冷卻治療對勞力性熱射病大鼠腎臟AQP2 mRNA及蛋白表達的影響

劉秀珍 曹春梅 張冰 劉靜民

1 清華大學(xué)體育部（北京100084）

2 巢湖學(xué)院體育學(xué)院（合肥238000）

勞力性熱射?。╡xertional heat stroke，EHS）是一種危及生命的疾病，臨床上表現(xiàn)為核心溫度迅速升高超過40.5℃，伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常及包括急性腎損傷在內(nèi)的多器官功能障礙[1]。它對運動員生命安全造成極大的挑戰(zhàn)，是馬拉松等耐力運動員最常見的猝死原因[2]。勞力性熱射病病情進展迅速，如果在30分鐘內(nèi)沒有迅速得到降溫處理，并發(fā)多器官功能障礙及導(dǎo)致死亡的機率會顯著增加[3]。因此，熱射病發(fā)作后，進行快速冷卻治療是確保熱射病患者存活的重要手段[4]。Wohlfert 等的研究表明，冷水浸泡（cold water immersion，CWI）是降低熱射病患者核心溫度最快速的方法，可以使患者的存活率提升到接近100%[5]。

熱射病病理生理學(xué)機制涉及熱損傷、胃腸道炎癥變化、凝血功能異常、水鹽代謝失衡等方面，其中腎臟水鹽代謝失衡與體溫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。目前國內(nèi)外針對熱射病的研究主要集中在熱損傷、胃腸道炎癥變化、凝血功能異常等方面，有關(guān)腎臟水鹽代謝及熱休克反應(yīng)的研究很少。杜名的研究認為腎臟水通道蛋白與人類正常生理活動及多種疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分，對水通道蛋白理論進行研究具有巨大的發(fā)展?jié)摿6]。但是，迄今為止，國內(nèi)尚無冷卻治療對熱射病患者腎臟水鹽代謝調(diào)節(jié)方面的直接探索，冷卻治療在降溫過程中，是否通過改變腎臟水通道蛋白（AQP2）的合成來改善水代謝，進而通過抗脫水途徑恢復(fù)下丘腦體溫調(diào)控作用并促進熱射病病情轉(zhuǎn)歸的病理生理學(xué)機制需要進一步研究。因此，本研究針對勞力性熱射病大鼠冷卻治療期間腎臟水通道蛋白基因轉(zhuǎn)錄中AQP2 mRNA及蛋白表達的變化進行研究，明確水通道蛋白在熱射病水代謝穩(wěn)態(tài)中的作用，為今后研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

實驗選用51 只7 周齡雄性Sprague-Dawley 大鼠，體重230～270 g，由北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[SCXK（京）2016-0011]。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水攝食，室溫20℃～25℃，濕度45%～50%，光照比12 h∶12 h。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 天，隨機分為6 組，常溫對照組（C，n=8）、高溫運動即刻組（E，n=9）、高溫運動休息1組（ER1，n=9）、高溫運動冷浸1組（EC1，n=8）、高溫運動休息2 組（ER2，n=9）和高溫運動冷浸2 組（EC2，n=8）。

1.2 勞力性熱射病大鼠模型建立與冷卻治療

1.2.1 適應(yīng)性訓(xùn)練

參加高溫運動的大鼠在常溫下飼養(yǎng)，并在常溫下進行為期5天的適應(yīng)性訓(xùn)練。適應(yīng)性訓(xùn)練跑臺坡度為0。開始運動速度為18 m∕min，每天遞增2 m∕min，最后達到26 m∕min；開始運動時間30 min，每天遞增10 min，最后達到60 min。適應(yīng)性訓(xùn)練安排見表1。

