橡膠樹F3’H基因克隆及其功能分析

范月婷 辛士超 NAYCHIKoko 暢嬌 黃天帶 黃華孫 華玉偉

摘 ?要：從橡膠樹葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶類黃酮3-羥化酶（F3H）基因序列信息，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到2個(gè)橡膠樹F3H基因，分別命名為HbF3H1和HbF3H2。通過(guò)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，只有HbF3H1基因在不同發(fā)育時(shí)期的橡膠樹葉片和嫩莖中的表達(dá)水平與花青素的合成積累趨勢(shì)完全一致。HbF3H1所編碼的蛋白屬于P450超家族，具有保守的F3H結(jié)構(gòu)域，而且HbF3H1基因的啟動(dòng)子中包含多種環(huán)境效應(yīng)元件，說(shuō)明HbF3H1基因的表達(dá)受環(huán)境因子調(diào)控。通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)HbF3H1基因的煙草花瓣大量累積花青素，其顏色較非轉(zhuǎn)基因煙草顯著加深，同時(shí)，熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)HbF3H1表達(dá)水平與轉(zhuǎn)基因煙草花瓣顏色呈正相關(guān)，說(shuō)明HbF3H1基因表達(dá)促進(jìn)花青素的累積。本研究為闡明橡膠樹花青素代謝途徑奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹;花青素;類黃酮3-羥化酶;轉(zhuǎn)基因煙草

中圖分類號(hào)：S794.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Based on the transcriptome database of rubber tree （Hevea brasiliensis） leaf tissues， we retrieved the nucleotide sequences of flavonoid 3-hydroxylase （F3H） gene， which is the key enzyme in anthocyanin biosynthesis pathways. Two rubber tree F3H genes， HbF3H1 and HbF3H2 were amplified by RT-PCR. The expression levels of the HbF3H genes were analyzed by quantitative real-time PCR and the expression of HbF3H1 were shown to be completely correlated with the anthocyanin contents in the deffirent developmental stage of leaves and stems. Amino acid sequence analysis results showed that HbF3H1 belonged to the super-family of cytochrome P450， and consisted of typical F3H conserved domains. In the promoter region of HbF3H1 gene， we observed multiple environment response elements， which revealed the possible role of HbF3H1 in environment stress resistance in rubber trees. HbF3H1 was over-expressed in tobacco （Nicotiana tabacum ‘Samsun NN） by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation for further functional verifications. Compared with the wild type control， the petals of transgenic tobacco lines exhibited enhanced red color pigmentation， which was positively correlated with the expression levels of HbF3H1. The results demonstrated that HbF3H1 played an important role in the biosynthesis of anthocyanin. The study would lay a foundation for understanding the anthocyanin biosynthesis pathways in rubber trees.

Keywords： rubber tree; anthocyanin; flavonoid 3-hydroxylase; transgenic tobacco

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.002

花青素屬類黃酮化合物，作為在植物中廣泛存在的水溶性天然色素，花青素的積累使花瓣和果實(shí)呈現(xiàn)多種顏色來(lái)吸引動(dòng)物進(jìn)行授粉和種子的傳播[1-2]。此外，花青素還具有多種重要的生理功能。在多種生物和非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程中，植物會(huì)大量合成花青素并儲(chǔ)存于液泡中[3]?；ㄇ嗨氐姆e累能夠減少昆蟲采食及病原菌侵染[4]。Hoch等[5]研究認(rèn)為，植物幼枝和幼苗葉片中含有大量合成積累的花青素而呈現(xiàn)紅色，主要是為了過(guò)濾部分可見光和紫外線，以降低過(guò)量光照對(duì)植物的脅迫作用。同時(shí)，花青素的抗氧化活性有助于清除紫外、干旱和鹽脅迫等過(guò)程中所產(chǎn)生的活性氧自由基，以減少植物細(xì)胞所受到的傷害，從而增強(qiáng)植物的抗性[6-8]。低溫冷凍處理誘導(dǎo)蕪菁花青素合成酶基因BrANS的表達(dá)，促進(jìn)花青素的合成積累以增強(qiáng)抗凍性[9]。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是重要工業(yè)原材料天然橡膠的主要來(lái)源，主要種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)。橡膠樹葉片的成熟需要12～20 d，分為古銅期、變色期、淡綠期和成熟期4個(gè)階段。橡膠樹易受多種環(huán)境脅迫的影響，同時(shí)也會(huì)合成積累大量花青素而使莖尖和嫩葉呈現(xiàn)古銅色[10-11]。通過(guò)分子生物學(xué)的方法研究橡膠樹中花青素合成相關(guān)基因，闡釋花青素積累的調(diào)控機(jī)制，對(duì)橡膠樹遺傳改良具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明橡膠樹MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠促進(jìn)花青素的合成積累[12]，然而橡膠樹中花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因卻并不明確。在植物中，類黃酮3-羥化酶（flavonoid 3-hydroxylase， F3H）是花青素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，在決定植物花色、種皮和莖葉著色等性狀方面發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)3H與F35H的比例決定著葡萄果實(shí)著色的程度[13]。F3H酶具有廣泛的底物特異性，可作用于山萘酚、芹菜素和柚皮素，催化這些中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)锽環(huán)-3，4-二羥基黃酮類化合物圣草酚、二氫槲皮素和槲皮素，從而使其具有更強(qiáng)的抗氧化活性[6， 14-16]。

