運(yùn)動(dòng)對(duì)雄性小鼠骨內(nèi)分泌FGF23—Klotho∕FGFR1軸及相關(guān)因子表達(dá)的影響

徐帥 李世昌 陳祥和

1 淮陰師范學(xué)院體育學(xué)院（淮安223300）

2 華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（上海200241）

3 揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院（揚(yáng)州225127）

骨骼具有支持、保護(hù)、運(yùn)動(dòng)等功能，也是其他激素的靶器官。隨著研究深入，骨內(nèi)分泌系統(tǒng)（bone endocrine system）觀念得到認(rèn)可，將骨骼由被動(dòng)接受器官轉(zhuǎn)變?yōu)橹鲃?dòng)調(diào)節(jié)組織，提出骨分泌的調(diào)節(jié)地位。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼分泌源激素包括：骨鈣素（osteocalcin，OCN）、脂質(zhì)蛋白2（lipocalin 2，LCN2）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23）共3 種。FGF23 作為調(diào)節(jié)磷酸鹽和維生素D 的骨源性激素，由成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌，經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至腎臟組織。體外研究證實(shí)，F(xiàn)GF23 和受體Klotho 結(jié)合會(huì)降低成骨細(xì)胞分化和礦化水平[1]，在其受體Klotho的協(xié)同作用下與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1）共結(jié)合，能夠調(diào)節(jié)磷（phosphorus，P）水平和1，25二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]活性，提高腎臟對(duì)磷的排泄，維持血磷正常水平[2，3]，而骨骼損傷會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生高鈣血癥和高磷酸鹽血癥[4]。FGF23磷化活性主要抑制磷酸鹽重吸收，使尿磷酸鹽增多并降低血磷水平。FGF23 通過(guò)作用于Klotho-FGF 受體（Klotho-FGF Receptor，F(xiàn)GFR），進(jìn)一步下調(diào)腎臟近端小管內(nèi)鈉依賴性磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子2a（Na+-dependent phosphate co-transporter 2a，NPT2a）和鈉依賴性磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子2c（Na+-dependent phosphate co-transporter 2c，NPT2c）表達(dá)，抑制血磷重吸收。FGF23 在調(diào)節(jié)1，25（OH）2D3變化水平中的體現(xiàn)在：（1）抑制1α-羥化酶表達(dá)，其中1α-羥化酶由Cyp27b1基因編碼；（2）誘導(dǎo)24-羥化酶表達(dá)，其中24-羥化酶由Cyp24α1 基因編碼；1α-羥化酶表達(dá)降低和24-羥化酶表達(dá)升高引起1，25（OH）2D3水平減弱[5]。1，25（OH）2D3與FGF23構(gòu)成負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，注射FGF23 會(huì)引起1，25（OH）2D3的減弱，而注射1，25（OH）2D3 則會(huì)導(dǎo)致FGF23 的增加。

本研究基于整合生物學(xué)視角，將骨骼調(diào)控水平與腎臟功能進(jìn)行連接，從運(yùn)動(dòng)角度出發(fā)，探討多器官交互作用。本研究通過(guò)構(gòu)建不同運(yùn)動(dòng)模型小鼠，討論運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)骨分泌源激素變化，為運(yùn)動(dòng)促進(jìn)腎臟分泌功能提供數(shù)據(jù)支持，為了解運(yùn)動(dòng)改善慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)5 周齡C57BL∕6 雄性生長(zhǎng)期小鼠28 只，購(gòu)自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)碼為SCXX（滬）2012-0002，初始體重為18.19± 0.26 g。適用性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成對(duì)照組（control group，C 組）、跳躍組（jumping group，J 組）、游泳組（swimming group，S 組）和下坡跑組（downhill running group，R組）各7只，自由飲用礦物質(zhì)水。小鼠在華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物房（獨(dú)立順風(fēng)系統(tǒng)）飼養(yǎng)，室內(nèi)保持恒溫、恒濕，生活環(huán)境晝夜比為1∶1（24 h）。每周運(yùn)動(dòng)6 天、共8 周，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度在65%～70%VO2max。第1 周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，第1、2天為20 min，第3、4 天為35 min，第5、6 天為50 min，之后則每天進(jìn)行50 min訓(xùn)練。跳躍組跳躍頻率為6～7 次∕min；游泳組游泳裝置（長(zhǎng)×寬×高100 cm×60 cm×80 cm），水深40 cm，溫度保持32℃± 2℃；下坡跑組運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)坡度為－9°，跑速為0.8 km∕h（見(jiàn)圖1）。實(shí)驗(yàn)方案獲得華東師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批，倫理審查編號(hào)為：M20171202。