表1 大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練安排

1.2.2 勞力性熱射病大鼠模型建立

適應(yīng)性訓(xùn)練后休息3 天，在環(huán)境密閉的高溫高濕實驗室進行一次性高溫力竭運動建立勞力性熱射病大鼠模型。高溫高濕實驗室溫度控制為36℃± 1℃，濕度控制為75% ± 5%。依據(jù)Bedford 最大攝氧量表[7]及高溫運動大鼠預(yù)實驗，確定大鼠高溫運動時跑臺坡度為5°，速度為28 m∕min，相當于60%～80%最大攝氧量的運動強度。依據(jù)（1）至（4）確定大鼠進行高溫運動至力竭并使直腸溫度上升到約42℃時為勞力性熱射病建模成功：（1）Bouchama 等經(jīng)典型熱射病狒狒模型[8]；（2）Lam 等經(jīng)典型熱射病大鼠模型[9]；（3）Chang 等高溫運動至力竭誘導(dǎo)勞力性熱射病大鼠模型[10]；（4）勞力性熱射病經(jīng)常在長時間耐力性運動（馬拉松、越野賽及自行車公路賽等）中體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)不堪重負時發(fā)生，在力竭或完賽的情況下發(fā)生率更高[11，12]。大鼠力竭標準為不能維持預(yù)定運動強度，在跑臺后擋板滯留時，使用聲、電刺激及毛刷連續(xù)驅(qū)趕3 次無效。采用北京搏貝科技有限公司JNT-200型鼠肛溫計測量高溫運動前及高溫運動至力竭后大鼠直腸溫度。測量方法為：將溫度計探頭插入大鼠直腸6.5 cm，固定探頭，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值。

1.2.3 冷水浸泡實驗

依據(jù)（1）至（3）建立大鼠冷水浸泡方案：（1）McDermott等[13]治療熱射病常用冷卻方式的冷卻速率；（2）Riana 等[14]海軍陸戰(zhàn)隊馬拉松運動員勞力性熱射病快速冷卻流程；（3）Stewart 等[15]勞力性熱射病患者冷卻案例設(shè)定大鼠冷水浸泡預(yù)實驗。冷水浸泡預(yù)實驗選取19只EHS 大鼠，8 只死亡，11 只存活。結(jié)果如下：2 只2℃冰水浸泡4 s 的大鼠死亡；2 只9℃冷水浸泡10 min 的大鼠死亡；1 只19℃冷水浸泡10 min 的大鼠死亡；4 只2℃冰水浸泡2 s的大鼠，2只死亡，另2只存活；4只9℃冷水浸泡5 min的大鼠，1只死亡，3只存活；6只19℃冷水浸泡5 min的大鼠全部存活。為了確保EHS大鼠冷水浸泡實驗的安全有效性，最終將本實驗冷水浸泡溫度設(shè)定為19℃，實際溫度為18℃～20℃；冷水浸泡時間設(shè)定為5 min。大鼠休息溫度設(shè)定為室溫20℃，實際溫度為19℃～21℃。

在高溫運動至力竭后，ER1 組大鼠常溫休息5 min；EC1 組大鼠冷浸5 min；ER2 組大鼠常溫休息65 min（5 min＋60 min）；EC2 組大鼠冷浸5 min，常溫休息60 min。冷浸或常溫休息5 min 后，及常溫休息60 min 后立即測量大鼠直腸溫度。冷卻速率用大鼠冷浸或休息5 min 期間單位時間內(nèi)體溫的減少量來表示，其計算公式為:

1.3 取材及處理

高溫運動即刻組在高運動后即刻取材，常溫對照組與高溫運動即刻組同時取材。高溫運動后，高溫運動休息1 組、高溫運動冷浸1 組、高溫運動休息2 組和高溫運動冷浸2組在完成相應(yīng)的休息或冷浸實驗后取材。采用10%水合氯醛按照0.32 ml∕100 g體重的劑量對大鼠進行腹腔麻醉。冰上解剖大鼠，選取腹主動脈取血；摘取腎臟放入液氮中迅速冷凍及凍存。

