辛伐他汀對慢性心力衰竭兔心肌細(xì)胞凋亡的影響

楊秀麗，孫海燕，潘瑞陽，趙奕霖，楊 萌，黃宏偉，王顯良，趙國安

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種心臟疾病發(fā)展到終末階段的一組臨床綜合征,是心血管疾病患者的主要死亡原因，降低CHF的發(fā)病率、病死率已成為公共衛(wèi)生問題。因此，研究心力衰竭發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。心肌細(xì)胞凋亡是心力衰竭的重要發(fā)病機(jī)制之一，阻止細(xì)胞凋亡可減輕心臟重構(gòu)和心力衰竭程度。研究表明，心力衰竭發(fā)生時(shí)左心室功能惡化是心肌細(xì)胞反復(fù)丟失和剩余心肌細(xì)胞收縮功能逐漸退化的結(jié)果，而凋亡可能是心肌細(xì)胞不斷丟失的原因之一[1]。Fas/FasL是體內(nèi)直接啟動細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[2]，是機(jī)體維持自身穩(wěn)定的重要調(diào)控途徑，該系統(tǒng)異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。p53基因是一種抑癌基因，野生型p53基因的主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及細(xì)胞凋亡，參與心血管系統(tǒng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[3]。研究表明，p53基因具有促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的作用，p53蛋白參與多種損傷所致的心肌細(xì)胞凋亡過程，且p53途徑是細(xì)胞凋亡連鎖反應(yīng)中的重要核心[4]。他汀類藥物除具有調(diào)節(jié)血脂作用外，還具有抗炎、抑制心肌肥厚、抗心肌纖維化等多項(xiàng)效應(yīng)。研究顯示，他汀類藥物能降低心臟猝死發(fā)生率，具有抗凋亡作用[5-6]。本研究通過建立兔CHF模型，并給予辛伐他汀進(jìn)行干預(yù)，旨在探討他汀類藥物對CHF兔心肌細(xì)胞凋亡、血清可溶性Fas(soluble Fas,sFas)水平、心肌p53蛋白表達(dá)的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康新西蘭大耳兔36只，雄性，體質(zhì)量1.6～2.3 kg，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(批號：2016A509)。

1.2 藥物、試劑與儀器注射用鹽酸多柔比星購自山西普德藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字H14023143)，辛伐他汀購自山東方明藥業(yè)股份有限公司(國藥準(zhǔn)字H20063146)，sFas檢測試劑盒購自美國R&D公司；p53抗體、SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)公司，MyLabFive動物彩色超聲診斷儀購自意大利百勝公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及兔CHF模型建立將36只兔隨機(jī)分為正常對照組、CHF組和辛伐他汀組，每組12只。CHF組和辛伐他汀組兔經(jīng)耳緣靜脈注射注射用鹽酸多柔比星1.5 mg·kg-1(使用前以生理鹽水稀釋)，每周1次，連續(xù)10周，注射完成后再觀察2周；辛伐他汀組兔在首次注射多柔比星時(shí)開始給予辛伐他汀1.5 mg·kg-1，灌胃，每日1次，連續(xù)12周；正常對照組兔經(jīng)耳緣靜脈注射生理鹽水，給藥方法同CHF組。

1.3.2 心臟超聲心動圖檢查實(shí)驗(yàn)12周后，3組兔經(jīng)耳緣靜脈注射200 g·L-1烏拉坦(5 mg·kg-1)麻醉，行超聲心動圖檢查，分別測量左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension,LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)及左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。

1.3.3 樣本采集及處理兔心臟超聲心動圖檢查后，頸動脈取血5 mL，4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，取血清，置于-70 ℃冰箱保存待測。然后，采用空氣栓塞法處死兔，游離左心室心肌，放入40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，以備心肌細(xì)胞凋亡及p53蛋白表達(dá)檢測。

1.3.4 血清sFas水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清sFas水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5 心肌細(xì)胞凋亡檢測采用末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法檢測心肌細(xì)胞凋亡情況。取石蠟包埋的心肌組織連續(xù)切片，脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液浸洗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色者為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色者為非凋亡細(xì)胞。每一切片選取5個(gè)高倍視野(×200)，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.6 免疫組織化學(xué)法檢測兔心肌細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)取石蠟包埋的心肌組織連續(xù)切片，脫蠟，高壓抗原修復(fù)，滴加正常動物血清，過夜，滴加一抗4 ℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，滴加鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。p53蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)褐色顆粒。在顯微鏡下取5個(gè)高倍視野(×200)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每個(gè)視野陽性表達(dá)細(xì)胞所占的比例，取均值即為每張切片陽性表達(dá)細(xì)胞率。

2 結(jié)果

2.1 3組兔存活情況正常對照組和辛伐他汀組兔全部存活，CHF組兔死亡2只。

2.2 3組兔心臟超聲心動圖比較結(jié)果見表1。與正常對照組比較，辛伐他汀組和CHF組兔LVESD、LVEDD顯著增大，LVEF、LVFS顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CHF組比較，辛伐他汀組兔LVESD、LVEDD減小，LVEF、LVFS升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組兔LVESD，LVEDD，LVFS及LVEF比較

組別nLVESD/mmLVEDD/mmLVFS/%LVEF/%正常對照組128.35±0.5412.20± 0.5628.37±1.0762.00±1.13CHF組1012.21±0.54a17.51±0.57a17.62±1.29a37.37±1.44a辛伐他汀組1210.17±0.48ab13.69±0.34ab24.15±0.76ab49.18±3.14ab

注：與正常對照組相比aP<0.05；與CHF組比較bP<0.05。

2.3 3組兔血清sFas水平比較正常對照組、CHF組和辛伐他汀組兔血清sFas水平分別為(8.42±0.14)、(11.7±0.55)、(9.43±0.35)mg·L-1；CHF組和辛伐他汀組兔血清sFas水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.347、6.125，P<0.05)；辛伐他汀組兔血清sFas水平低于CHF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.29，P<0.05)。

2.4 3組兔心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較結(jié)果見圖1。正常對照組偶可見凋亡細(xì)胞，CHF組兔可見大量凋亡細(xì)胞，辛伐他汀組凋亡細(xì)胞顯著少于CHF組。正常對照組、CHF組和辛伐他汀組兔心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為1.08±0.12、16.13±1.17、4.86±0.11；CHF組和辛伐他汀組兔心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.285、4.398，P<0.05)；辛伐他汀組兔心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)低于CHF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.541，P<0.05)。

A：正常對照組；B：CHF組；C：辛伐他汀組。

圖1 3組兔心肌細(xì)胞凋亡情況(TUNEL法，×200)

Fig.1 Cardiomyocyte apoptosis of rabbits in the three groups (TUNEL method,×200)

2.5 3組兔心肌細(xì)胞中p53蛋白陽性表達(dá)比較結(jié)果見圖2。正常對照組兔心肌細(xì)胞內(nèi)較少棕黃色顆粒沉積，p53表達(dá)較弱；CHF組兔心肌細(xì)胞內(nèi)有較多棕黃色顆粒，p53表達(dá)較強(qiáng)；辛伐他汀組兔心肌細(xì)胞內(nèi)較少棕黃色顆粒沉積，p53表達(dá)較弱。正常對照組、CHF組和辛伐他汀組兔心肌細(xì)胞p53蛋白陽性表達(dá)率分別為(18.62±0.41)%、(45.39±0.68)%、(33.17±0.52)%；CHF組和辛伐他汀組兔心肌細(xì)胞p53蛋白陽性表達(dá)率高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.325、2.981，P<0.05)；辛伐他汀組兔心肌細(xì)胞p53蛋白陽性表達(dá)率低于CHF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.256，P<0.05)。

A：正常對照組；B：CHF組；C：辛伐他汀組。

圖2 3組兔心肌細(xì)胞中p53蛋白陽性表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)

Fig.2 Positive expression of p53 protein in myocardial cells of rabbits in the three groups (immunohistochemical staining,×200)

3 討論

CHF是一種復(fù)雜的臨床綜合征，心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡等一系列病理生理改變參與了CHF的發(fā)生和發(fā)展過程。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是組織細(xì)胞在正常生長發(fā)育過程中或在病理?xiàng)l件下的一種主動性死亡方式。目前認(rèn)為，在心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中，心肌細(xì)胞進(jìn)行性死亡和丟失可能是導(dǎo)致心力衰竭惡化的主要原因之一[7]。凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺失，心肌細(xì)胞數(shù)量減少使殘留心肌細(xì)胞負(fù)荷加重，引起心肌收縮力進(jìn)行性下降，心功能受損[8-9]。Fas基因表達(dá)I型膜受體蛋白，屬腫瘤壞死因子受體家族成員之一[10]，F(xiàn)as基因結(jié)構(gòu)中有死亡信號所需的結(jié)構(gòu)域，與Fas基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。細(xì)胞膜表面FasL蛋白陽性細(xì)胞可與Fas蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞相互作用，將“死亡信號”傳遞給Fas蛋白陽性細(xì)胞，并激活該細(xì)胞的凋亡程序，繼而于數(shù)小時(shí)內(nèi)誘發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞膜表達(dá)有功能的Fas蛋白，而且表達(dá)量達(dá)到一定強(qiáng)度是通過Fas途徑誘導(dǎo)凋亡的首要條件。Fas調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的重要基因，也是調(diào)控凋亡信號途徑的重要基因，sFas是Fas基因突變后的表達(dá)產(chǎn)物，以可溶性形式出現(xiàn)于外周血液中，檢測血清sFas水平可以了解心肌細(xì)胞凋亡程度及心力衰竭嚴(yán)重程度[11]。p53依賴活化的核轉(zhuǎn)錄因子-κB誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，阻斷核轉(zhuǎn)錄因子-κB可以減少心肌細(xì)胞p53的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡[12]。p53在阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠心肌組織中表達(dá)和活性増高[13]。正常心肌細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)極少，當(dāng)各種原因?qū)е翫NA損傷時(shí)p53的轉(zhuǎn)錄水平升高，DNA修復(fù)啟動，若DNA修復(fù)出現(xiàn)異常則誘導(dǎo)心肌細(xì)胞進(jìn)入程序性凋亡[14]。阿霉素可直接導(dǎo)致DNA損傷，使p53表達(dá)增加，通過p53磷酸化增加而激活內(nèi)源性凋亡途徑[15]。本研究結(jié)果顯示，CHF組兔血清sFas水平高于正常對照組，而辛伐他汀組兔血清sFas水平低于CHF組，提示辛伐他汀預(yù)處理可以顯著減少心肌細(xì)胞凋亡。CHF組兔心肌細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)高于正常對照組，而辛伐他汀組兔心肌細(xì)胞中p53表達(dá)低于CHF組，提示辛伐他汀能夠抑制p53蛋白表達(dá)，通過干預(yù)細(xì)胞凋亡程序而抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，達(dá)到保護(hù)心肌作用，改善心功能。

左心室重構(gòu)是CHF發(fā)展過程中的重要決定因素，目前，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、β受體阻滯劑及醛固酮受體拮抗劑等已被證實(shí)可以逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，是心力衰竭的基本治療藥物。目前，辛伐他汀對CHF的有益作用越來越受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能夠抑制CHF幼兔心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)心功能[16]。本研究結(jié)果顯示，CHF組兔LVESD、LVEDD顯著大于正常對照組，LVEF和LVFS顯著低于正常對照組，提示CHF造模成功；與CHF組比較，辛伐他汀組兔LVESD、LVEDD減小，LVEF、LVFS升高，提示辛伐他汀可以減小LVESD、LVEDD，提高LVEF和LVFS，改善心室重塑及心功能。

綜上所述，辛伐他汀可以顯著改善CHF兔的心功能，抑制心室重構(gòu)，其機(jī)制可能與其抑制Fas/FasL信號系統(tǒng)及心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。