本研究克隆得到2個(gè)橡膠樹F3H基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并分析2個(gè)基因在橡膠樹葉片和嫩莖中的表達(dá)模式。對(duì)HbF3H基因的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并通過(guò)轉(zhuǎn)化煙草驗(yàn)證其生理功能，從而為橡膠樹中花青素的合成調(diào)控和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

巴西橡膠樹‘熱研7-33-97種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國(guó)家橡膠樹種質(zhì)資源圃。取黑暗和正常光照條件下（光照強(qiáng)度3000 lx，周期12 h/d）橡膠樹的幼苗嫩莖及古銅期、淡綠期、變色期、穩(wěn)定期4個(gè)時(shí)期的葉片，用于橡膠樹F3H基因的克隆及表達(dá)分析。煙草（Nicotiana tabacum ‘Samsun NN）種子滅菌后，于MS培養(yǎng)基萌發(fā)（光照強(qiáng)度4000 lx，周期14 h/d），取8葉齡煙草葉片用于轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)。RNA提取試劑盒EasyPure RNA Kit、cDNA第一鏈的合成試劑盒TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix及熒光定量PCR試劑盒TransStart Green qPCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。植物基因組DNA抽提試劑盒Rapid Plant Genomic DNA Isolation Kit、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、凝膠回收試劑盒SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit及大腸桿菌感受態(tài)DH5-α購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。TA克隆載體pMD-19T、DNA聚合酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase和rTaq Premix購(gòu)于TaKaRa生物有限公司（日本）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?橡膠樹F3H基因及啟動(dòng)子片段的克隆 ?依據(jù)橡膠樹古銅期葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到2條橡膠樹F3H基因序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異性引物CDS-F3H1和CDS-F3H2，引物序列見表1。提取橡膠樹古銅期葉片總RNA，以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目標(biāo)基因片段。HbF3H1啟動(dòng)子的克隆，以橡膠樹葉片基因組DNA為模板，使用表1中的proHbF3H1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后獲得啟動(dòng)子片段。將獲得的目標(biāo)基因片段和啟動(dòng)子片段純化回收后通過(guò)TA克隆構(gòu)建到pMD 19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)重組單克隆測(cè)序獲得2個(gè)橡膠樹F3H基因全長(zhǎng)編碼框序列和HbF3H1上游啟動(dòng)子序列。

1.2.2 ?橡膠樹F3H基因在橡膠樹葉片和嫩莖中的表達(dá)分析 ?在橡膠樹中，以HbRH8作為熒光定量PCR的內(nèi)參基因[17]。使用橡膠樹古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期4個(gè)時(shí)期的葉片以及光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)橡膠樹的嫩莖cDNA為模板，使用表1中的定量PCR引物Q-HbF3H1和Q-HbF3H2，在Light Cycler 2.0熒光定量PCR儀（Roche公司）中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。熒光定量結(jié)果采用2-CT方法分析。