圖1 運(yùn)動(dòng)裝置

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

最后一次訓(xùn)練結(jié)束后，24 h內(nèi)處死，用精密度稱重儀稱取小鼠體重、右側(cè)股骨濕重和右側(cè)脛腓骨濕重；眼球取血后備用取血清；取腎臟組織。所有操作于冰上進(jìn)行，于－80℃超低溫冰箱存置，待測(cè)。

1.3 Western blotting檢測(cè)

稱取40 mg骨組織測(cè)FGF23；稱取40 mg腎臟組織測(cè)Klotho 和FGFR1，待測(cè)組織分別進(jìn)行檢測(cè)。加入210 μl RIPA 裂解液（含磷酸酶抑制劑），用鋼珠進(jìn)行勻漿研磨；結(jié)束后，冰上靜敷30 min，再以20 min、12000 g、4℃進(jìn)行離心，取上清；用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度；設(shè)置0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg∕ml的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，配置成20 μl 體系，每個(gè)體系中加入200 μl BCA 溶液，搖勻后放入37℃恒溫干燥箱中，預(yù)熱30 min；預(yù)熱后，在5 min 內(nèi)利用多功能酶標(biāo)儀在562 nm吸光度下進(jìn)行OD值的測(cè)量，根據(jù)濃度差異，分別加入不同含量SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（2X）和PBS。用SDS-PAGE 進(jìn)行凝膠電泳，采用濕膜法先80 V、再120 V 電泳，100 V 轉(zhuǎn)膜80 min，取膜、麗春紅染色、洗膜、封閉2 h、洗膜、孵一抗（小鼠源1∶1000）過(guò)夜12 h、洗膜3 次各5 min、孵二抗（抗小鼠1∶1500）2 h、洗膜3次；于暗室ECL顯影，用Aipha成像系統(tǒng)掃膜，并用Image Studio軟件進(jìn)行灰度值分析，將目的蛋白與內(nèi)參進(jìn)行比較計(jì)算。其中FGF23 抗體購(gòu)于Affinity 公司、Klotho 抗體購(gòu)于abcam 公司、FGFR1 抗體購(gòu)于CST公司、內(nèi)參GAPDH抗體購(gòu)于abcam公司。

1.4 RT-PCR檢測(cè)

主要包括4 步：（1）RNA 的提取。取腎臟組織，研磨后移入EP管中，加RNAiso PLUS提?。唬?）RNA濃度測(cè)定和純度分析；（3）RNA 反轉(zhuǎn)錄。RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再測(cè)定cDNA 濃度；（4）RT-PCR 擴(kuò)增。ABI StepOne 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量，記錄Ct值，根據(jù)內(nèi)參樣品值和待測(cè)樣品值計(jì)算基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為2-△△Ct計(jì)算法。所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成（見(jiàn)表1）。

