兩種不同分離方法的唾液多肽組分析結(jié)果比較

孔祥怡　杜建時(shí)　徐金玲　李水明　王勇　趙晴

摘 要 唾液多肽經(jīng)Zip-Tip C18固相萃取和氧化石墨烯-磷酸鑭納米復(fù)合材料（LaGM）兩種方法分離后，利用高分辨串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行多肽鑒定， 將重復(fù)兩次的結(jié)果合并， 比較兩種方法的異同。利用Zip-Tip C18方法共檢測(cè)到歸屬于38種蛋白質(zhì)的545條序列特異肽段， 而LaGM方法檢測(cè)到了來源于44種蛋白質(zhì)的359條序列特異肽段， 其中二者重合的有116條肽段， 歸屬于21種蛋白質(zhì)。兩種方法所得的肽段分布特征和優(yōu)勢(shì)肽段構(gòu)成存在明顯差異， Zip-Tip C18更多富集Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B、Statherin和Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2等蛋白質(zhì)的肽段， 而利用LaGM方法可檢測(cè)更多的來源于Histatin-1、Histatin-3和Protein S100-A8的肽段， 考慮翻譯后修飾， 結(jié)論一致。以上結(jié)果表明， 這兩種方法對(duì)多肽的富集有一定偏好性， 即多肽分離過程有可能導(dǎo)致肽段的特異性丟失。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， 丟失肽段可能是檢測(cè)到肽段的序列相關(guān)肽段、修飾相關(guān)肽段、所歸屬蛋白質(zhì)的其它肽段或其它蛋白質(zhì)的肽段， 但序列相關(guān)肽段的幾率更大。本研究表明， 不宜用單一分離方法的結(jié)果代表整個(gè)多肽組， LaGM方法雖然檢出肽段數(shù)目較少， 但可以獲取更多的降解蛋白質(zhì)的信息。

關(guān)鍵詞 多肽組; Zip-Tip C18; 氧化石墨烯-磷酸鑭納米復(fù)合材料; 唾液; 高分辨串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

多肽組是指組織、細(xì)胞或體液等生物樣品中的全部多肽[1]， 反映了生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解情況， 是蛋白質(zhì)組學(xué)的延伸和補(bǔ)充。臨床體液樣本中多肽的分子量、序列和翻譯后修飾等信息有可能成為潛在的生物標(biāo)志物[2， 3]。根據(jù)分離方式的不同， 多肽分離方法可分為以下幾類：（1）利用半透膜、凝膠過濾或超濾離心管分離[4，5]; （2）利用三氯乙酸或有機(jī)溶劑沉淀富集[6，7]; （3）利用親和層析方法富集結(jié)構(gòu)特異性肽段[6]; （4）利用Zip-Tip C18固相萃取柱萃取（以下簡(jiǎn)稱Zip-Tip C18）[9]; （5）基于不同分離原理的納米材料磁珠富集[10]， 分離后的多肽進(jìn)一步通過質(zhì)譜進(jìn)行分子量或序列分析。Aristoteli等[11]發(fā)現(xiàn)， 對(duì)于血漿多肽組， 固相萃取優(yōu)于超濾和有機(jī)溶劑沉淀等方法， 但該工作鑒定到的肽段分子量多小于2000 Da。目前， 關(guān)于不同分離方法對(duì)多肽組分析結(jié)果的研究尚不深入。在以上四類方法中， Zip-Tip C18固相萃取法和納米材料磁珠富集法因操作簡(jiǎn)便、快速而使用較多， 本研究組在前期工作中建立了基于氧化石墨烯-磷酸鑭納米復(fù)合材料（LaGM）的體液多肽組分析方法[12]。本研究以唾液為體系， 比較了Zip-Tip C18和LaGM兩種分離方法， 發(fā)現(xiàn)它們的結(jié)果既有重疊， 也在肽段水和蛋白質(zhì)水平表現(xiàn)出了不同的特征， 說明唾液多肽組的分析結(jié)果與分離方法具有相關(guān)性， 利用單一分離富集方法得到的結(jié)果不宜代表全部多肽組。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Eksigent nanoLC-UltraTM 2D 系統(tǒng)、TripleTOF560高分辨質(zhì)譜儀、Protein Pilot 4.5軟件（美國(guó)AB SCIEX公司）; 真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Thermo Savant公司）。氧化石墨烯-磷酸鑭納米復(fù)合材料（LaGM）為本實(shí)驗(yàn)室合成[12]。PierceTM C18 Tips固相萃取柱（美國(guó)Thermo Scientific公司）。甲酸、乙腈（ACN， 質(zhì)譜純， 美國(guó)Sigma Aldrich 公司）。