1.2.3 ?HbF3H1基因及其啟動(dòng)子的序列分析 ?通過(guò)NCBI/blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）對(duì)橡膠樹HbF3H1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源序列查找，同時(shí)預(yù)測(cè)其保守域。利用多序列比對(duì)軟件DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。通過(guò)Plant Care（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plant-care/html/）對(duì)HbF3H1基因啟動(dòng)子片段序列進(jìn)行分析。

1.2.4 ?煙草轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性株系的鑒定 ?使用Sal I和Sma I進(jìn)行雙酶切，將HbF3H1基因CDS構(gòu)建到pCAMBIA2301載體上，位于2×35S啟動(dòng)子下游，得到過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA2301-HbF3H1（圖1），轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中用于煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)。煙草的轉(zhuǎn)化參照Pattanaik等[18]的方法。農(nóng)桿菌侵染煙草葉盤后，共培養(yǎng)3 d，放置含有卡那霉素的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)和抗性篩選，每2周更換一次培養(yǎng)基，直至長(zhǎng)出幼苗。剪取幾片葉子進(jìn)行GUS染色分析。同時(shí)，提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組作為模板，使用表1中CDS-F3H1引物，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行PCR驗(yàn)證。以轉(zhuǎn)基因煙草的花瓣cDNA為模板，使用表1中Q-HbF3H1引物進(jìn)行熒光定量PCR，分析轉(zhuǎn)基因煙草花瓣中HbF3H1基因的表達(dá)水平。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?橡膠樹F3H基因的克隆

以橡膠樹總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，使用表1中F3H的基因克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2個(gè)與預(yù)期大小相一致的目的基因片段，分別將其命名為HbF3H1和HbF3H2（圖2）。測(cè)序得到該基因開放讀碼框核苷酸序列，HbF3H1長(zhǎng)度為1578 bp，編碼525個(gè)氨基酸;HbF3H2長(zhǎng)度為1566 bp，編碼521個(gè)氨基酸。

2.2 ?橡膠樹F3H基因的表達(dá)分析

橡膠樹葉片的發(fā)育分為古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期4個(gè)階段，在這個(gè)過(guò)程中，葉片顏色由紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，古銅期葉片花青素提取液較穩(wěn)定期的深，而光照培養(yǎng)體胚植株嫩莖花青素提取液較暗培養(yǎng)的深（圖3）。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中，已經(jīng)分別測(cè)定了橡膠樹古銅期和穩(wěn)定期葉片、黑暗和光照培養(yǎng)體胚植株嫩莖的花青素含量分別為361.0000、24.8095、40.3045、33.0793 μg/g，不同時(shí)期和組織的橡膠樹花青素含量測(cè)定說(shuō)明花青素含量與顏色的深淺呈正相關(guān)[19-20]。因此，為了探索橡膠樹F3H基因在花青素合成中的生理功能，本研究以克隆到的2個(gè)橡膠樹HbF3H基因序列為模板，設(shè)計(jì)熒光定量分析引物（表1），通過(guò)熒光定量PCR分析了橡膠樹葉片以及光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)橡膠樹幼苗嫩莖中F3H基因的表達(dá)情況。在橡膠樹中，從古銅期至穩(wěn)定期，隨著葉片紅色逐漸褪去，HbF3H1基因的表達(dá)量顯著下降（圖4）。暗培養(yǎng)條件下的橡膠樹幼苗嫩莖呈暗紅色，而光照培養(yǎng)條件下的幼苗嫩莖呈綠色，在暗培養(yǎng)條件下橡膠樹嫩莖中HbF3H1基因的表達(dá)水平顯著高于光照培養(yǎng)條件下的橡膠樹嫩莖（圖4）。結(jié)果表明HbF3H1基因在葉片和嫩莖中的表達(dá)水平與花青素的累積趨勢(shì)較為一致，因此，推斷HbF3H1基因?yàn)橄鹉z樹花青素合成中的關(guān)鍵因素，可用作后續(xù)的序列分析和功能驗(yàn)證。

2.3 ?HbF3H1基因啟動(dòng)子克隆和序列分析

根據(jù)橡膠樹基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)HbF3H1啟動(dòng)子擴(kuò)增引物proHbF3H1（表1），以橡膠樹葉片DNA為模板擴(kuò)增該基因上游啟動(dòng)子片段，通過(guò)測(cè)序獲得該上游啟動(dòng)子核苷酸序列長(zhǎng)2.5 kb（圖2）。

