基于FXR?FGF19通路研究益生菌對膽總管結石患者膽汁酸代謝的影響

背景：膽總管結石在取石術后有較高的復發(fā)率。近年研究表明腸道微生態(tài)失衡與膽固醇結石的形成有關。目的：探究益生菌干預對膽固醇結石高危人群血清脂多糖（LPS）以及膽汁酸代謝指標的影響。方法：選取2021年6月—2023年6月在石河子大學第一附屬醫(yī)院行ERCP取石術的膽總管結石患者60例，收集膽汁和糞便樣本行細菌培養(yǎng)。將患者隨機分為對照組和益生菌干預組，對照組取石術后予常規(guī)支持治療，干預組在常規(guī)治療的基礎上服用雙歧桿菌三聯(lián)活菌腸溶膠囊420 mg，每日2次，連續(xù)6個月。檢測治療前后革蘭陰性菌細胞壁成分LPS、膽汁酸代謝關鍵分子成纖維細胞生長因子19（FGF19）和膽汁酸合成限速酶膽固醇7α?羥化酶（CYP7A1）血清水平的變化。結果：膽總管結石患者膽汁、糞便細菌培養(yǎng)顯示主要致病菌為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。ERCP取石術后6個月，患者血清LPS、FGF19水平明顯降低，CYP7A1水平明顯升高（P均lt;0.05），益生菌干預組數(shù)據(jù)變化較對照組更為顯著（P均lt;0.05）。結論：口服益生菌制劑可降低膽固醇結石高危人群的血清LPS水平，同時調(diào)節(jié)膽汁酸經(jīng)腸肝循環(huán)代謝的經(jīng)典通路法尼酯X受體（FXR）?FGF19通路，從而減少膽汁中的膽固醇過飽和，降低膽固醇結石的形成概率。

關鍵詞 益生菌； 脂多糖類； 膽總管結石； 膽汁酸代謝； 法尼酯X受體； 膽固醇7?α?羥化酶

Effect of Probiotics on Bile Acid Metabolism via FXR?FGF19 Pathway in Patients With Choledocholithiasis YE Lüwang1， WANG Cong1， FAN Junwei1， JIANG Ting1， DU Mengyan1， CHEN Weigang2， LIU Fang2. 1Shihezi University School of Medicine， Shihezi， Xinjiang Uygur Autonomous Region （832002）; 2Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Shihezi University， Shihezi， Xinjiang Uygur Autonomous Region

Correspondence to： LIU Fang， Email： 18009935806@163.com

Background： Recurrence after stone removal is common in patients with choledocholithiasis. Recent studies have indicated that dysbiosis in gut microbiota plays an important role in the formation of cholesterol gallstones. Aims： To explore the effect of probiotics supplementation on serum lipopolysaccharide （LPS） and the indicators of bile acid metabolism in patients with a high risk of cholesterol gallstone formation. Methods： Sixty choledocholithiasis patients undergoing ERCP lithotomy were recruited at the First Affiliated Hospital of Shihezi University from June 2021 to June 2023. Bile and stool samples were collected for bacterial culture. Then the patients were randomly allocated into two groups：" patients in control group received conventional supportive therapy after calculus removal， while those in probiotics intervention group were given oral bifid triple viable enteric capsule 420 mg， twice a day for 6 months based on conventional therapy. Changes in serum levels of LPS， the cell wall component of Gram?negative bacteria， fibroblast growth factor 19 （FGF19）， the key molecule in bile acid metabolism， and cholesterol 7α?hydroxylase （CYP7A1）， the rate?limiting enzyme of bile acid synthesis， were determined and compared between the two groups. Results： Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were the main pathogens in bile and stool of patients with choledocholithiasis. Six months after ERCP lithotomy， the serum levels of LPS and FGF19 were decreased， and the serum level of CYP7A1 was increased in both groups （all Plt;0.05）， especially in probiotics intervention group （all Plt;0.05）. Conclusions： Oral probiotics supplementation can reduce the serum LPS level and modulate the canonical pathway of enterohepatic circulation of bile acids ?? farnesoid X receptor （FXR）?FGF19 pathway in high?risk patients of cholesterol gallstone formation. These alterations reduce the cholesterol supersaturation in bile and inhibit the probability of cholesterol gallstone formation.