表1 引物序列表

1.5 無(wú)機(jī)磷測(cè)定

血液4℃過(guò)夜，以20 min、4000 g、4℃離心取血清，磷測(cè)試盒（帶標(biāo)準(zhǔn)）磷鉬酸法實(shí)驗(yàn)分4 步：（1）取0.1 ml血清加0.4 ml 沉淀劑，混勻后離心10 min 取上清；（2）按照20 μl 待測(cè)上清液加200 μl 工作液，并設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)管和空白管；（3）37℃水浴30 min，冷卻至室溫，波長(zhǎng)660 nm，測(cè)定吸光度；（4）磷含量（mmol∕l）=（測(cè)定OD值－空白OD值）∕（標(biāo)準(zhǔn)OD值－空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.5 mmol∕l）×樣品處理稀釋倍數(shù)（5 倍）。無(wú)機(jī)磷測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.6 酶聯(lián)免疫分析

血液4℃過(guò)夜，以20 min、4000 g、4℃離心取上清，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，各50 μl（待測(cè)樣品10 μl 和稀釋液40 μl），加入酶標(biāo)試劑100 μl，37℃溫育60 min，去液，洗滌5 次，30 s∕次，加入顯色劑，37℃避光15 min，加終止液，450 nm 波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔OD 值。其中1，25（OH）2D3購(gòu)于上海酶聯(lián)生物。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，利用Excel 和SPSS19.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間采用單因素方差分析。其中P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠體重、單側(cè)股骨濕重和脛腓骨濕重的影響

由表2可見(jiàn)，游泳組體重低于對(duì)照組和下坡跑組（P＜0.05）；跳躍組和下坡跑組單側(cè)股骨濕重高于對(duì)照組（P＜0.05）；跳躍組和下坡跑組單側(cè)股骨濕重高于游泳組（P＜0.01）；各組間單側(cè)脛腓骨濕重?zé)o顯著變化。統(tǒng)一單位后，計(jì)算其骨濕重與體重變化，跳躍組和下坡跑組股骨濕重∕體重水平高于對(duì)照組（P＜0.01）；脛腓骨濕重∕體重水平無(wú)顯著差異。

表2 運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠體重、股骨和脛腓骨濕重的影響（n=7）

2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)骨中FGF23、腎臟中Klotho和FGFR1蛋白表達(dá)的影響

由圖2可見(jiàn)，跳躍組、游泳組和下坡跑組骨組織FGF23 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05 或P＜0.01）。各組腎臟Klotho蛋白相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異。下坡跑組腎臟FGFR1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖2 運(yùn)動(dòng)對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)腎臟中NPT2a、NPT2c、Cyp24α1 和Cyp27b1 mRNA表達(dá)的影響

由圖3可見(jiàn)，下坡跑組NPT2a mRNA 表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05）；各組腎臟NPT2c mRNA 表達(dá)水平無(wú)顯著差異；跳躍組和下坡跑組Cyp24α1 mRNA 表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.01），下坡跑組Cyp24α1 mRNA表達(dá)水平高于游泳組（P＜0.01）；下坡跑組Cyp27b1 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖3 運(yùn)動(dòng)對(duì)NPT2a、NPT2c、Cyp24α1 和Cyp27b1 mRNA表達(dá)的影響

2.4 運(yùn)動(dòng)對(duì)血磷和1，25（OH）2D3的影響

由圖4可見(jiàn)，游泳組和下坡跑組血磷水平低于對(duì)照組（P＜0.01）；跳躍組、游泳組和下坡跑組血清1，25（OH）2D3含量低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。