通過(guò)Plant Care分析HbF3H1基因啟動(dòng)子序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子片段中存在大量的光、溫度等環(huán)境響應(yīng)元件，這說(shuō)明HbF3H1基因的表達(dá)可能同樣受光照、溫度等多種環(huán)境因素的影響（表2）。

2.4 ?橡膠樹HbF3H蛋白序列比對(duì)分析

通過(guò)NCBI/blastp和多序列比對(duì)軟件DNAMAN對(duì)橡膠樹HbF3H1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源序列查找、比對(duì)。結(jié)果表明，橡膠樹HbF3H1蛋白屬于P450超家族（圖5A），其氨基酸序列與大豆、麻風(fēng)樹、木薯、葡萄和玉米的F3H蛋白具有較高的同源性，且均包含有類黃酮3-羥化酶所必需的膜錨定序列、底物選擇和結(jié)合位點(diǎn)及與血紅素結(jié)合位點(diǎn)（圖5B）。

2.5 ?HbF3H1基因在煙草中的功能驗(yàn)證

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，篩選抗卡那霉素?zé)煵葜晗?，然后取葉片進(jìn)行GUS染色及基因組PCR驗(yàn)證。轉(zhuǎn)基因煙草葉片GUS染色后變?yōu)樗{(lán)色（圖6A），基因組PCR擴(kuò)增得到HbF3H1基因目標(biāo)條帶，證實(shí)已成功獲得多個(gè)含HbF3H1基因的轉(zhuǎn)基因煙草株系（圖6B）。與野生煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草花瓣組織花色加深（圖7A），熒光定量PCR結(jié)果表明其花色深淺程度與HbF3H1基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖7B），初步確定橡膠樹HbF3H1基因的表達(dá)可促進(jìn)煙草花瓣中花青素的合成積累。

3 ?討論

花青素是植物中的一種重要次生代謝產(chǎn)物，主要積累在花、葉片和果實(shí)等器官中，使其呈現(xiàn)豐富多彩的顏色。此外，花青素還具有抗氧化、抗蟲、光保護(hù)和滲透調(diào)節(jié)等多種保護(hù)作用[21]。目前，在橡膠樹中已鑒定出一個(gè)調(diào)控花青素合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因HbAn1，在煙草中過(guò)表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子能夠上調(diào)花青素合成中多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)[12]。但在橡膠樹中的花青素合成相關(guān)酶的基因還未有詳細(xì)報(bào)道。本研究從橡膠樹中克隆得到2個(gè)類黃酮3-羥化酶基因，研究這2個(gè)基因的表達(dá)模式，并進(jìn)一步對(duì)HbF3H1基因進(jìn)行了序列分析以及在煙草中的功能驗(yàn)證。不同時(shí)期橡膠樹葉片以及光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)橡膠樹嫩莖中的表達(dá)分析表明，HbF3H1基因的表達(dá)水平與花青素積累趨勢(shì)較為一致。通過(guò)轉(zhuǎn)化煙草發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)HbF3H1能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草花瓣中花青素的合成積累而使顏色加深。這證實(shí)了HbF3H1基因參與橡膠樹花青素合成的生理功能。

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，橡膠樹HbF3H1基因?qū)儆谥参镏袕V泛存在的細(xì)胞色素P450超家族。P450超家族蛋白具有廣泛的催化活性，主要參與多種代謝途徑的生物合成以及催化外源化合物，如除草劑、殺蟲劑、污染物等轉(zhuǎn)變?yōu)榉嵌拘援a(chǎn)物[22]。通過(guò)分析橡膠樹HbF3H1基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)除了包含大量的光效應(yīng)元件外，還有缺氧響應(yīng)元件GC-motif和ARE、低溫響應(yīng)元件LTR和多個(gè)熱應(yīng)答元件HSE等多種逆境脅迫應(yīng)答元件，這表明HbF3H1基因可能參與橡膠樹非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。Toda等[23]發(fā)現(xiàn)，低溫能夠促進(jìn)大豆F3H1基因的表達(dá)。在水稻中，OsF3H基因的表達(dá)受到光照的誘導(dǎo)[24]。最近研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理能夠明顯上調(diào)蠟梅CpF3'H基因的表達(dá)[25]。杭菊CmF3'H基因的表達(dá)對(duì)淹水脅迫有明顯的響應(yīng)[26]。在植物響應(yīng)逆境脅迫的過(guò)程中，F(xiàn)3H酶催化花青素合成途徑中的中間產(chǎn)物，使其具有更強(qiáng)的抗氧化活性，從而高效的清除紫外光等一系列逆境脅迫條件下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧（ROS），減少細(xì)胞所受到的傷害，增強(qiáng)抵抗環(huán)境脅迫的能力[7-8]。