Key words Probiotics; Lipopolysaccharides; Choledocholithiasis; Bile Acid Metabolism; Farnesoid X Receptor; Cholesterol 7?alpha?Hydroxylase

膽石癥在全球范圍內(nèi)十分普遍，我國報道的成人膽囊結石患病率為2.3%～6.5%，其中70%以上為膽固醇結石[1]。膽總管結石多繼發(fā)于膽囊結石，結石系從膽囊脫落至膽總管，內(nèi)鏡取石術后復發(fā)率高達12.4%[2]，且通常會誘發(fā)急性膽管炎、急性膽源性胰腺炎，該類患者也是膽固醇結石再次形成的高危人群。膽汁中膽固醇過飽和是膽固醇結石形成的前提，膽固醇在肝臟中經(jīng)關鍵限速酶膽固醇7α?羥化酶[cholesterol 7α?hydroxylase，又稱細胞色素P450 7A1酶（cytochrome P450 7A1， CYP7A1）]的作用和一系列生物學轉(zhuǎn)化過程分解為膽汁酸，隨膽汁排入腸道，并在腸道內(nèi)被重吸收入肝，這一膽汁酸腸肝循環(huán)受多種因素調(diào)節(jié)，其中以法尼酯X受體（farnesoid X receptor， FXR）?成纖維細胞生長因子19（fibroblast growth factor 19， FGF19）通路最為經(jīng)典[3]，干預和調(diào)控CYP7A1以及FXR?FGF19通路是膽汁酸代謝的研究熱點。

近年研究[4]表明，膽總管結石患者的腸道微生態(tài)改變表現(xiàn)為菌群多樣性減少、結構失調(diào)，以大腸埃希菌為代表的革蘭陰性桿菌豐度增加。腸道微生態(tài)失衡可影響膽汁酸和膽固醇代謝，與膽固醇結石的形成密切相關[5?6]，但相應環(huán)節(jié)之間的關聯(lián)以及具體機制尚不明確。脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分和毒力因子，被認為與感染嚴重程度呈正相關。一些研究指出，在肥胖等代謝相關疾病中，補充益生菌可通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善腸道通透性，降低循環(huán)血LPS含量[7]。本研究分析了膽總管結石患者膽汁和糞便主體菌屬的關聯(lián)，觀察內(nèi)鏡取石術后補充益生菌制劑患者的血清LPS以及FGF19、CYP7A1水平變化，探究益生菌干預是否能對LPS以及膽汁酸代謝指標產(chǎn)生影響，以期為預防膽固醇結石的形成提供臨床數(shù)據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

連續(xù)納入2021年6月—2023年6月期間就診于石河子大學第一附屬醫(yī)院，確診為膽總管結石并經(jīng)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術（ERCP）一次性取石成功的患者。排除標準：①患者明確拒絕入組；②嚴重術中、術后并發(fā)癥；③嚴重心、腎功能不全，合并惡性腫瘤，合并其他嚴重膽道疾病；④入組前2周接受過抗菌藥物治療；⑤ERCP術未完全取出膽管結石，或術中植入膽管支架。最終共60例膽總管結石患者納入研究，采用隨機數(shù)字表法分為益生菌干預組和對照組，每組30例。研究通過石河子大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批件號：KJX2022?056?01），入組患者均簽署知情同意書。

二、方法

1. 膽汁、糞便樣本收集和細菌培養(yǎng)：于ERCP術中收集膽汁標本，于益生菌干預前收集糞便標本（2 g），進行細菌培養(yǎng)。糞便標本暫存于無菌容器內(nèi)，稀釋后接種于培養(yǎng)基上，膽汁標本則直接接種于培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以接種環(huán)挑取單個菌落，染色后于光學顯微鏡下鑒定菌種。

2. 益生菌干預：對照組ERCP取石術后予常規(guī)支持治療，干預組在常規(guī)治療的基礎上聯(lián)合口服雙歧桿菌三聯(lián)活菌腸溶膠囊（貝飛達?，210 mg/粒，每克含長型雙歧桿菌≥1.0×106 CFU，嗜酸乳桿菌≥1.0×106 CFU，糞腸球菌≥1.0×106 CFU；晉城海斯制藥有限公司，國藥準字S19993065）420 mg，每日2次，連續(xù)服用6個月。

3. 血清LPS、FGF19、CYP7A1水平測定：分別于ERCP取石術前和術后6個月收集血清標本，采用ELISA法檢測LPS、FGF19、CYP7A1水平，操作步驟參照試劑盒（CUSABIO TECHNOLOGY LLC）說明書。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布者以x±s描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗或配對t檢驗，不符合正態(tài)分布者以M（P25， P75）描述，兩組間比較采用Mann?Whitney U檢驗或Wilcoxon符號秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和（或）百分率描述，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、一般資料

對照組30例患者中，男性18例，女性12例，平均年齡（69.50±13.38）歲；干預組30例患者中，男性17例，女性13例，平均年齡（71.87±9.71）歲。兩組性別構成、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P均gt;0.05）。