圖4 運(yùn)動(dòng)對(duì)血清指標(biāo)的影響

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠體重和骨濕重的影響

規(guī)律性運(yùn)動(dòng)能夠有效減少脂肪含量，減輕體重，提高肌肉和骨骼質(zhì)量[6]。本研究采用的運(yùn)動(dòng)方式，能更為有效地提高骨骼質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)8 周的運(yùn)動(dòng)干預(yù)，運(yùn)動(dòng)組體重均低于對(duì)照組，但是在股骨濕重變化上，跳躍組和下坡跑組明顯高于對(duì)照組，脛腓骨濕重之間則不存在顯著性差異。在股骨濕重∕體重、脛腓骨濕重∕體重的變化上，運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組骨骼比重遠(yuǎn)高于對(duì)照組，也符合上述骨骼質(zhì)量變化。整體而言，下坡跑組變化最為顯著，說(shuō)明8 周的直接應(yīng)力刺激可顯著提高小鼠股骨濕重，而游泳所產(chǎn)生的間接應(yīng)力反而沒(méi)有對(duì)股骨濕重起到直接刺激作用。在應(yīng)力刺激中有研究指出，50%的負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練，可有效提高老齡Wistar 大鼠的股骨濕重，低于（30%）或者超過(guò)（70%）該強(qiáng)度都不會(huì)顯著提高骨骼質(zhì)量[7]，過(guò)大強(qiáng)度的應(yīng)力刺激甚至?xí)?dǎo)致骨微環(huán)境損傷。本研究認(rèn)為，下坡跑運(yùn)動(dòng)與負(fù)重訓(xùn)練具有異曲同工之妙，且下坡跑運(yùn)動(dòng)的可操作性更強(qiáng)，尤其是對(duì)于刺激骨骼發(fā)生發(fā)展具有直接反饋性作用。

3.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)FGF23、Klotho和FGFR1蛋白表達(dá)的影響

骨骼成分主要為鈣磷化合物，當(dāng)機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)鈣磷紊亂現(xiàn)象，一方面，骨骼通過(guò)自身的骨轉(zhuǎn)換改善鈣磷平衡；另一方面，通過(guò)骨骼內(nèi)分泌因子與腎臟成纖維生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs）結(jié)合，調(diào)節(jié)磷吸收水平。但是FGFRs 與FGF23 的結(jié)合水平低，需要Klotho 先與FGFRs 結(jié)合，形成Klotho∕FGFR1 復(fù)合物，再與FGF23 結(jié)合發(fā)揮作用。FGF23 作為骨分泌性“調(diào)磷因子”，其分子量?jī)H為23 KD，能夠迅速穿過(guò)骨陷窩—骨小管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，進(jìn)入毛細(xì)血管，最終直接到達(dá)遠(yuǎn)端器官和細(xì)胞；在骨骼內(nèi)分泌過(guò)程中，F(xiàn)GF23低表達(dá)或高表達(dá)均會(huì)引起骨骼代謝紊亂[8]。在腎臟中，F(xiàn)GF23抑制近曲小管對(duì)磷的重吸收和維生素D的再合成，從病理生理學(xué)角度，缺乏FGF23或Klotho的小鼠表現(xiàn)出：尿磷排泄受損引起磷酸鹽潴留；1，25（OH）2D3的合成增多和降解減慢導(dǎo)致的維生素D 中毒[5]。在腎病綜合征患者中，骨骼FGF23 分泌水平減少會(huì)導(dǎo)致較低的維生素D水平以及尿失禁等癥狀[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能夠有效提高骨骼FGF23 分泌，尤其以下坡跑運(yùn)動(dòng)最為突出，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)會(huì)提高骨骼FGF23 合成以及血液循環(huán)中FGF23水平。研究還發(fā)現(xiàn)，在急性、力竭性和長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)下，均會(huì)提高血清FGF23 水平，考慮到FGF23 mRNA還可在肝臟、心臟、骨骼肌等多種器官中表達(dá)[9]，而且長(zhǎng)期規(guī)律運(yùn)動(dòng)會(huì)提高骨骼質(zhì)量和分泌能力。由此可認(rèn)為，短時(shí)間運(yùn)動(dòng)干預(yù)，雖然會(huì)顯著改善血液FGF23水平，但并不涉及到骨骼分泌程度的改變，只有在長(zhǎng)期效果下，運(yùn)動(dòng)才會(huì)明顯改善骨骼內(nèi)環(huán)境，提高FGF23循環(huán)水平，整體性改變血清FGF23水平。

