異丙酚對2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制

曹軍濤，王秀巖，郭宜姣，劉 超

(1.洛陽東方醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽 471003；2.天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所，天津 300222)

糖尿病是導致心血管疾病的危險因素之一，2型糖尿病患者發(fā)生缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)的風險是非糖尿病人群的2～4倍，且糖尿病患者心肌梗死后的病死率更高[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，在Zucker肥胖大鼠中，缺血/再灌注(ischemia reperfusion，IR)組大鼠的心肌細胞凋亡顯著高于對照組，說明糖尿病會提高缺血心肌的易損性[3-5]。如何在高血糖的情況下進行缺血預處理及后處理來保護心肌一直是學者關注的焦點。異丙酚是臨床上常用的靜脈麻醉藥，研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚能夠緩解糖尿病大鼠心肌IR損傷[6]，但其作用機制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可通過抑制細胞凋亡來緩解非糖尿病大鼠心肌IR損傷[7-8]。本研究旨在探討異丙酚對2型糖尿病大鼠IR損傷心肌的保護作用及作用機制，以期為臨床診治提供治療靶點和研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性清潔級Wistar大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，購于中國科學院上海實驗動物中心。

1.2 主要試劑與儀器鏈脲佐菌素購天津亞寶藥業(yè)科技有限公司(國藥準定H12020212)公司，100 g·L-1水合氯醛購自北京雷根生物技術有限公司，異丙酚購自意大利Astra Zeneca公司(國藥準字H20030199)；肌酸激酶(creatine kinase，CK)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、電化學發(fā)光化學發(fā)光液均購自上海碧云天生物技術有限公司，人Bcl-2、Caspase-3單克隆抗體購自美國Sigma公司，兔抗鼠Bax多克隆抗體購自德國默克公司；683小動物呼吸機購自北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司，AS/3麻醉監(jiān)測儀購自廣州美倫安迪電子科技有限公司，WZS-50F6微量輸液泵購自上海致衡醫(yī)療器械有限公司，SC-T10數(shù)碼相機購自日本Sony公司，Image J軟件購自美國Wayne Rasband National Institutes of Health公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立、實驗分組及各組干預措施參照文獻[9]的方法制備大鼠2型糖尿病模型。大鼠給予高脂高糖喂養(yǎng)5周后，經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)給藥2 d，3 d后經(jīng)尾靜脈采血測大鼠空腹血糖，2型糖尿病模型制備成功的標準為大鼠出現(xiàn)多尿、多飲，且血糖值≥16.7 mmol·L-1。

選取2型糖尿病模型制備成功的大鼠54只，按照隨機數(shù)字表法分為假手術組、IR組和異丙酚組，每組18只。IR組和異丙酚組大鼠采用Koizumi線栓法制備缺血再灌注模型，2組大鼠采用100 g·L-1水合氯醛麻醉后給予氣管插管，連接683小動物呼吸機進行機械通氣。采取股動脈及靜脈穿刺置管，將穿刺置管連接到麻醉監(jiān)測儀和輸液泵，監(jiān)測大鼠的血壓和給藥情況。待大鼠血壓和心率穩(wěn)定后，取右側(cè)臥位，在第3～5肋間進行開胸，剪開大鼠心包，在冠狀動脈左前降支下方穿5-0絲線，在大鼠心肌和結(jié)扎線間墊聚乙烯硬管，收緊結(jié)扎線后能夠看見結(jié)扎部位以下心肌顏色顯著變暗，心電圖主要表現(xiàn)為ST段抬高，即為缺血成功。大鼠缺血 30 min后剪開結(jié)扎線恢復血流進行再灌注2 h，心臟表面顏色變?yōu)榧t色、抬高的ST段下降在1/2以上即判定為再灌注成功。異丙酚組大鼠缺血前10 min靜脈泵注異丙酚6 mg·kg-1至術后2 h，假手術組大鼠僅進行穿線，不結(jié)扎冠狀動脈左前降支。

1.3.2 各組大鼠血清CK、LDH活性及SOD、MDA水平測定IR損傷模型建立前1 h和IR損傷模型建立1 h后通過股動脈采集大鼠外周血。采用速率法檢測大鼠血清CK、LDH活性，采用比色法檢測血清中SOD、MDA含量；嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 各組大鼠心肌組織病理學變化及心肌梗死范圍IR損傷模型建立后斷頭處死大鼠，取心肌組織，一半置于液氮凍存心肌組織，另一半置光學顯微鏡下觀察大鼠心肌組織的病理學變化，然后將大鼠心臟橫斷面切成2 mm切片，分別稱切片質(zhì)量，然后置于10 g·L-1伊文藍染液中染色20 min(37 ℃)，用數(shù)碼相機拍照，以Image J (1.31v)軟件計算心肌梗死范圍大小。

1.3.4 Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達取液氮凍存的大鼠心肌組織，研磨成粉末，充分裂解30 min后，在4 ℃下12 000×g離心30 min，取上清液，采用蛋白活性測定試劑盒對 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白進行定量分析。取30 μg Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白進行電泳，電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫下在體積分數(shù)5%脫脂牛奶中反應1 h，充分洗滌后分別加入一抗小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(11 000)，兔抗鼠Bax多克隆抗體(11 000 )及兔抗人Caspase-3 單克隆抗體( 11 000 )，4 ℃下反應過夜，充分洗滌后加入二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(11 000)或者辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(110 000)，室溫條件下反應30 min，充分洗滌后，電化學發(fā)光(electrochemi-luminescence，ECL)反應1 min，采用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進行拍照觀察和定量分析，結(jié)果用光密度值來代表蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心肌組織病理學變化結(jié)果見圖1。假手術組大鼠心肌細胞未見明顯壞死和出血，無中性粒細胞浸潤；IR組大鼠心肌細胞可見灶狀壞死及出血，有明顯的收縮帶，并存在大量中性粒細胞浸潤；異丙酚組大鼠心肌組織病理學改變較IR組明顯減輕，可見少量出血及中性粒細胞浸潤，有少量固縮細胞。

A：假手術組；B：IR組；C：異丙酚組。

圖1 3組大鼠心肌組織病理學變化(伊文藍染色，×100)

Fig.1 Histopathological changes of myocardium tissue of rats in the three groups(Ewen blue staining，×100)

2.2 3組大鼠心肌梗死范圍比較假手術組、IR組、異丙酚組大鼠心肌梗死范圍分別為(0.05±0.01)、(56.39±3.08)、(45.81±3.41) mm3; IR組、異丙酚組大鼠心肌梗死范圍大于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；異丙酚組大鼠心肌梗死范圍小于IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 3組大鼠血清LDH、CK、MDA及SOD水平比較結(jié)果見表1。IR前3組大鼠血清LDH、CK、MDA及SOD水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IR后，IR組、異丙酚組大鼠血清LDH、CK及MDA水平高于IR前，SOD水平低于IR前，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；假手術組大鼠IR前后血清LDH、CK、MDA及SOD水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IR后，IR組和異丙酚組大鼠血清LDH、CK及MDA水平高于假手術組，SOD水平低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；異丙酚組大鼠血清LDH、CK及MDA水平低于IR組，SOD水平高于IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 3組大鼠血清LDH、CK、MDA及SOD水平比較

組別nLDH/ (mg·L-1)CK/ (mg·L-1)MDA/ (mg·L-1)SOD/ (mg·L-1)假手術組18 IR前682.13±61.14699.93±62.277.46±0.67235.49±9.31 IR后789.31±175.37771.25±182.418.15±0.56 229.65±7.25IR組18 IR前715.41±65.27785.62±69.899.08±0.75 217.21±4.16 IR后3 548.62±193.25ab4 125.31±201.50ab25.38±0.78ab 70.27±6.58ab異丙酚組18 IR前694.23±60.31721.45±66.428.56±0.56 225.55±3.51 IR后2 946.37±184.42abc3 431.52±199.35abc19.55±0.84abc88.57±7.41abc

注：與IR前比較aP<0.05 ;與假手術組比較bP<0.05 ；與IR組比較cP<0.05。

2.4 3組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達比較結(jié)果見圖2和表2。IR組和異丙酚組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的相對表達量高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；異丙酚組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3蛋白相對表達量低于IR組，Bcl-2蛋白相對表達量高于IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 3組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(Western blot)

Fig.2 Expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 protein in myocardium tissue of rats in the three groups(Western blot)

表2 3組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達量比較

組別nBcl-2BaxCaspase-3假手術組 18698.36±30.981 263.58±22.991 509.02±46.26IR組181 260.95±32.25a2 250.15±36.59a1 921.35±36.80a異丙酚組 181 675.12±45.26ab1 822.49±30.55ab1 760.52±40.99abF4.3605.96825.269P0.1250.0830.001

注：與假手術組比較aP<0.05；與IR組比較bP<0.05。

3 討論

目前文獻報道的糖尿病大鼠心肌IR損傷模型多數(shù)為1型糖尿病[10-11]，而臨床上2型糖尿病的發(fā)病率顯著高于1型糖尿病，因此，本研究在2型糖尿病模型的基礎上制備大鼠心肌IR損傷模型，并探討異丙酚對其的影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可抑制大鼠脂質(zhì)過氧化，改善線粒體功能，保護心肌，降低心肌IR損傷[12]，即異丙酚對大鼠離體心臟 IR損傷有一定的保護作用，其可能作用機制為減少IR所致的氧化應激，抑制線粒體途徑的凋亡[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚能夠緩解糖尿病大鼠心肌IR誘導的心肌損傷并促進大鼠心功能的恢復[14-15]。心肌缺血可導致細胞凋亡，而再灌注可使細胞凋亡大幅增加[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚能夠緩解2型糖尿病大鼠IR誘導的心肌損傷。

心肌IR損傷是由多種因素導致的，其中氧化應激是關鍵環(huán)節(jié)。MDA是不飽和脂肪酸在自由基作用下產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應時出現(xiàn)的代謝產(chǎn)物，SOD則能夠清除自由基，保護細胞免受自由基的損傷[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與假手術組比較，IR后IR組、異丙酚組大鼠心肌梗死范圍變大，血清LDH、CK、MDA水平升高，SOD水平降低；異丙酚組大鼠心肌梗死范圍小于IR組，血清LDH、CK、MDA水平低于IR組，SOD水平高于IR組；提示通過阻斷糖尿病過程中的氧化應激反應可能對心肌IR損傷有一定的保護作用。

細胞凋亡在糖尿病心肌IR中起關鍵作用。在糖尿病心肌IR動物模型的心臟中，Bcl-2和Bax 2種調(diào)節(jié)蛋白的表達發(fā)生了改變。Bcl-2屬于抑凋亡基因，Bax屬于促凋亡基因，二者能夠形成Bcl-2/Bax同源二聚體[21]。Caspase-3是一種參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行凋亡的蛋白酶。Bcl-2表達下調(diào)和Bax表達上調(diào)能夠激活Caspase-3，進而導致細胞凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，IR組和異丙酚組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達上調(diào)；與IR組比較，異丙酚組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3的表達下調(diào)，Bcl-2表達上調(diào)。提示異丙酚減輕2型糖尿病大鼠心肌IR損傷的機制與上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax和Caspase-3的表達有關。

綜上所述，異丙酚能夠有效緩解2型糖尿病大鼠心肌IR損傷，其作用機制可能與上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax和Caspase-3的表達，抑制細胞凋亡有關。