因此，研究橡膠樹中花青素的代謝途徑以及脅迫條件下的合成調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)于推動(dòng)橡膠樹抗逆分子育種有著重要的意義。同時(shí)，花青素作為植物中重要的成色物質(zhì)，將其作為遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)活體監(jiān)測(cè)，具有簡(jiǎn)單便捷、檢測(cè)成本低廉等特點(diǎn)[27-30]。本研究為橡膠樹抗逆轉(zhuǎn)基因育種提供潛在的基因資源，也為橡膠樹轉(zhuǎn)基因高效可視化篩選奠定基礎(chǔ)。

4 ?結(jié)論

本研究在橡膠樹基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的基礎(chǔ)上，克隆得到2個(gè)橡膠樹HbF3H基因。在不同時(shí)期橡膠樹葉片以及光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)嫩莖中，HbF3H1基因的表達(dá)水平與花青素累積完全一致。HbF3H1基因所編碼的氨基酸及其啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)，HbF3H1蛋白具有保守的F3H結(jié)構(gòu)域，其啟動(dòng)子序列中包含多種環(huán)境效應(yīng)元件，說(shuō)明HbF3H1基因可能參與橡膠樹對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。在煙草中過(guò)表達(dá)HbF3H1基因能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草花瓣中的花青素含量，使其花色明顯加深。這些結(jié)果證明了HbF3H1基因能夠參與橡膠樹花青素合成的生理功能。

參考文獻(xiàn)

[1] Li P， Chen B， Zhang G， et al. Regulation of anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis by medicago truncatula bhlh transcription factor mttt8 [J]. New Phytologist， 2016， 210（3）： 905-921.

[2] Singh R， Low E T L， Ooi C L， et al. The oil palm virescens gene controls fruit colour and encodes a r2r3-myb[J]. Nature Communications， 2014， 5： 4106.

[3] Dixon R A， Paiva N L. Stress-induced phenylpropanoid metabolism [J]. Plant Cell， 1995， 7（7）： 1085-1097.

[4] Karageorgou P， Manetas Y. The importance of being red when young： Anthocyanins and the protection of young leaves of Quercus coccifera from insect herbivory and excess light [J]. Tree Physiology， 2006， 26（5）： 613-621.

[5] Hoch W A， Zeldin E L， Mccown B H. Physiological significance of anthocyanins during autumnal leaf senescence [J]. Tree Physiology， 2001， 21（1）： 1-8.

[6] Nakabayashi R， Yonekurasakakibara K， Urano K， et al. Enhancement of oxidative and drought tolerance in Arabidopsis by overaccumulation of antioxidant flavonoids [J]. Plant Journal， 2014， 77（3）： 367-379.

[7] Pollastri S， Tattini M. Flavonols： Old compounds for old roles [J]. Annals of Botany， 2011， 108（7）： 1225-1233.

[8] Pollastri S. Flavonoids as antioxidants in plants： Location and functional significance [J]. Plant Science， 2012， 196（3）： 67-76.

[9] Ahmed N U， Park J I， Jung H J， et al. Anthocyanin biosynthesis for cold and freezing stress tolerance and desirable color in Brassica rapa [J]. Functional & Integrative Genomics， 2015， 15（4）： 383-394.

[10] Fang Y， Mei H， Zhou B， et al. De novo transcriptome analysis reveals distinct defense mechanisms by young and mature leaves of Hevea brasiliensis （para rubber tree）[J]. Scientific reports， 2016， 6： 33151.