FGF23 生物活性需要介質(zhì)Klotho，其中FGF23 和Klotho共缺陷小鼠由于維生素D中毒出現(xiàn)衰老表征，當(dāng)FGF23或Klotho缺陷時(shí)，小鼠會(huì)出現(xiàn)腎近曲小管1α-羥化酶過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致維生素D[1，25（OH）2D3]高度生成；而FGF23 和Klotho 缺陷小鼠，1，25（OH）2D3 循環(huán)水平極度升高，引起高血鈣癥和高磷酸鹽血癥[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，在Klotho調(diào)節(jié)中，不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)于其蛋白表達(dá)并沒(méi)有顯著性改善。分析認(rèn)為，一方面，受體本身的調(diào)節(jié)并不是影響下游因子變化的主要問(wèn)題；另一方面，高FGF23 水平對(duì)Klotho 調(diào)節(jié)還存在一定的抑制作用，其中高磷、低維生素D 和高FGF23 表達(dá)，會(huì)負(fù)性調(diào)節(jié)Klotho 表達(dá)，并積極誘導(dǎo)骨骼中FGF23 合成[10]。Klotho是作為一種抗衰老基因[10]，Klotho主要以膜型和分泌型2 種蛋白形式存在，其中膜型Klotho 會(huì)與FGF23 共結(jié)合，而分泌型Klotho（sKlotho）獨(dú)立于FGF23，在血液、尿液和腦脊液中可檢測(cè)到分泌型Klotho 蛋白。由于Klotho 具有延長(zhǎng)壽命的效果，Klotho 缺失會(huì)引起早衰，而運(yùn)動(dòng)會(huì)改變基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，急性有氧運(yùn)動(dòng)會(huì)顯著增加血液Klotho循環(huán)水平；同樣的，在久坐不動(dòng)的年輕或老年女性中，急性有氧運(yùn)動(dòng)同樣會(huì)改變血液Klotho 循環(huán)水平；且長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)也會(huì)提高Klotho 循環(huán)。這些研究表明，Klotho 上調(diào)與運(yùn)動(dòng)存在必然聯(lián)系[11]，也從側(cè)面證實(shí)了運(yùn)動(dòng)延緩衰老。

FGFR1 可在腎小管、脈絡(luò)叢、睪丸、竇房結(jié)以及骨組織等少數(shù)幾個(gè)組織中表達(dá)，F(xiàn)GFR1-∕-小鼠出現(xiàn)FGF23高表達(dá)、腸刷狀緣膜囊泡（brush-border membrane vesicle，BBMV）磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)水平增加，并提高NPT2c蛋白表達(dá)[12]。在FGFR1 運(yùn)動(dòng)干預(yù)中，運(yùn)動(dòng)會(huì)提高Klotho 與FGFR1結(jié)合率，通過(guò)8周運(yùn)動(dòng)干預(yù)，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)會(huì)提高腎臟中FGFR1 表達(dá)水平，尤其以下坡跑運(yùn)動(dòng)效果最佳。本研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)會(huì)改善機(jī)體內(nèi)FGFR1合成水平，對(duì)于維持機(jī)體血磷穩(wěn)態(tài)等具有良好的調(diào)控。Krajisnik 等[13]發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期慢性腎臟病（CKD）中，腎臟FGFR1表達(dá)下降，觀察到甲狀旁腺Klotho 和FGFR1 表達(dá)量隨著腎功能下降而下降，這與腎功能衰竭相關(guān)的礦物質(zhì)代謝改變有關(guān)，也可以解釋在晚期CKD 中觀察到FGF23 的甲狀旁腺抵抗現(xiàn)象，最終出現(xiàn)血清FGF23 升高的異常情況。在成年小鼠中利用單克隆FGFR1 抗體（R1MAb）激活FGFR1表達(dá)，會(huì)顯著提高FGF23水平，同時(shí)出現(xiàn)低磷癥狀；在培養(yǎng)大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞中，R1MAb 誘導(dǎo)FGF23 mRNA 表達(dá)和FGF23 蛋白表達(dá)；在培養(yǎng)腎上皮細(xì)胞系中，R1MAb 則充當(dāng)功能性FGF23 模擬物并激活FGF23生成[14]。