1.4 指標與測試方法

1.4.1 紅細胞壓積和血紅蛋白

采用日本光電工業(yè)株式會社全自動血細胞分析儀（MEK-7222K，Japan）測試血常規(guī)，選取紅細胞壓積（hematocrit，Hct）和血紅蛋白（hemoglobin，Hb）進行研究。相關(guān)試劑由上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司提供。

1.4.2 腎臟水通道蛋白AQP2 mRNA表達

采用熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)測試腎臟AQP2 mRNA 表達。取適量腎臟放入液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP 管中；用Trizol（美國Invitrogen 公司）試劑抽提總RNA；用DNaseI 消化樣品RNA 中的DNA；RNA 瓊脂糖凝膠電泳；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA；加入依據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫相關(guān)基因序列設(shè)計的特異性引物（見表3），加入EvaGreen 核酸染料Mix，以cDNA 為模板，在實時熒光定量PCR 儀（Roche LightCycler?480II）中進行Real Time-PCR 檢測。分析產(chǎn)物溶解曲線并驗證目標基因AQP2 和內(nèi)參基因GAPDH 的擴增效率是否接近100%；根據(jù)各反應(yīng)孔的目標基因與內(nèi)參基因的△CT值，運用2-△△CT相對定量法計算目標基因AQP2 的相對表達量。

1.4.3 腎臟水通道蛋白AQP2蛋白表達

表2 實時熒光定量PCR引物信息

（1）蛋白抽提：預(yù)冷RIPA 蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑（cocktail）；4℃離心（12000 rpm×15 min）。取上清液。（2）BCA法蛋白定量：按照BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀）使用說明操作，測定蛋白濃度。（3）Western Blot實驗：取待檢測蛋白樣品進行電泳分離（濃縮膠恒壓電泳：90 V，約20 min；分離膠恒壓150 V，通過預(yù)染蛋白marker 來確定電泳停止時間）。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，100 V 恒壓，60 min。將膜浸沒于5%BSA-TBST 中，水平搖床孵育1 h（RT）。一抗孵育：5%BSA-TBST 稀釋一抗（AQP2，1∶500；GAPDH，1∶1000，Abcam公司），4℃水平搖床孵育過夜。次日，TBST洗膜：3×10min。二抗孵育：5%BSATBST 稀釋二抗（山羊抗兔IgG（H+L），HRP，1∶10000，Abcam公司），室溫孵育1 h。TBST洗膜：3×10 min。將ECL發(fā)光液滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3～5 min。膠片曝光：10 s～5 min，顯影2 min，定影。（4）計算結(jié)果：采用Image J軟件計算蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均值± 標準差（±s）表示。采用非參數(shù)檢驗（獨立樣本Mann-Whitney U檢驗）進行組間比較。采用非參數(shù)檢驗（相關(guān)樣本W(wǎng)ilcoxon 帶符號秩檢驗）對高溫運動各組大鼠運動前與運動后直腸溫度進行組內(nèi)比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重與運動時間

高溫運動實驗前，各組大鼠體重無顯著性差異（P＞0.05），見圖1A。進行高溫運動實驗的5組大鼠運動時間無顯著性差異（P＞0.05），見圖1B。

2.2 大鼠體溫及冷卻速率

表3顯示，在高溫運動實驗前，與C組相比，E組大鼠體溫顯著升高（P＜0.05）；但是進行高溫運動實驗的5組大鼠體溫相互間無顯著性差異（P＞0.05），提示適應(yīng)性訓(xùn)練也會引起大鼠體溫上升。

與運動前相比，E組、EC2組、ER1組與ER2組大鼠體溫在高溫運動后升高（P＜0.05，P＜0.01）；EC1 組大鼠運動后體溫升高，但無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠的體重與運動時間

冷浸5 min 后，與ER1 組相比，EC1 組大鼠體溫降低（P＜0.01）；與ER2 組相比，冷浸5 min 后的EC2 組大鼠體溫降低（P＜0.01），休息60 min 后的EC2 組大鼠體溫降低（P＜0.05）。與ER1 組相比，EC1 組大鼠冷卻速率降低（P＜0.01）；與ER2 組相比，EC2 組大鼠冷卻速率降低（P＜0.01）。參加冷浸的EC1組和EC2組大鼠冷卻速率無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 大鼠紅細胞壓積與血紅蛋白

