y， Sun Q Q， Wu Q， Gui W J， Zhu G N， Schlenk D. Environ. Pollut.，? 2019，? 249： 1049-1059

10 Tebuconazole （ELITE 45 DF）. Registration for Use on Cherry， Peach and Nectarine and Tolerance Petition for Residues in or on Cherry and Peach. Tox Review 011857， Mar， 29， 1996https：//iaspub.epa.gov/apex/pesticides/f？p=CHEMICALSEARCH：7：：：NO：1，3，31，7，12，25：P3_XCHEMICAL_ID：3984

11 GB 2763-2016， National Food Safety Standard Maximum Residue Limits for Pesticides in Food. National Standards of the People's Republic of China

食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量.? 中華人民共和國國家標準. GB 2763-2016

12 EU Pesticide Database. https：//eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/？uri=CELEX：32010R0750

13 Dong B Z， Yang Y P， Pang N N， Hu J Y. Food Chem.，? 2018，? 260： 66-72

14 Zhang Q， Zhou L L， Yang Y， Hua X D， Shi H Y， Wang M H. Ecotoxicol. Environ. Saf.，? 2016，? 117： 1-6

15 Wang X， Jia R B， Song Y， Wang M Q， Zhao Q H， Sun S H. Microchem. J.， 2019， 149： 104013

16 LIU Jun， LIU Qian， CHENG Yun-Bin， SHEN Jing， CHEN Xin. Journal of Anhui Agricultural Sciences，? 2018，? 46（35）： 171-173

劉 軍， 劉 騫， 程運斌， 沈 菁， 陳 鑫. 安徽農(nóng)業(yè)科學，?? 2018，? 46（35）： 171-173

17 Ackermann Y， Curtui V， Dietrich R， Gross M.， Latif H， Mrtlbauer E， Usleber E. J. Agric. Food Chem.，? 2011，? 59： 6360-6368

18 JIN Ren-Yao， ZHU Guo-Nian. Acta Agriculturae Nucleatae Sinica，? 2013，? （04）： 515-522

金仁耀， 朱國念. 核農(nóng)學報，? 2013，? （04）： 515-522

19 HUANG Jun-Ran， GAI Ling， YE Zun-Zhong， WANG Jian-Ping. Chinese J. Anal. Chem.，? 2010，? 38（10）： 1483-1486

黃君冉， 蓋 玲， 葉尊忠， 王劍平. 分析化學，?? 2010，? 38（10）： 1483-1486

20 GONG Hang， LIU Bei-Bei， LI Pan， HE Dan， GUO Yi-Rong， WANG Li-Min， HUA Xiu-De， WANG Ming-Hua， LIU Feng-Quan， XU Zheng-Lin， ZHANG Cun-Zheng， WANG Li. Chinese J. Anal. Chem.，? 2018，? 46（6）： 938-946

龔 航， 劉貝貝， 李 盼， 何 丹， 郭逸蓉， 王利民， 華修德， 王鳴華， 劉鳳權(quán)， 徐振林， 張存政， 王 麗. 分析化學，?? 2018，? 46 （6）： 938-946

21 WHANG Qian， LI Kang， CHEN Shu-Fen， LU Jian. Journal of Instrmental Analysis， 2009， 28（4）： 458-460

王 錢，? 李 康，? 陳樹芬，? 陸 健. 分析測試學報， 2009， 28（4）： 458-460

22 Danks C， Chaudhry M Q， Parker L， Barker I， Banks J N. Food Agr. Immunol.，? 2001，? 13（3）： 151-159

23 Qi P P， Wang J， Wang Z W， Wang X， Wang X Y， Xu X H， Xu H， Di S S， Zhang H， Wang Q， Wang X Q. Electrochim. Acta，? 2018，? 274， 406-414

24 Chen X J， Li Z Z， Sun F X， Cao X T， Wang Y， Cao L， Gao H L， Gao D， Wang Y W. Food Agr. Immunol.，? 2019，? 30（1）： 677-691

25 WANG Y L， Xu J L， Qiu Y L， Li P， Liu B B， Yang L F， Bogdan Barnych， Bruce D， Hammock， Zhang C? Z. J. Agric. Food Chem.， 2019， 67（32）： 9096-9103

26 HU Jing， GUO Yi-Rong， LIANG Xiao， LIU Xian-Jin， ZHU Guo-Nian， LIU Feng-Quan， WANG Ming-Hua， WANG Li-Min， HUA Xiu-De， ZHANG Cun-Zheng. Chinese J. Anal. Chem.，? 2016，? 44 （12）： 1900-1906

胡 靜， 郭逸蓉， 梁 曉， 劉賢金， 朱國念， 劉鳳權(quán)， 王鳴華， 王利民， 華修德， 張存政. 分析化學，?? 2016，? 44（12）： 1900-1906

27 WANG Su-Ru， GE Hui-Lin， HAN Bing-Jun， ZHAO Fang-Fang. Journal of Jilin Agricultural，? 2017，? 23（18）： 70-74

王素茹， 葛會林， 韓丙軍， 趙方方. 吉林農(nóng)業(yè)，?? 2017，? 23（18）： 70-74

Lateral Flow Assay for Determination of Tebuconazole

in Agricultural Products

XU Jun-Li1，2， LIU Bei-Bei2， WANG Yu-Long2， LI Pan2， YANG Kang2， WU Qin2，

JIANG Lan2，? ZHANG Hao-Ran2， YANG Li-Fei1， ZHANG Cun-Zheng2，3

1（College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

2（Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

3（School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

Abstract A Lateral flow assay was developed for the rapid determination of Tebuconazole residues in wheat and vegetables based on the high affinity and specific anti-Tebuconazole monoclonal antibody. For the lateral flow assay development， firstly， 20 nm size colloidal gold nanoparticle was synthesized to label anti-Tebuconazole monoclonal antibody （Mab） as a detection agent. Teb-OVA （0.3 mg/mL） conjugate and goat anti-mouse IgG antibody （1 mg/mL） were coated on nitric acid fiber membrane （NC） to form the test line （T） and quality control line （C）， respectively. Under the optimized conditions， the assembled immunochromatographic strip could accomplish the detection of Tebuconazole within 15 min. The Limit of detection observed by naked eyes was 6.25 ng/mL， with negligible cross-reactivity to the analogs of Tebuconazole. Meanwhile， for comparison， a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method was established to determine Tebuconazole accurately and quantitatively. The results released that these two developed methods matched each other very well. These two methods could be successfully employed for the detection of Tebuconazole in wheat， cucumber， and cabbage， high-throughput， specific and precise. Immunochromatographic strip could contribute to on-site determination， and LC-MS/MS based method provided accurate quantification.

Keywords Tebuconazole residue; Immunochromatographic strip; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry