鹽酸異丙腎上腺素腹腔注射建立心肌缺血性壞死大鼠模型的最佳藥物濃度研究

王亦如,蔡新華

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科暨區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，廣西 南寧 530000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

心肌梗死是常見的心血管疾病，是臨床主要的致死因素之一[1]。心肌缺血性壞死動物模型廣泛應(yīng)用于心血管疾病發(fā)病機制和藥物干預(yù)研究，針對不同研究目的，適用的動物模型也有差異,制備有效的動物模型是完成實驗的前提。鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride，ISO)注射是制備心肌缺血性壞死動物模型的簡易方法[2-3]，但目前該方法的藥物使用劑量差別較大[4]。心電圖檢查、心肌標志物檢測與免疫組織化學(xué)法檢測是判斷心肌缺血性壞死動物模型心肌缺血壞死損傷程度的常用方法[5]。心肌缺血性壞死的特征性心電圖改變是出現(xiàn)ST段抬高、T波異常以及病理性Q波。心肌標志物檢測對明確心肌缺血性壞死有重要的輔助作用，肌酸激酶(creating kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creating kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)是常用的血清心肌標志物，與心肌缺血性壞死進展及預(yù)后有明顯關(guān)系[5]。對心肌缺血性壞死模型的心肌組織進行形態(tài)學(xué)觀察可以直觀觀測心肌壞死面積[6]。本研究采用不同劑量ISO對Sprague Dawley(SD)大鼠進行腹腔注射，通過觀察各組大鼠心電圖改變、血清心肌標志物和心肌缺血性壞死程度的差異，評估不同劑量ISO制備心肌缺血性壞死動物模型的效果，為心肌梗死動物模型的制備提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性清潔級成年SD大鼠42只，體質(zhì)量140～180 g，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，標準飼料和清潔飲用水飼養(yǎng)于濕度恒定、22～26 ℃、安靜、無強光直射、晝夜交替的室內(nèi)環(huán)境。

1.2 主要試劑與儀器ISO注射液購自上海禾豐制藥有限公司(國藥準字431021344)；心肌酶譜生生物化學(xué)化試劑浙江康特生物有限公司；BH8顯微攝像系統(tǒng)日本Olympus公司，Beckman DXC800數(shù)字成像系統(tǒng)美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 動物模型制備適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將大鼠隨機分為對照組和2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組，每組7只。2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠分別按照2、4、6、8、10 mg·kg-1將ISO溶于生理鹽水，配成10 mL工作液進行腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d；對照組大鼠給予等體積生理鹽水腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d。每日注射15 min后及第8天麻醉大病穩(wěn)定后監(jiān)測大鼠心電圖，觀察大鼠心率、ST段基線偏移高度、T波改變及有無病理性Q波出現(xiàn)，以判斷大鼠對ISO的藥物反應(yīng)和心肌缺血性壞死模型的制備情況。

1.4 各組大鼠血清心肌酶檢測各組大鼠均于連續(xù)7 d腹腔注射結(jié)束后的第2天，給予100 g·L-1的水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔麻醉，待大鼠穩(wěn)定后記錄心電圖，然后胸骨正中位快速開胸，打開心包膜，暴露心臟，用注射器抽取心室血置于 EP管中，室溫靜置2 h，3 000 r·min-1離心20 min,收集血清,用心肌酶譜生物化學(xué)試劑進行心肌酶譜學(xué)檢查，檢測指標包括CK、CK-MB、LDH、AST和ɑ-羥丁酸脫氫酶(ɑ-hydroxybutyrate dehydrogenase，ɑ-HBDH)，以輔助判斷大鼠心肌缺血性壞死的程度。