對各組大鼠的紅細胞壓積與血紅蛋白進行分析，見表4。結(jié)果顯示，與C組相比，E組大鼠紅細胞壓積升高（P＜0.05），血紅蛋白雖有升高，但無顯著性差異（P＞0.05）；與E組相比，ER1組、EC1組、ER2組、EC2組大鼠紅細胞壓積及血紅蛋白均無顯著性差異（P＞0.05）；與ER1 組相比，EC1 組大鼠紅細胞壓積及血紅蛋白均無顯著性差異（P＞0.05）；與ER2 組相比，EC2 組大鼠紅細胞壓積及血紅蛋白均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 大鼠腎臟AQP2 mRNA表達

RNA 電泳圖顯示：提取的總RNA，經(jīng)甲醛變性膠電泳觀察，28S、18S、5S 三條帶清晰易辨，可以證實RNA 的完整性，樣品未發(fā)生降解，可以用于下游實驗，見圖2A。PCR 引物檢測電泳圖顯示：根據(jù)電泳圖中RNA 分子量標準，判斷擴增產(chǎn)物長度大小與設(shè)計相符合；同時將擴增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果證實引物擴增序列與目的基因匹配；說明引物可以用于熒光定量實驗，見圖2B。PCR 擴增曲線是樣品PCR 反應(yīng)實時熒光信號強度的反映，呈S 型，復(fù)孔的CT 值接近一致；反應(yīng)完成后儀器會根據(jù)擴增曲線給出樣品反應(yīng)的CT值，用于相對表達量的計算，見圖2C。PCR溶解曲線呈單峰，可以判斷擴增產(chǎn)物單一，說明擴增產(chǎn)物的特異性，實驗結(jié)果正?？捎?，見圖2D。

表3 各組大鼠的體溫(℃)及冷卻速率（℃∕min）

表4 各組大鼠的紅細胞壓積與血紅蛋白

與C 組相比，E 組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達升高（P＜0.01）；與E組相比，常溫休息ER1組和ER2組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達無顯著性差異（P＞0.05），經(jīng)過冷浸的EC1 組和EC2 組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達降低（P＜0.01）；與休息ER1 組相比，冷浸EC1 組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達降低（P＜0.01）；與ER2 組相比，EC2 組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達降低（P＜0.05），見圖2E。

圖2 RNA電泳和PCR結(jié)果

2.5 大鼠腎臟AQP2蛋白表達

圖3顯示，與C組相比，E組大鼠腎臟AQP2蛋白表達升高（P＜0.01）；與E 組相比，常溫休息ER1 組和ER2組大鼠腎臟AQP2蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05），經(jīng)過冷浸的EC1 組和EC2 組大鼠腎臟AQP2 蛋白表達降低（P＜0.05）；與ER1 組相比，EC1 組大鼠腎臟AQP2 蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）；與ER2 組相比，EC2 組大鼠腎臟AQP2蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 Western Blot結(jié)果

3 討論

3.1 大鼠體溫變化

熱射病動物模型分為兩大類：（1）在高溫環(huán)境下進行熱暴露建立的熱射病動物模型稱為經(jīng)典型熱射病動物模型；（2）在高溫環(huán)境下進行熱運動建立的熱射病動物模型稱為勞力性熱射病動物模型。

在實驗室勞力性熱射病動物模型的研究中，Zhang等以45℃高溫環(huán)境下熱運動至力竭作為熱射病診斷標準，建立了勞力性熱射病大鼠模型，用于研究紅景天苷對線粒體的保護作用，大鼠在建模前并未進行適應(yīng)性訓(xùn)練[16]。為了研究勞力性與經(jīng)典型熱射病大鼠模型體溫調(diào)節(jié)差異及預(yù)后特征，帥軍等安排大鼠在39℃高溫環(huán)境中運動，并以核心溫度升高到42℃作為熱射病診斷標準，建立了勞力性熱射病大鼠模型，所有大鼠均進行6 天適應(yīng)性遞增負荷跑臺訓(xùn)練后再進行分組，適應(yīng)性訓(xùn)練是否會引起大鼠體溫變化未見報道[17]。

與前人的研究結(jié)果有所不同，本研究中的常溫對照組未進行適應(yīng)性訓(xùn)練，但是5 個高溫運動組均進行了適應(yīng)性訓(xùn)練，實驗結(jié)果提示適應(yīng)性訓(xùn)練也會引起大鼠體溫上升。本研究中，在36℃高溫環(huán)境下熱運動至力竭的5組大鼠在運動后體溫均上升到42.0℃左右，符合勞力性熱射病大鼠建模標準，說明勞力性熱射病大鼠建模成功。

快速降溫是熱射病救治的關(guān)鍵。McDermott 等的研究認為，在諸多降溫措施中，冷水浸泡的冷卻速率最快，研究發(fā)現(xiàn)2℃冷水浸泡時冷卻速率是0.35℃∕min，8℃和20℃冷水浸泡時冷卻速率均為0.19℃∕min。另外一些冷卻策略，如冷卻水霧噴灑、冷卻液體靜脈注射、冰敷外周動脈等，由于冷卻速率過低而不建議采用[13]。在冷卻治療時間的設(shè)置上，Stewart 等的研究認為勞力性熱射病患者通常具有41.0℃～43.5℃的核心體溫以及38.9℃的冷卻終止點體溫，依據(jù)每5 min 降低1℃的冷卻速率，提出冷水浸泡15 min或者提供合理的冷卻終止點進行冷卻治療[15]。冷水浸泡時的冷卻速率存在運動項目差異。Godek等的研究表明，越野賽運動員在10℃冷水浸泡時的冷卻速率為0.255℃∕min，核心溫度從39.5℃降到37.5℃僅需要7.7 min；足球運動員的冷卻速率0.156℃∕min，核心溫度從39.5℃降到37.5℃需要11.4 min[18]。本研究中兩組大鼠冷水浸泡時冷卻速率分別為1.15℃∕min 和1.10℃∕min，比人體降溫速率更快。兩組大鼠冷浸5 min 后體溫均降到低于運動前體溫，說明冷浸5 min 對勞力性熱射病大鼠體溫已產(chǎn)生顯著影響。與人體相比，大鼠在冷浸時的冷卻速率更快，冷浸時間更短，提示物種或體重差異可能會產(chǎn)生不同的熱調(diào)節(jié)反應(yīng)。

3.2 大鼠血液濃縮程度

血常規(guī)檢查中紅細胞壓積和血紅蛋白是反映血液濃縮程度的重要指標。劇烈運動時大量出汗會引起機體脫水，血液濃縮，紅細胞壓積和血紅蛋白升高。全軍重癥醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會于2015年制定熱射病規(guī)范化診斷與治療專家共識（草案），提出勞力性熱射病發(fā)病早期因脫水致血液濃縮可出現(xiàn)血紅蛋白（Hb）升高、紅細胞壓積（Hct）增加、血小板（PLT）發(fā)病初期正常繼而迅速下降等血常規(guī)異常癥狀[19]。與前人的研究相一致，本研究中E組大鼠紅細胞壓積顯著高于C組大鼠，說明大鼠進行高溫運動確實會因為脫水而引起機體血液濃縮。與C 組大鼠相比，E 組大鼠血紅蛋白濃度雖然升高，但差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義，提示血紅蛋白在反映血液濃縮程度方面不夠敏感或可能存在滯后現(xiàn)象。本研究中，E組大鼠紅細胞壓積顯著性升高，提示紅細胞壓積是血液濃縮程度的敏感指標，可作為勞力性熱射病發(fā)病的病理生理學(xué)標志物。

在針對勞力性熱射病從運動現(xiàn)場到急診部的處理流程中，Riana提出在運動現(xiàn)場進行冷水浸泡是熱射病患者救治的首選方案；隨后應(yīng)進行實驗室檢測，包括鈉（Na）、鉀（K）、氯（Cl）、葡萄糖（Gluc）、肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）和紅細胞壓積（Hct）等；治療脫水、低血糖和低鈉血癥等[14]。關(guān)于冷卻對血液濃縮程度影響的研究鮮有報道。在研究大鼠血液粘度對溫度的依賴性時，Lipina等發(fā)現(xiàn)冷卻會使大鼠血液濃縮，紅細胞壓積升高[20]。與Lipina等的研究有所不同，本研究中冷浸雖然引起大鼠紅細胞壓積及血紅蛋白下降，但并未發(fā)生顯著性變化，提示紅細胞壓積和血紅蛋白對冷水浸泡帶來的溫度變化不夠敏感或可能存在滯后現(xiàn)象。引起紅細胞壓積改變的根本原因是脫水，而不是溫度。冷浸對紅細胞壓積沒有明顯影響，其原因可能是冷卻速率過快及冷浸時間較短（只有5 min），以至于機體的生化過程來不及作出反應(yīng)，未能明顯加重脫水（利尿途徑）或緩解脫水（抗利尿途徑），因而未能引起紅細胞壓積發(fā)生顯著性變化。

3.3 勞力性熱射病大鼠冷卻治療中水通道蛋白調(diào)節(jié)機制探討

Hasegawa 等的研究發(fā)現(xiàn)，運動時水分丟失是引起體溫升高的重要因素[21]。機體水代謝主要在腎臟由水通道蛋白進行調(diào)控。AQPs 是一類具有跨膜水轉(zhuǎn)運功能的蛋白質(zhì)家族。目前在腎臟組織共發(fā)現(xiàn)了8 種AQPs，其中AQP1-4 在調(diào)節(jié)水轉(zhuǎn)運中起關(guān)鍵作用[22]。AQP2主要分布于集合管頂端質(zhì)膜，是響應(yīng)抗利尿激素（亦稱精氨酸加壓素，AVP）調(diào)節(jié)集合管對水通透性的主要靶分子，在維持水平衡中起重要作用。

為了探索高溫環(huán)境下力竭運動對大鼠腎臟水通道蛋白AQP2 的影響，董柔等進行了相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)在38℃環(huán)境下以20 m∕min 的速度運動至力竭的大鼠AQP2 mRNA 表達非常顯著性上調(diào)，AQP2 蛋白表達上調(diào)，但未引起顯著性變化。該研究認為高溫力竭運動可通過上調(diào)AQP2 mRNA 表達增強腎臟對水的重吸收，AQP2蛋白表達上調(diào)不顯著，可能與AQP2蛋白表達滯后于AQP2 mRNA 表達有關(guān)[23]。但該研究并未涉及熱射病對AQP2 mRNA表達及AQP2蛋白表達的影響。

水通道蛋白與人類健康密不可分，是疾病的特殊標志物。據(jù)報道，在包括心力衰竭和肝硬化在內(nèi)的各種水排泄受損的疾病中，AQP2 在腎臟的含量會改變，AQP2的尿排泄增加[24]。熱射病實驗室檢查中，有關(guān)水通道蛋白的研究并不常見。Du 等研究了熱射病尸檢人腦標本中大腦皮層基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、緊 密 連 接 蛋 白（claudin5，CLDN5）、封閉蛋白（occludin，OCLN）、閉鎖小帶蛋白（zona occludens protein-1，ZO1）和水通道蛋白（aquaporins，AQPs）表達增加與熱射病腦水腫的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)熱射病患者MMP9 mRNA、OCLN mRNA、ZO1 mRNA、CLDN5 mRNA、AQP4 mRNA顯著性升高，且與腦含水量增加呈正相關(guān)，但并未進行AQP2的研究[25]。

水通道蛋白調(diào)節(jié)機體水代謝。熱射病誘導(dǎo)的腸道通透性改變可能與水通道蛋白對機體水代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)。Wang 等研究了包括AQP2 在內(nèi)的10 種水通道蛋白在熱射病大鼠小腸組織中不同恢復(fù)時間點的表達情況，發(fā)現(xiàn)熱射病發(fā)作時AQP7、AQP8 和AQP11 mRNA表達顯著性上調(diào)，熱射病后恢復(fù)1小時AQP1、AQP3和AQP5 mRNA表達顯著下調(diào)，提出熱射病誘導(dǎo)小腸損傷和細胞凋亡與AQPs 上調(diào)∕下調(diào)時水轉(zhuǎn)運改變密切相關(guān)，但此研究中并未在小腸檢測到包括AQP2、AQP4、AQP6和AQP9在內(nèi)的4支基因的mRNA表達[26]。

與前人的研究有所不同，本研究主要聚焦在腎臟集合管水代謝。本研究中熱射病大鼠（E組）與常溫對照組（C 組）相比，水通道蛋白AQP2 mRNA 表達和AQP2蛋白表達均出現(xiàn)上調(diào)（P＜0.01），說明高溫運動引起勞力性熱射病的同時導(dǎo)致AQP2合成顯著性增加，機體對水分的重吸收增強，以對抗機體的脫水情況。提示AQP2 mRNA 表達和AQP2 蛋白表達是勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標，可作為勞力性熱射病發(fā)病的病理生理學(xué)標志物。

有關(guān)低溫對水通道蛋白影響的研究很少報道。水通道蛋白調(diào)節(jié)細胞質(zhì)膜間微妙的滲透平衡，滲透損傷是冷凍過程中引起細胞死亡的主要因素。水通道蛋白AQP2 上調(diào)和轉(zhuǎn)運會減輕低溫冷藏過程中冷誘導(dǎo)滲透損傷。Wang 等的研究表明，在冷凍前用抗利尿激素（AVP）處理大鼠腎髓質(zhì)集合管（inner medullar collecting duct，IMCD）細胞，使集合管細胞外質(zhì)膜上的AQP2 含量增加，可以減弱冷誘導(dǎo)（－4℃）引起的大鼠腎髓質(zhì)集合管細胞滲透損傷[27]。本研究中，經(jīng)過冷浸的EC1 組和EC2 組大鼠與E 組大鼠相比，腎臟AQP2 mRNA 表達非常顯著性下調(diào)；AQP2 蛋白表達顯著下調(diào)。EC1組大鼠與ER1組大鼠相比，腎臟AQP2 mRNA表達非常顯著性下調(diào)；AQP2 蛋白表達無顯著性差異。EC2組大鼠與ER2組大鼠相比，腎臟AQP2 mRNA表達顯著性下調(diào)；AQP2蛋白表達無顯著性差異。這種現(xiàn)象說明冷浸對腎臟AQP2 mRNA 表達的影響最顯著，對AQP2蛋白表達的影響次之；進一步證明冷浸影響腎臟水通道蛋白的合成，且這種影響符合從腎臟AQP2 mRNA表達到AQP2蛋白表達的逐級滯后的合成順序；腎臟AQP2 mRNA 表達和AQP2 蛋白表達對冷浸帶來的溫度變化敏感，其機制可能與AQP2在低溫下通過抑制抗脫水機制重建自身體溫調(diào)節(jié)有關(guān)，有待進一步的研究進行證明。

4 結(jié)論

冷浸可以有效降低熱射病大鼠機體核心溫度；冷浸誘導(dǎo)水通道蛋白AQP2 mRNA 表達及AQP2 蛋白表達顯著性下調(diào)，導(dǎo)致水通道蛋白在腎臟的合成減弱；冷浸對紅細胞壓積Hct及血紅蛋白Hb沒有明顯影響。