2.2 多肽的分離和富集

唾液來源于一名健康男性志愿者。取0.5 mL人唾液與 0.5 mL去離子水混合， 取0.5 mL樣品， 按照文獻(xiàn)[12]方法， 利用LaGM磁性納米材料富集; Zip-Tip C18方法：取剩余0.5 mL唾液樣品， 加到10 kDa超濾離心管的樣品套管中， 離心1 h（4℃， 12000 r/min）， 收集含有多肽組分的流出液， 冷凍離心至10 μL。取10 μL 50% ACN活化C18 Tips柱， 重復(fù)一次; 取10 μL 0.1%三氟乙酸（TFA）溶液平衡C18 Tips柱， 重復(fù)一次; 上樣10 μL， 收集 10 μL含0.1% TFA-5% ACN的洗脫液， 凍干， 供質(zhì)譜分析。

2.3 液相色譜-TripleTOF質(zhì)譜分析

分離后凍干的多肽樣品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中， 在線Nano-RPLC液相色譜在Eksigent nanoLC-UltraTM 2D系統(tǒng)（AB SCIEX）進(jìn)行， 溶解后的樣品以2 μL/min的流速上樣到C18預(yù)柱（100 μm × 3 cm， 3 μm， 15 nm）上， 然后以相同流速?zèng)_洗脫鹽10 min。分析柱是C18反相色譜柱（75 μm × 15 cm， 3 μm， 12 nm， ChromXP Eksigent）， 梯度洗脫：70 min內(nèi)流動(dòng)相B由5%升高至80%。質(zhì)譜采用TripleTOF 5600 系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧III離子源（AB SCIEX， USA）， 噴霧電壓為2.4 kV， 氣簾氣壓為30 Psi， 霧化氣壓為5 Psi， 加熱溫度為150℃， 質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下（Information Dependent Analysis， IDA）， 一級(jí)TOF-MS單張圖譜掃描時(shí)間為250 ms， 每次IDA循環(huán)最多采集35個(gè)電荷為2+～8+， 且單秒計(jì)數(shù)大于100的二級(jí)圖譜， 每張二級(jí)圖譜的累積時(shí)間為80 ms。每次循環(huán)時(shí)間固定為2.5 s， 碰撞室能量設(shè)定為適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)解離（CID）， 動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為11 s。

2.4 數(shù)據(jù)分析條件

質(zhì)譜采集到的原始wiff圖譜文件， 采用Protein Pilot Software 4.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析， 數(shù)據(jù)庫為uniprot庫中的Homo sapiens人種專一數(shù)據(jù)庫（包含20210條蛋白質(zhì)序列， 2015年1月2日下載）， 檢索參數(shù)設(shè)置為非酶切、磷酸化修飾、氧化修飾強(qiáng)調(diào)和氨基酸取代， 假陽性率控制為1% FDR。

3 結(jié)果與討論

3.1 兩種不同分離方法分析結(jié)果的總體比較

如圖1所示， 在相同的實(shí)驗(yàn)條件下， 采用Tips C18和LaGM兩種分離方法所得到的多肽質(zhì)荷比隨時(shí)間分布圖具有明顯差異， 前者在前5 min和30 min的肽段數(shù)目較少， 多集中于10～20 min， 而且圖1A中的數(shù)據(jù)點(diǎn)比圖1B密集。 兩種方法重復(fù)兩次及刪除重復(fù)項(xiàng)的結(jié)果列于表1。將兩次測(cè)定結(jié)果合并后， 利用Zip-Tip C18方法共檢測(cè)到了690條序列特異性肽段， 而利用LaGM方法檢測(cè)到了507條肽段， 前者檢測(cè)到的肽段數(shù)目比后者多， 這也與前者的前體離子數(shù)目約為后者兩倍的結(jié)果一致。

將肽段總離子強(qiáng)度求和， Zip-Tip C18方法的總強(qiáng)度和肽段平均強(qiáng)度略高， 但在分析方法的誤差范圍之內(nèi)[13]， 可視為無顯著差異。兩種方法的質(zhì)荷比范圍相近， 但Zip-Tip C18方法的分子量范圍略寬。兩種方法分離多肽兩次測(cè)定的肽段重復(fù)數(shù)目分別是346和233條， 占總特異性肽段數(shù)目的比例分別是68%和63%。盡管Zip-Tip C18方法檢出了更多的肽段數(shù)目， 但是在蛋白質(zhì)水平上檢出的數(shù)目少， 兩次結(jié)果合并后只有38種蛋白質(zhì)， 而LaGM方法則為44種。 此結(jié)果表明， 這兩種方法的多肽組分布特征存在差異。

3.2 兩種不同分離方法的結(jié)果在蛋白質(zhì)水平的差異

由于多肽組產(chǎn)生于生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的內(nèi)源性降解， 首先在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行比較， 更能直觀地反映兩種方法的特性。在兩種方法中檢測(cè)到的共同蛋白質(zhì)為21種（表2）。 Zip-Tip C18方法中， 歸屬于Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B、Statherin和Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2等蛋白質(zhì)的肽段遠(yuǎn)多于LaGM方法， 而利用后者檢測(cè)到了更多的歸屬于Histatin-1、Histatin-3和Protein S100-A8蛋白質(zhì)的肽段。前期研究中， 利用LaGM方法在不同的樣本中檢測(cè)到的排名第一和第二的降解的蛋白質(zhì)也是Histatin-1和Mucin-7[14]， 表明本方法的穩(wěn)定性較好。由于同一分離方法兩次平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致， 推測(cè)如此大的差異與肽段的性質(zhì)相關(guān)， 而非來自于LC-MS 聯(lián)用分析過程中的偶然誤差， 分析結(jié)果的差異反映了兩種方法對(duì)于不同肽段的分離富集能力存在差異。除了表2中的21種肽段歸屬蛋白， LaGM方法還檢測(cè)到了其它22種唾液中的降解蛋白質(zhì)（表3）， 但這些蛋白質(zhì)大多只被檢測(cè)到1條肽段， 它們的肽段數(shù)目之和為40條， 即低于8%的肽段分布在50%以上的蛋白質(zhì)上， 并且信號(hào)強(qiáng)度也較低。這種肽段分布的不均性在血液多肽組中也可觀察到[15]。

3.3 兩種不同分離方法在肽段水平的差異

本研究將肽段序列相同但修飾不同的肽段視為兩條特異性肽段， 這里的修飾包括磷酸化、氧化、蛋白質(zhì)N端乙?；桶被崛〈?， 如LNEDVSQEESPSVISGKPEGRRPQ和其第6位絲氨酸的磷酸化是2條不同肽段。 利用Zip-Tip C18方法共檢測(cè)到了690條肽段， 包括545條序列特異性肽段， 其中145條肽段上發(fā)生了修飾， 而利用LaGM方法檢測(cè)到了507條肽段， 359條肽段為序列差異， 其中148條肽段發(fā)生了修飾， 兩種方法序列完全相同的肽段有116條， 歸屬于21種蛋白質(zhì)， 即雖然Zip-Tip C18方法比LaGM方法多檢出183條肽段， 但對(duì)發(fā)現(xiàn)降解蛋白質(zhì)的貢獻(xiàn)并不大， 因?yàn)楹芏唷靶略鲭亩巍睔w屬于打分排名靠前的高豐度蛋白， 歸屬于前十位蛋白質(zhì)的肽段占了總增加數(shù)目的84%以上。

二者在肽段分布特征和優(yōu)勢(shì)肽段構(gòu)成上也不相同， Zip-Tip C18方法的平均肽段數(shù)目是22.25條/蛋白質(zhì)， 而后者則為11.79條/蛋白質(zhì)。Zip-Tip C18方法中， 前3條打分最高的蛋白質(zhì)是Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B、Basic salivary proline-rich protein 1和Statherin， 對(duì)應(yīng)的特異性肽段數(shù)目分別為130、102和91條; LaGM方法中前3種分最高的蛋白質(zhì)是Histatin-1、Mucin-7和Uncharacterized protein C4orf40， 對(duì)應(yīng)的特異性肽段數(shù)目分別為128、38和54條， 二者完全沒有交集。值得注意的是， Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B在LaGM方法中只被鑒定到了19條肽段， 它們?cè)赯ip-Tip C18方法中均被檢出。相反， Histatin-1在Zip-Tip C18方法中有83條肽段被檢出， 但LaGM方法測(cè)到了128條肽段， 以上結(jié)果說明， Zip-Tip C18方法更易于富集Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B蛋白質(zhì)的肽段， 而Histatin-1的肽段更易于被LaGM分離。

兩種分離方法的結(jié)果雖然有差異， 但是存在階梯序列和肽段在蛋白質(zhì)水平上分布的不均一性是一致的。如唾液中肽段HSHREFPFYGDYGSNYLYDN的含量上升和GPGRIPPPPPAPY含量的下降被認(rèn)為是慢性腎病的兩種標(biāo)志物[16]， 但是， 利用LaGM方法檢測(cè)到63條含有該肽段的序列， 利用Zip-Tip C18方法則檢測(cè)到了29條， 而含有GPGRIPPPPPAPY的肽段數(shù)目則分別是9條和53條。此外， 利用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)到了一些質(zhì)荷比和分子量非常相近的肽段， 如VISDGGDSEQF（m/z 577.254）與IDEERQGPPL（m/z 577.299）， QRGPRGPYPPGPLAPPQPFGPG（N端焦谷氨酸化， m/z 741.720）和GPLAPPQPFGPGFVPPPPPPPY（m/z 741.727）， MALDI-TOF質(zhì)譜分析已表明樣本處理影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性 [17]， 而高分辨質(zhì)譜可以給出更為精準(zhǔn)的肽段序列信息， 因此， 可以更好地在肽段序列和蛋白質(zhì)層面闡述分離方法對(duì)多肽組結(jié)果的影響。 盡管以分子量作為多肽組學(xué)生物標(biāo)志物是目前應(yīng)用較成熟的技術(shù)指標(biāo)[18～20]， 但高分辨串聯(lián)質(zhì)譜方法可以提供更為精準(zhǔn)的信息。

3.4 對(duì)差異肽段的比較分析

如上所示， Zip-Tip C18方法檢測(cè)到的肽段數(shù)目多， 但肽段的歸屬蛋白較少， 而LaGM分離則發(fā)現(xiàn)了更多的降解蛋白質(zhì)， 為闡明這種現(xiàn)象的原因， 對(duì)改變分離方法后增加的肽段進(jìn)一步分析（表4）。

首先， 新檢出肽段為原來肽段的降解肽段， 如肽段QRGPRGPYPPGPLAPPQPFGPGFVPPPPPPPYGPGRIPPPPPAPYGPGIFPPPPPQP在兩種方法中均能檢測(cè)到， 但是Tips C18方法還檢測(cè)到了此肽段進(jìn)一步降解所產(chǎn)生的RGPYPPGPLAPPQPF、QRGPRGPYPPGPLAPPQPFG、QRGPRGPYPPGPLAPPQPFGP和VPPPPPPP等幾十種短肽段。第二種情況為兩種分離方法的結(jié)果在部分序列上存在重疊， 結(jié)果具有互補(bǔ)性。如肽段KFLRRIGRFGYGYGPYQPVPEQPLYPQPYQPQYQ及其降解肽段在兩種方法中都可以被檢出， 但兩種方法的差別在于Tips C18方法中檢出肽段SSEEKFLRRIGRFGYGYGPYQPVPEQPLYPQPYQPQYQ， 而LaGM方法檢出KFLRRIGRFGYGYGPYQPVPEQPLYPQPYQPQYQQYTF， 即兩種方法分別檢測(cè)到了此肽段的N-端和C-端的延長(zhǎng)肽段。第三， 盡管LaGM方法檢測(cè)到的肽段數(shù)目總體較少， 但對(duì)某些蛋白質(zhì)可以提供更多的肽段序列信息， 如Tips C18方法只檢測(cè)到了炎癥相關(guān)蛋白Protein S100-A8的一條肽段VWFKELDINTDGAVNFQEFLILVIKMGVAAHKKSHEESHKE， 但是利用LaGM方法不僅檢測(cè)到該肽段， 還檢測(cè)到多條包含該序列的相關(guān)肽段， 類似地， LaGM方法可在肽段AMVSEFLKQAW的基礎(chǔ)上檢測(cè)到肽段AMVSEFLKQAWF和AMVSEFLKQAWFI。也存在少數(shù)增加肽段序列不相關(guān)的情況， 如Tips C18方法檢測(cè)到Actin蛋白的肽段SLSTFQQMWISKQEYDESGPSIVHRKCF， 而LaGM方法則檢測(cè)到此蛋白的另外兩條肽段MVGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTL和NELRVAPEEHPVLL。最后， 特異性肽段的增加有時(shí)不體現(xiàn)在肽段序列的改變， 而是來自翻譯后修飾和氨基酸殘基的取代， 如Zip-Tip C18和LaGM方法中， 包含肽段DSHEKRHHGYRRKFHEKHHSHREFPFYGDYGSNYLYDN的特異性肽段的數(shù)目分別為4和22條， 這些差異肽段序列完全相同， 差異之處僅在于修飾不同， 除了原型肽段， 二者都觀察到2、20和32位絲氨酸殘基的磷酸化， 但是利用LaGM方法分離， 檢測(cè)到了更多種磷酸化修飾的組合和氨基酸取代肽段， 在該肽段的N端和C端截短肽上也觀察到了磷酸化修飾和氨基酸取代的現(xiàn)象（表5）。

4 結(jié) 論

唾液中的多肽成分非常復(fù)雜， 唾液多肽組的分析結(jié)果與分離方法密切相關(guān)， 不同分離方法可能導(dǎo)致肽段分布特征、優(yōu)勢(shì)肽段構(gòu)成和歸屬蛋白質(zhì)組成的差異， 僅采用一種分離方法不能代表多肽組的全部情況。 在多肽組學(xué)研究中， 應(yīng)重視低豐度肽段和蛋白質(zhì)的分離檢測(cè)。

References

1 Schrader M， Schulz-Knappe P. Trends Biotechnol.， 2001， 19（10）： S55-S60

2 Sapio M R， Fricker L D. Proteomics Clin Appl.，? 2014，? 8（5-6）： 327-337

3 CHEN Shi-Fan，YANG Jing-Bo， ZHANG Min， LI Xiao-Ou， LIU Xiao-Feng， GUO Hong-Hua， HE Cheng-Yan， GAO Hong-Wen. Chinese J. Anal. Chem.， 2017，? 45（2）： 224-230

陳世范， 楊靜波， 張 敏， 李曉鷗， 劉曉峰， 郭宏華， 何成彥， 高洪文. 分析化學(xué)， 2017，? 45（2）： 224-230

4 Rodrígueza A A， Stndkerb L， Zaharenkoc A J， Garateixa， A G， Forssmannb W G， Béressb L， Valdésa O， Hernándeza Y， Lagunaa A. J. Chromatogr. B，? 2012，? 903： 30-39

5 Zheng X Y， Baker H， Hancock W S. J. Chromatogr. A，? 2006，? 1120： 173-184

6 Dallas D C， Guerrero A，Khaldi N， Castillo P A， Martin W F， Smilowitz J T . J Proteome Res.，? 2013，? 12： 2295-2304

7 Khmelnitsky Y L，Belova A B， Levashov A V， Mozhaev V V. FEBS Lett.，? 1991，? 284： 267-269

8 Chon C， Marino F， Pak H S，Racle J， Danie R T， Müller M， Gfeller D， Coukos G， Michal Bassani-Sternberg M. Mol. Cell. Proteomics，? 2018，? 17： 533-548

9 D'Imperioa M， Cortea A D， Facchianoc A， Micheled M D， Ferrandinab G， Donatia M B， Rotilioa D. J Proteome Res.，? 2010，? 73： 1355-1367

10 Yang J， Li W H， Liu S Y， Yuan D Y， Guo Y J， Jia C， Song T S， Huang C. Sci. Rep.，? 2016，? 6： 25489

11 Aristoteli L P，? Molloy M P，? Baker M S. J. Proteome Res.，? 2007，? 6 （2）： 571-581

12 XU Jin-Ling， HONG Xiao-Yu， LI Shui-Ming， WANG Yong. Chinese J. Anal. Chem.，? 2016，? 44（12）： 1887-1891

徐金玲， 洪曉愉， 李水明， 王 勇. 分析化學(xué) ， 2016，? 44（12）： 1887-1891

13 HONG Xiao-Yu， WANG Hao， XU Jin-Ling， LI Shui-Ming， WANG Yong. Chinese J. Anal. Chem.，? 2016，? 44（3）： 403-408

洪曉愉， 王 皓， 徐金玲， 李水明， 王 勇. 分析化學(xué) ， 2016，? 44（3）： 403-408

14 HONG Xiao-Yu， LI Shui-Ming， WANG Yong. Chinese J. Anal. Chem.，?? 2016，? 44（12）： 1887-1891

洪曉愉， 李水明， 王 勇. 分析化學(xué) ， 2016，? 44（5）： 716-722

15 KONG Xiang-Yi， SHI Kai， CONG Le-Le， WANG Jing， JIANG Li-Jun， HONG Xiao-Yu， LI Shui-Ming， WANG Yong， ZHAO Qing. Chinese J. Anal. Chem.，? 2017，? 45（1）： 133-138

孔祥怡， 石 鍇， 叢樂樂， 王 靜， 蔣立軍， 洪曉愉， 李水明， 王 勇， 趙 晴. 分析化學(xué) ， 2017，? 45（1）： 133-138

16 Tong P Y， Yuan C， Sun X Y， Yue Q， Wang X L， Zheng S G. Clin. Chim. Acta，? 2019，? 489： 154-161

17 Hajduk J， Matysiak J， Kokot Z J. Clin. Chim. Acta，? 2016，? 458： 84-98

18 Sun X Y， Huang X， Tan X， Si Y， Wang X Z， Chen F， Zheng S G. J. Transl. Med.，? 2016，? 14： 240

19 Padoan A， Basso D， Ambon C F， Prayer-Galetti T， Arrigoni G， Bozzato D， Moz S， Zattoni F， Bellocco R， Plebani M.? Clin. Proteom. ，? 2018，? 15： 23

20 Wijte D， Liam A， McDonnell L A， Balog C I A， Bossers K， Deelder A M， Swaab D F， Verhaagen J， Mayboroda O A.? Methods，? 2012， 56： 500-507

Comparison of Two Different Separation Methods

for Analysis of Salivary Peptidome

KONG Xiang-Yi1， DU Jian-Shi1， XU Jin-Ling2， LI Shui-Ming2， WANG Yong2， ZHAO Qing*3

1（Lymphatic and Vascular Surgery Department， Xinmin Branch of China Japan Union Hospital，

Jilin University， Changchun 130033， China）

2（College of Life Science and Oceanography， Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources

and Ecology， Shenzhen University， Shenzhen 518060， China）

3（Neurology Department， Nanhu Branch of China Japan Union Hospital， Jilin University， Changchun 130033， China）

Abstract Zip-Tip C18 solid phase extraction and oxide graphene-lanthanum phosphate nano composite （LaGM） were used to separate saliva peptides respectively. The peptides were identified by high-resolution tandem time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS）. To reduce accidental errors， the MS analysis repeated once， and the results of two replicates were combined and then were compared at the peptide and protein levels respectively. A total of 545 sequence-specific peptides belonging to 38 proteins were detected by Zip-Tip C18 method， and 359 different peptides coming from 44 proteins were detected by LaGM method， and the two were coincident with 116 peptides （19 proteins）. Furthermore， it was found that the peptide distribution characteristics and the dominant peptide composition obtained by the two methods were significantly different. More peptides of Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B， Statherin and Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 were enriched by Zip-Tip C18; more peptides of Histatin-1， Hisatin-3 and Protein S100-A8 were detected by LaGM method， and the conclusions were consistent after post-translational modification were included. This study showed that these two methods had a preference for the enrichment of peptides， e.g. the separation process may lead to the loss of some peptides， the possible missing peptides may be the sequence-related peptides， modification-related peptides， protein-related peptides or peptides coming from some other proteins， fortunately， the potential missing peptides were more likely to be related with the peptides that had been detected. This study suggested that it may be not appropriate to use the results of a single separation method to represent the entire peptidome， and although the LaGM method detected fewer peptides， it was more conducive to enrichment of low-abundance peptides， by which more information about degrading proteins could be obtained.

Keywords Peptididome; Zip-Tip C18; Oxide graphene-lanthanum phosphate nano composite magnetic beads; Saliva; High resolution tandem mass spectrometry