二、膽汁和糞便細菌培養(yǎng)結果

膽汁細菌培養(yǎng)檢出例數(shù)居前3位的細菌為大腸埃希菌（19例）、糞腸球菌（16例）和肺炎克雷伯菌（15例），陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、鶉雞腸球菌、變形桿菌檢出例數(shù)均為3例。5例患者膽汁培養(yǎng)結果為陰性，16例患者膽汁中培養(yǎng)出2種細菌。

糞便細菌培養(yǎng)共檢出6種細菌，分別為大腸埃希菌（30例）、糞腸球菌（20例）、肺炎克雷伯菌（10例）、變形桿菌（5例）、頭狀葡萄球菌（2例）和銅綠假單胞菌（1例）。18例患者糞便培養(yǎng)結果為陰性，23例患者至少培養(yǎng)出2種細菌。膽汁細菌培養(yǎng)檢出例數(shù)居前5位的菌種與糞便細菌培養(yǎng)一致（圖1）。

二、血清LPS、FGF19、CYP7A1水平

ERCP取石術前，干預組與對照組血清LPS水平差異無統(tǒng)計學意義（P=0.05）；取石術后6個月，兩組LPS水平均較治療前明顯降低（P均lt;0.01），干預組下降更為顯著，與同時點對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01；表1、圖2A）。

ERCP取石術前，干預組與對照組血清FGF19、CYP7A1水平差異無統(tǒng)計學意義（P=0.05， P=0.86）；取石術后6個月，兩組FGF19水平較治療前明顯降低，CYP7A1水平較治療前明顯升高（P均lt;0.01），干預組數(shù)據(jù)變化更為顯著，與同時點對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P均lt;0.01；表1、圖2B、2C）。

討 論

腸道菌群及其代謝產(chǎn)物所構成的微生態(tài)環(huán)境對宿主的營養(yǎng)和藥物代謝、病原體抵抗，以及腸黏膜屏障結構的完整性和腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維持具有至關重要的作用，健康的腸道微生態(tài)與宿主整體健康密切相關[8?9]。已有研究表明腸道微生態(tài)失衡參與了膽固醇結石的形成[3?6]，本研究擬分析膽總管結石患者腸道菌群結構的變化以及益生菌干預對膽汁酸代謝的影響。研究收集膽總管結石患者的膽汁和糞便標本進行細菌培養(yǎng)，結果顯示兩種標本中的致病菌均以革蘭陰性桿菌大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主。Lyu等[10]的研究收集膽總管結石患者的膽汁和十二指腸液行16S rRNA高通量測序，發(fā)現(xiàn)十二指腸埃希菌屬?志賀菌豐度顯著增加，與本研究發(fā)現(xiàn)相一致。大腸埃希菌屬于變形菌門，為革蘭陰性桿菌，而變形菌門豐度增加是腸道微生態(tài)失衡和相關疾病風險的標志之一[11]。我國學者對膽總管結石合并膽管炎患者腸道微生態(tài)的宏基因組測序分析也發(fā)現(xiàn)，患者膽汁培養(yǎng)可檢出大腸埃希菌、產(chǎn)酸克雷伯菌等多種致病菌，腸道中未分類腸桿菌科、大腸埃希菌、產(chǎn)酸克雷伯菌等的豐度較健康人顯著增加[4]。新近動物實驗結果顯示，以膽固醇結石患者為供體的糞菌移植在常規(guī)飲食飼養(yǎng)的無膽石小鼠中可誘導膽固醇結石形成，未行糞菌移植的小鼠則無結石形成[12]。綜合上述研究結果，推測腸道菌群與膽總管結石合并膽道感染相關，且以變形菌門革蘭陰性桿菌為主，革蘭陰性桿菌在膽固醇結石的形成中起有重要作用。

LPS是腸道革蘭陰性桿菌致病過程中的關鍵分子，其為革蘭陰性菌的細胞壁成分，可通過激活Toll樣受體（Toll?like receptor 4， TLR4）觸發(fā)機體免疫應答，可激活絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase， MAPK）、核因子?κB（nuclear factor?κB， NF?κB）等免疫炎癥信號通路，上調(diào)白細胞介素?1（interleukin?1， IL?1）、IL?6、腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α， TNF?α）等促炎細胞因子表達，與腸道細菌感染相關膿毒癥、膿毒性休克、多器官衰竭，以及炎癥性腸病等非感染性腸道炎癥的發(fā)生、發(fā)展有關，并可通過腸肝軸參與肝臟炎癥損傷的發(fā)生[13?14]。有研究發(fā)現(xiàn)LPS可降低腸道菌群多樣性，并導致腸道相關淋巴組織中調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少，Th17、Th1細胞數(shù)量增加[13]。牛昊書等[15]探討了脂多糖與膽總管結石形成的關系，指出LPS可通過與TLR4結合，激活細胞內(nèi)MAPKs?NF?κB信號通路，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應，最終促進膽石形成。本研究納入的膽總管結石患者膽汁和糞便細菌培養(yǎng)結果均為以大腸埃希菌為代表的革蘭陰性桿菌為主，血清LPS水平呈升高狀態(tài)，結合上述研究結果，推測LPS增加與腸道內(nèi)革蘭陰性桿菌豐度增加有關。