1.5 各組大鼠心肌組織學(xué)觀察各組大鼠采血結(jié)束后取出心臟，取左心室組織，修剪后水平定位、包埋劑包埋，液氮快速冷凍，移入冰凍切片機內(nèi)，復(fù)溫至與冷凍箱溫度一致后進行層厚8 μm切片，組織塊修理到暴露心腔開始收集切片，自然干燥，冷丙酮固定15 min，蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色，中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖片，每張切片采集6～10張，利用Photoshop7.0.1軟件進行圖片拼接，每例心肌缺血性壞死模型拼接6張完整心室組織橫斷面圖片；利用Image J圖像分析軟件分析心肌缺血壞死區(qū)面積百分比，心肌缺血壞死區(qū)面積百分比=心肌缺血壞死區(qū)面積/心室橫斷面面積×100%。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠心電圖表現(xiàn)結(jié)果見圖1。ISO腹腔注射第7天，對照組大鼠心電圖表現(xiàn)正常(圖1A)；2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心電圖均可見ST段基線偏移向上抬高、P波與R波間期明顯、T波量小于R波及形成高大的近似“帳篷樣”單波等心肌缺血性改變(圖1B～圖1E)。其中，ISO 4 mg·kg-1組大鼠心率增快，其心電圖ST段呈弓背向上抬高、病理性Q波出現(xiàn)(圖1C)。對照組及2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心率分別為(394.0±7.5)、(403.4±30.2)、(425.6±16.4)、(389.8±13.9)、(390.7±27.5)、(391.5±22.4)次·min-1，2、4 mg·kg-1ISO組大鼠心率高于對照組，8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心率低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；6 mg·kg-1ISO組大鼠心率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A：對照組；B：2 mg·kg-1ISO組；C：4 mg·kg-1ISO組；D：6 mg·kg-1ISO組；E：8 mg·kg-1ISO組；F：10 mg·kg-1ISO組。

圖1 ISO誘導(dǎo)第7天大鼠心電圖表現(xiàn)

Fig.1 ECG of rats induced by isoproterenol for seven days

2.2 6組大鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST和ɑ-HBDH水平比較結(jié)果見表1。與對照組比較，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清AST、LDH、ɑ-HBDH顯著升高，2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK、CK-MB顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與2 mg·kg-1ISO組比較，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清AST、CK、CK-MB顯著升高，6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清LDH顯著升高，8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清ɑ-HBDH顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與4 mg·kg-1ISO組比較，6、8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK顯著升高，8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK-MB顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與6 mg·kg-1ISO組比較，10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK顯著降低，8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK-MB顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與8 mg·kg-1ISO組比較，10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK、CK-MB顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 6組大鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST和ɑ-HBDH的表達水平

Tab.1 Comparison of the levels of serum CK,CK-MB,LDH,AST and ɑ-HBDH of rats among the six groups

組別nAST/(U·L-1) LDH/(U·L-1)CK/(U·L-1) CK-MB/(U·L-1) ɑ-HBDH/(U·L-1)對照組7766.3±294.5712.5±199.61 133.2±427.4 313.6±110.3 275.9±102.62 mg·kg-1ISO組 7788.5±275.1788.8±275.5 1 485.3±465.1a370.5±98.4a332.6±95.44 mg·kg-1ISO組 71 642.7±522.6ab1 560.3±513.3a4 370.5±731.5ab1 560.3±475.6ab703.2±180.3a6 mg·kg-1ISO 組71 870.9±589.2ab1 769.1±589.4ab5 427.6±1 026.2abc2 228.1±480.0ab 788.3±133.7a8 mg·kg-1ISO組72 117.4±665.3ab 2 123.4±570.2ab5 430.2±997.8abc3 095.4±130.2abcd1 014.7±195.9ab10 mg·kg-1ISO組71 870.1±503.4ab 1 693.5±522.5ab 4 589.4±1 235.3abde1 769.5±408.3abe817.1±199.1ab

注：與對照組比較aP<0.05；與2 mg·kg-1ISO組比較bP<0.05；與4 mg·kg-1ISO組比較cP<0.05；；與6 mg·kg-1ISO組比較dP<0.05；與8 mg·kg-1ISO組比較eP<0.05。

2.3 不同劑量ISO組大鼠心肌組織病理學(xué)表現(xiàn)結(jié)果見圖2。不同劑量ISO組大鼠均出現(xiàn)心室肌細胞缺血壞死，壞死區(qū)主要集中在近心內(nèi)膜的心肌層，表現(xiàn)為壞死心肌細胞溶解消失，大量成纖維細胞遷移至壞死區(qū)，壞死區(qū)可呈局灶狀或連接成片；非壞死區(qū)肌細胞間隙增大，肌絲紊亂。2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心肌缺血壞死區(qū)面積百分比分別為(2.54±0.09)%、(11.42±2.15)%、(7.58±1.47)%、(11.43±1.36)%、(9.00±2.24)%。4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心肌缺血壞死區(qū)面積大于 2 mg·kg-1ISO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A：對照組；B：2 mg·kg-1ISO組；C：4 mg·kg-1ISO組；D：6 mg·kg-1ISO組；E：8 mg·kg-1ISO組；F：10 mg·kg-1ISO組?！啊鳌笔救毖獕乃绤^(qū)。

圖2 ISO誘導(dǎo)大鼠心肌缺血性壞死病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×40)

Fig.2 Pathological manifestation of myocardial ischemic necrosis induced by isoproterenol in rats (HE staining，×40)