3.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)腎臟中NPT2a、NPT2c、Cyp24α1 和Cyp27b1 mRNA表達(dá)的影響

NPT2a 和NPT2c 突變與家族性低磷血癥患者的腎實(shí)質(zhì)結(jié)石（腎結(jié)石）和腎實(shí)質(zhì)礦物質(zhì)沉積（腎鈣質(zhì)沉著癥）相關(guān)。在全基因組關(guān)聯(lián)研究中，NPT2a與腎結(jié)石和腎功能改變有關(guān)。當(dāng)這兩種基因突變，表現(xiàn)出1，25（OH）2D高循環(huán)水平，以及吸收性高鈣尿癥?？诜姿猁}補(bǔ)充劑通過(guò)降低1，25（OH）2D和吸收性高鈣尿癥的循環(huán)水平，減少NPT2a 和NPT2c 突變攜帶者的腎礦化風(fēng) 險(xiǎn)[15]。NPT2a-∕-NPT2c-∕-小鼠和單獨(dú)敲除NPT2a 或NPT2c 小鼠相比，雙敲除小鼠的骨骼異?，F(xiàn)象更為明顯，表明兩分子在磷酸鹽穩(wěn)態(tài)中具有類似的非冗余作用，基因敲除小鼠的體內(nèi)血磷含量，80%由NPT2a 調(diào)節(jié)，20%由NPT2c 調(diào)節(jié)，研究指出NPT2a 和NPT2c 是由飲食、血磷和三類激素（PTH、1，25（OH）2D3和FGF23）共同調(diào)節(jié)[16，17]。在小鼠體內(nèi)，NPT2a在腎臟磷吸收中占到70%～80%，而NPT2c 主要在斷奶的動(dòng)物中起到重要調(diào)節(jié)作用。成年動(dòng)物體內(nèi)，NPT2c 對(duì)腎臟磷吸收作用較弱，在人體內(nèi)，NPT2c對(duì)腎臟磷吸收和骨骼礦化具有重要作用[16]。耐力運(yùn)動(dòng)會(huì)改善生長(zhǎng)期慢性腎病大鼠骨骼質(zhì)量[18]，在長(zhǎng)期慢性腎臟病中，定期有規(guī)律運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練會(huì)改善腎臟功能[19]。同時(shí)，Johansen[20]研究指出，腎臟患者中經(jīng)常采用有氧運(yùn)動(dòng)或者抗阻運(yùn)動(dòng)方式，會(huì)更好地改善腎臟功能。NPT2a和NPT2c能夠抑制腎臟磷的重吸收水平。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)組中NPT2a 和NPT2c mRNA 水平均有所下降，其中下坡跑組NPT2a mRNA表達(dá)水平顯著下降。

Cyp24α1 在維生素D3 的代謝中起著核心作用，1，25（OH）2D3 在Cyp24α1 依賴性代謝中存在物種差異性，人類Cyp24α1 表現(xiàn)出由C-23 和C-24 羥基化途徑，鼠系Cyp24α1 表現(xiàn)出C-24 相對(duì)C-23 途徑的優(yōu)勢(shì)性。此外，維生素D 類似物也存在Cyp24α1 依賴性代謝的種屬差異[21]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的Cyp27b1 突變體均未顯示對(duì)1，25（OH）2D3 活性影響。另外Sawada等[22]指出，Cyp27b1突變位的氨基酸殘基與Cyp24α1相同，Cyp24α1缺陷導(dǎo)致腦黃疸性黃瘤病（CTX），這是一種常染色體隱性脂質(zhì)貯積病。在中醫(yī)研究中，衰老大鼠腎上腺皮質(zhì)Cyp27b1 表達(dá)下降，Cyp24α1 表達(dá)上升；在淫羊藿苷對(duì)衰老大鼠腎上腺皮質(zhì)中Cyp24α1和Cyp27b1的藥物干預(yù)下，淫羊藿苷不同劑量組大鼠腎上腺皮質(zhì)Cyp27b1表達(dá)上升，Cyp24α1則相對(duì)下降[23]，表明衰老大鼠出現(xiàn)維生素D 失衡，反而需要提高1，25（OH）2D3 水平。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)期小鼠的運(yùn)動(dòng)干預(yù)，本研究發(fā)現(xiàn)，跳躍組和下坡跑組Cyp24α1 mRNA 表達(dá)水平極顯著高于對(duì)照組，下坡跑組Cyp27b1 mRNA 表達(dá)水平低于對(duì)照組。說(shuō)明24-羥化酶表達(dá)水平升高，1α-羥化酶表達(dá)水平降低，共同減弱1，25（OH）2D3水平。