益生菌是一類對健康有益的活性微生物，可通過形成酸性環(huán)境、競爭結合位點、破壞病原菌結構以及合成抑菌物質(zhì)等方式調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定，通過增強腸道化學屏障、機械屏障、生物屏障、免疫屏障等提高腸道防御能力[16]。既往研究表明，補充益生菌制劑可改善女性絕經(jīng)后肥胖[17]以及自身免疫性肝炎[18]、膽總管結石[15]等多種疾病狀態(tài)下的LPS水平升高。本研究予ERCP取石術后膽總管結石患者雙歧桿菌三聯(lián)活菌腸溶膠囊干預6個月，亦觀察到血清LPS水平顯著降低，且降幅明顯高于單純行ERCP取石術者，證明益生菌制劑可用于膽固醇結石復發(fā)高危患者的治療，對于降低血清LPS水平具有積極作用。

CYP7A1是肝細胞以膽固醇為原料合成膽汁酸的關鍵限速酶，其活性受抑可致膽固醇分解代謝受阻，膽汁中膽固醇過飽和是膽固醇結石形成的必要條件；包括不同核受體和調(diào)節(jié)因子在內(nèi)的多種機制參與了CYP7A1的表達調(diào)控[19?20]。膽汁酸受體核受體FXR相關通路是調(diào)節(jié)膽汁酸代謝最為經(jīng)典的通路：一方面，肝臟中的FXR通過誘導產(chǎn)生小異二聚體分子伴侶（small heterodimer partner， SHP）、轉(zhuǎn)錄激活因子肝細胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α， HNF4α），抑制肝受體同源物?1（liver receptor homolog?1， LRH?1）而抑制CYP7A1表達，影響膽固醇分解代謝；另一方面，腸道中的FXR可誘導腸上皮細胞分泌FGF19，后者進入腸系膜靜脈和門靜脈，與肝細胞表面的成纖維細胞生長因子受體4（fibroblast growth factor receptor 4， FGFR4）/β?klotho異二聚體結合，與SHP共同作用，下調(diào)CYP7A1表達[3]。Ye等[21]的實驗研究顯示，乳酸菌制劑可改善致石飲食引起的腸道微生態(tài)失衡，通過激活FXR增加小鼠回腸FGF15（人FGF19同源物）和肝細胞FGFR4、SHP表達，進而抑制CYP7A1表達，調(diào)節(jié)膽汁酸代謝，減少膽固醇結石的形成。本研究結果表明，膽總管結石患者的血清FGF19水平在ERCP取石術后顯著降低，同時血清CYP7A1水平升高，接受益生菌干預者兩者變化更為顯著。推測益生菌干預系通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、減少腸道革蘭陰性桿菌豐度而降低LPS水平，并對調(diào)節(jié)膽汁酸代謝的FXR?FGF19通路以及CYP7A1表達產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)口服益生菌制劑可降低膽固醇結石高危人群的血清LPS水平，同時調(diào)節(jié)膽汁酸經(jīng)腸肝循環(huán)代謝的經(jīng)典通路FXR?FGF19通路，從而減少膽汁中的膽固醇過飽和，降低膽固醇結石的形成概率。LPS作為革蘭陰性菌細胞壁的主體成分，可能成為研究調(diào)節(jié)腸道菌群干預膽汁酸代謝的新靶點，為探究膽汁酸代謝的各調(diào)節(jié)通路，以及開展益生菌抑制膽固醇結石成石的機制研究提供幫助。本研究為單中心小樣本研究，因患者依從性低而未能進行益生菌干預后的膽汁和糞便細菌培養(yǎng)，亦未能行機制研究。后續(xù)擬開展大樣本多中心研究，提高患者依從性，增加益生菌干預種類并設計動物實驗，以進一步深入探討益生菌降低ERCP取石術后膽總管結石復發(fā)率的相關機制。

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（本文編輯：蔣曉玲）

*基金項目：新疆生產(chǎn)建設兵團指導性科技計劃項目（2022ZD086， 2023ZD006）；石河子大學自主資助支持校級科研項目（ZZZC202197）；石河子大學第一附屬醫(yī)院院級科研項目（ZD201903）#Email： 1107505466@qq.com

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