3 討論

目前，制備心肌缺血性壞死動物模型的方法有多種，常用的有結(jié)扎、夾閉冠狀動脈使之狹窄或阻塞導(dǎo)致的心肌缺血性壞死，以及注射ISO、垂體后葉素、多柔比星等藥物制備心肌缺血性壞死模型等[3,7]；不同的制備方法均有相應(yīng)的優(yōu)缺點，結(jié)扎、夾閉冠狀動脈等開胸手術(shù)方法制備的模型雖可最大限度模擬臨床上的急性心肌缺血，但受術(shù)中麻醉劑量、創(chuàng)口大小等因素影響，不同模型之間的效果差異很大；藥物干預(yù)法較開胸手術(shù)方法操作更為簡單、有效，常用于心肌缺血性壞死模型的制備。ISO作用于心臟β1受體，擴張冠狀動脈血管，增加心肌收縮力和收縮頻率，增加心肌細胞耗氧量，會導(dǎo)致心肌細胞相對缺氧，引起心肌細胞壞死，因此，ISO是常用的制備心肌缺血性壞死動物模型的試劑，其具有操作簡單、動物死亡率低的優(yōu)點，但制備模型時使用劑量存在較大差異[8-11]。以往研究發(fā)現(xiàn)，低劑量ISO可以誘導(dǎo)以心肌纖維化和壞死為特征的動物模型[12]。因此，本研究在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，觀察腹腔注射不同劑量ISO對大鼠心肌缺血性壞死的影響，旨在尋找制備大鼠心肌缺血性壞死模型的最佳劑量。

ISO可以增快心率，增強心肌收縮力，從而使心肌耗氧量增加，進而導(dǎo)致心肌供給血氧失衡，最終導(dǎo)致心肌缺血性壞死的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果顯示，ISO作用于大鼠后，各給藥組大鼠心率總體隨藥物濃度增大呈先增快后減慢趨勢，其中2、4 mg·kg-1ISO組大鼠心率高于對照組，8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心率低于對照組，6 mg·kg-1ISO組大鼠心率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；各給藥組大鼠心電圖均可見ST段基線偏移向上抬高、P波與R波間期明顯、T波量小于R波及形成高大的近似“帳篷樣”單波等心肌缺血性改變，提示大鼠心肌缺血性壞死模型構(gòu)建成功；而4 mg·kg-1ISO組大鼠心率增快，且其心電圖ST段呈弓背向上抬高、病理性Q波出現(xiàn)；以上結(jié)果提示，4 mg·kg-1ISO對大鼠心率、心電圖改變的影響最大。臨床上，檢測心肌標志物對于明確心肌缺血性壞死有重要的輔助作用，高東雁等[14]研究顯示，ISO誘導(dǎo)后大鼠血清CK和LDH均會顯著升高。 CK、CK-MB、LDH、AST是常用的血清心肌標志物，當(dāng)心肌受損時，心肌組織中CK、CK-MB、LDH、AST由于心肌細胞壞死釋放入血，血清心肌酶水平呈現(xiàn)不同程度升高，對判斷心肌損傷程度有重要輔助價值。本研究結(jié)果顯示，在ISO誘導(dǎo)后，與對照組比較，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清AST、LDH、ɑ-HBDH顯著升高，2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK、CK-MB顯著升高；與2 mg·kg-1ISO組比較，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清AST、CK、CK-MB顯著升高，6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清LDH顯著升高，8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清ɑ-HBDH顯著升高；與4 mg·kg-1ISO組比較，6、8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK顯著升高，8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK-MB顯著升高；與6 mg·kg-1ISO組比較，10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK顯著降低，8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK-MB顯著升高；與8 mg·kg-1ISO組比較，10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK、CK-MB顯著降低。觀察已制備的心肌缺血性壞死模型大鼠心肌組織的形態(tài)學(xué)，可以直觀觀測心肌組織壞死的面積。本研究結(jié)果顯示，不同劑量ISO組大鼠均出現(xiàn)心室肌細胞壞死，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心肌缺血壞死區(qū)面積均大于2 mg·kg-1ISO組，其余組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但4 mg·kg-1ISO組大鼠心電圖呈現(xiàn)典型的缺血性壞死表現(xiàn)，且誘導(dǎo)劑量更低。

綜上所述，不同劑量ISO腹腔注射均可造成大鼠心肌缺血性壞死損傷，但結(jié)合對心電圖、血清心肌酶譜變化及心肌缺血壞死面積的影響，4 mg·kg-1ISO腹腔連續(xù)注射制備大鼠心肌缺血性壞死大鼠模型的效果最佳。