[11] 陳 ?濤， 暢 ?姣， 黃天帶， 等. 橡膠樹體細(xì)胞胚花青素HPLC分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2015， 34（12）： 2774-2778.

[12] 黃天帶， 方永軍， 暢 ?姣， 等. 橡膠樹花青素合成調(diào)控因子HbAn1的克隆及其功能分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2017， 38（12）： 2285-2293.

[13] Castellarin S D， Gaspero G D， Marconi R， et al. Colour variation in red grapevines （Vitis vinifera L.）： Genomic organisation， expression of flavonoid 3'-hydroxylase， flavonoid 3'，5'-hydroxylase genes and related metabolite profiling of red cyanidin-/blue delphinidin-based anthocyanins in berry skin[J]. BMC Genomics， 2006， 7（1）： 12.

[14] Pratt D E. Role of flavones and related compounds in retarding lipid—oxidative flavor changes in foods[M]. America： ACS Publications， 1976.

[15] Kyoko T， Haruko K， Kalaiselvi S， et al. The soybean f3'h protein is localized to the tonoplast in the seed coat hilum [J]. Planta， 2012， 236（1）： 79-89.

[16] Castellarin S D， Matthews M A， Gaspero G D G， et al. Water deficits accelerate ripening and induce changes in gene expression regulating flavonoid biosynthesis in grape berries[J]. Planta， 2007， 227（1）： 101-112.

[17] Putranto R A， Leclercq J， Montoro P. Evaluation of eleven reference genes for reverse transcriptase quantitative pcr of rubber tree under water deficit[J]. Menara Perkebunan， 2016， 83（2）： 86-94.

[18] Pattanaik S， Xie C H， Ling Y. The interaction domains of the plant Myc-like bHLH transcription factors can regulate the transactivation strength[J]. Planta， 2008， 227（3）： 707-715.

[19] 陳 ?濤. 橡膠樹花青素合成分子機(jī)制的初步研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2016.

[20] 陳 ?濤， 暢 ?姣， 黃天帶， 等. 橡膠樹體細(xì)胞胚花青素HPLC分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2015， 34（12）： 2774-2778.

[21] 張佩佩， 張 ?亮， 鄭鳳霞， 等. 植物葉片中花青素的積累規(guī)律及生物學(xué)作用 [J]. 北方園藝， 2014（20）： 188-192.

[22] 賀麗虹， 趙淑娟， 胡之璧. 植物細(xì)胞色素P450基因與功能研究進(jìn)展[J]. 藥物生物技術(shù)， 2008， 15（2）： 142-147.

[23] Toda K， Takahashi R， Iwashina T， et al. Difference in chilling-induced flavonoid profiles， antioxidant activity and chilling tolerance between soybean near-isogenic lines for the pubescence color gene[J]. Journal of Plant Research， 2011， 124（1）： 173-182.

[24] Shih C H， Chu H， Tang L K， et al. Functional characterization of key structural genes in rice flavonoid biosynthesis[J]. Planta， 2008， 228（6）： 1043-1054.

[25] 俞美麗. 蠟梅類黃酮3'-羥化酶基因（CpF3'H）及其啟動(dòng)子功能初探[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.

[26] 鄒慶軍， 汪 ?濤， 郭巧生， 等. 淹水脅迫對(duì)杭菊F3'H基因表達(dá)及其下游產(chǎn)物含量的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2018， 43（1）： 52-57.

[27] 靳 ?京. 利用Lyr基因建立大豆安全篩選標(biāo)記體系的研究[D]. 長(zhǎng)春： 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

[28] 李 ?軍， 李 ?白. 水稻氮高效利用基因NRT1.1B InDel分子標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用[J]. 分子植物育種， 2016， 14（12）： 3405-3413.

[29] 陳 ?彪， 陳 ?銘， 李洋洋， 等. 煙草糖酯SSR分子標(biāo)記篩選及輔助育種應(yīng)用[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)， 2019， 40（3）： 8-15.

[30] 姜 ?穎， 馮乃杰， 王曉楠， 等. 工業(yè)大麻雄性相關(guān)RAPD和SCAR標(biāo)記的篩選與鑒定[J]. 作物雜志， 2019（3）： 66-72.