3.4 運(yùn)動(dòng)對(duì)血磷和1，25（OH）2D3的影響

骨礦物鹽中的羥基磷灰石主要由鈣和磷構(gòu)成，由于骨重建是一個(gè)持續(xù)動(dòng)態(tài)過(guò)程，磷可通過(guò)骨釋放入血，引起血磷水平變化，對(duì)于腎臟功能不全的患者，會(huì)導(dǎo)致磷含量過(guò)高，其中高磷血癥是CKD 最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。而運(yùn)動(dòng)可有效改善血磷水平，在為期50周的耐力運(yùn)動(dòng)中，當(dāng)攝入鈣磷比為2∶1 時(shí)，運(yùn)動(dòng)可有效提高股骨濕重和股骨鈣含量[24]。本研究在不改變飼養(yǎng)配料的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)干預(yù)會(huì)有效緩解血磷水平，尤其是在游泳運(yùn)動(dòng)和下坡跑運(yùn)動(dòng)中，血磷水平具有極顯著性差異，顯著低于對(duì)照組血磷水平。其中血磷濃度降低，與運(yùn)動(dòng)存在必然聯(lián)系，隨著骨骼質(zhì)量提高，以及骨內(nèi)分泌系統(tǒng)中FGF23 分泌增加，鈣磷結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生變化。而對(duì)于去卵巢的SD大鼠，不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)下血磷沒(méi)有顯著性改變[25]。

維生素D3 的活性形式1，25（OH）2D3 在鈣和磷穩(wěn)態(tài)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞分化中起著重要作用，超過(guò)1000種維生素D 類似物用于I 型佝僂病、骨質(zhì)疏松癥、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、白血病和乳腺癌等[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著血磷下降的還有血清1，25（OH）2D3 的含量下降。對(duì)老年人的高維生素D 攝入和運(yùn)動(dòng)干預(yù)下，Scott 等[26]也認(rèn)為，受試者身體機(jī)能的提高主要是由于運(yùn)動(dòng)引起的效果。在健康男性中，維生素D 通過(guò)肝臟（25-羥化酶）形成25（OH）2D3 后，經(jīng)過(guò)腎臟（1-羥化酶）轉(zhuǎn)化為1，25（OH）2D3，其中1，25（OH）2D3 對(duì)于血鈣穩(wěn)態(tài)、骨代謝平衡和神經(jīng)肌肉穩(wěn)態(tài)具有重要作用，還具有抗惡性細(xì)胞增生、促進(jìn)分化和免疫調(diào)節(jié)[27]。

4 結(jié)論

與跳躍運(yùn)動(dòng)和游泳運(yùn)動(dòng)相比，下坡跑運(yùn)動(dòng)能夠顯著提高生長(zhǎng)期雄性小鼠的骨骼質(zhì)量，增加股骨濕重，引起FGF23 表達(dá)水平升高，并通過(guò)FGF23--Klotho∕FGFR1 軸調(diào)節(jié)腎臟功能，降低NPT2a 和NPT2c 表達(dá)，降低血磷水平；提高Cyp24α1表達(dá)，降低Cyp27b1表達(dá)，降低1，25（OH）2D3水平。