白細(xì)胞介素-33和II型固有淋巴細(xì)胞在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病中的作用機(jī)制

姜 敏，王 晶，張洪平，田 戈，伊合帕爾·吐依洪，丁劍冰

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地，新疆呼吸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常見的慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是持續(xù)性的氣流受限，通常呈進(jìn)行性發(fā)展，其發(fā)生、發(fā)展與呼吸道和肺對(duì)有害顆粒(或氣體)的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)[1-2]。大量研究數(shù)據(jù)表明，免疫反應(yīng)在COPD的慢性炎癥過程中起不可忽視的作用[3-6]。白細(xì)胞介素-33(interleukin-33，IL-33)是IL-1家族的細(xì)胞因子，與細(xì)胞膜上的生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白和白細(xì)胞介素-1受體輔助蛋白組成的復(fù)合受體結(jié)合，能誘導(dǎo)復(fù)雜的免疫反應(yīng)[7]。研究證實(shí)， IL-33來源于支氣管上皮細(xì)胞，在COPD 重癥患者肺組織中選擇性地高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與白細(xì)胞介素13(interleukin-13，IL-13)和黏蛋白基因表達(dá)水平相關(guān)，炎性因子和呼吸道黏液的產(chǎn)生可導(dǎo)致COPD癥狀加重[8-9]。II型固有淋巴細(xì)胞(type 2innate lymphoid cells，ILC2)是Th2型固有免疫系統(tǒng)的主體[10]，在蠕蟲感染、異位性皮炎及呼吸道炎癥反應(yīng)等過程中起重要作用[11-13]。研究證實(shí)，IL-33是人類ILC2細(xì)胞的主要誘發(fā)因素[10]。本研究通過檢測(cè)COPD患者和健康人群外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中ILC2比例變化，IL-33體外刺激后ILC2細(xì)胞相關(guān)因子前列腺素D2受體/表達(dá)在Th2細(xì)胞上的趨化因子受體同源分子(chemoattractant receptor homologous molecule expressed on Th2 cell,CRTH2)、GATA結(jié)合因子3(GATA-binding factor 3,GATA3)、IL-33受體生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2,ST2)mRNA表達(dá)水平及IL-33刺激后IL-5、IL-13水平，旨在探討IL-33、ILC2在COPD發(fā)病中的免疫作用機(jī)制，以期為COPD 的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年11月至2018年5月于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院門診和住院治療的COPD患者50例為研究對(duì)象(COPD組)。所有患者符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]，其中男28例，女22例，年齡62～80(64.5±8.9)歲；第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1)占預(yù)計(jì)值百分比為(52.3±9.2)%，F(xiàn)EV1/用力肺活量 (forced vital capacity，F(xiàn)VC)為(54.1±6.6)%。另選取同期至新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院體檢的健康志愿者46例為健康對(duì)照組，其中男29例，女17例，年齡60～80(66.2±6.9)歲；FEV1占預(yù)計(jì)值百分比為(90.6±12.9)%，F(xiàn)EV1/FVC為(79.0±5.2)%。 2 組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器小鼠抗人流式抗體Lineage-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)抗體包括CD3 (UCHT1)、CD19 (HIB19)、CD123(7G3)、CD11b (M1/70)、CD11c (B-ly6)、CD8 (RPA-T8)、FceRI [AER-37 (CRA-1) ]、CD14 (M5E2)、CD4(RPA-T4)、CD56 (B159)、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin,APC)-CY7-CD45 (2D1)、多甲藻黃素-葉素-蛋白質(zhì)復(fù)合物(peridinin-chlorophyll-protein complex,PerCP)-CY5.5-CRTH2(BM16)、藻紅蛋白(p-phycoerythrin,PE)-CY7-IL-7Rα(HIL-7R-M21)均購(gòu)自美國(guó)BD公司，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津生物科技股份有限公司，TRIzol購(gòu)自國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYRB?Green試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，人重組IL-33細(xì)胞因子、ST2/IL-33R 中和抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司；流式細(xì)胞分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman 公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分析儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2組受試者外周血PBMC中ILC2比例2組受試者均于清晨8點(diǎn)采集空腹肘靜脈血5 mL，肝素抗凝，上下顛倒混合均勻后送實(shí)驗(yàn)室。使用淋巴細(xì)胞分離液分離各組外周血PBMC，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌后重懸于300 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106L-1。將調(diào)整濃度后的細(xì)胞分別置入流式管中，加入流式抗體CD45-APC-CY7、Lineage-FITC、PerCP-CY5.5-CRTH2、CD127-PE-CY7，于室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次后重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ILC2的比例。

1.4 人重組細(xì)胞因子IL-33體外刺激PBMC將2組受試者分離并調(diào)整好濃度的PBMC分別接種于24孔板內(nèi)，分別給予PBS、IL-33刺激、IL-33中和抗體阻斷等干預(yù)措施；PBS干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入PBS，IL-33刺激細(xì)胞每孔加入50 μg·L-1重組IL-33細(xì)胞因子，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h；IL-33中和抗體阻斷細(xì)胞使用IL-33中和抗體處理1 h后，加入50 μg·L-1人重組IL-33細(xì)胞因子，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h。1 500 r·min-1離心5 min，分別收集培養(yǎng)基上清液和細(xì)胞，培養(yǎng)基上清液于-80 ℃冰箱保存；細(xì)胞直接用于RNA的提取。

1.5 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-5和IL-13水平采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)“1.4”項(xiàng)下培養(yǎng)基上清液中IL-5和IL-13水平，檢測(cè)步驟按試劑盒說明書操作規(guī)程進(jìn)行，通過標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算各樣本的值。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中CRTH2、GATA3和ST2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄使用禽成髓細(xì)胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus，AMV) 反轉(zhuǎn)錄體系，將cDNA置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank 中基因的序列號(hào)CRTH2(NM_004778.2)、GATA3(NM_001002295.1)、ST2(NM_001282408.1)、GAPDH(NM_002046)設(shè)計(jì)引物，CRTH2上游引物序列為5′-CGCCACACTGAAGCCACTCTG-3′，下游引物序列為5′GCGTGGTCGATGTAGCGGATG-3′；GATA3上游引物序列為5′-GTGCATGACTCACTGGAGGAC TTC-3′，下游引物序列為5′-CATGTGGCTGGAGTGGC TGAAG-3′；ST2上游引物序列為5′-CTTCACGGTC AAGGATGAGCAAGG-3′，下游引物序列為5′-CACAG GACGGCAGCCAAGAAC-3′；GAPDH上游引物序列為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物序列為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系按照美國(guó)Invitrogen公司Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMIX試劑盒說明進(jìn)行。將混合均勻的樣品加入反應(yīng)管中后放入Bio-Rad CFX96中，反應(yīng)條件為： 95 ℃ 10 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，結(jié)果使用E-△△Ct相對(duì)定量法分析。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者PBMC中ILC2比例比較結(jié)果見圖1。COPD組患者PBMC中ILC2的比例為(3.64±1.84)%，健康對(duì)照組受試者PBMC中ILC2的比例為(0.69±0.28)%。COPD組患者PBMC中ILC2的比例高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.252，P<0.001) 。

A1、A2：淋巴細(xì)胞；B1、B2：固有淋巴細(xì)胞；C1、C2：ILC2細(xì)胞。

圖1 2組受試者PBMC中ILC2的比例

Fig.1 Proportion of ILC2 in PBMC of subjects in the two groups

2.2 IL-33體外刺激后各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-5和IL-13水平比較IL-33刺激后，2組受試者PBMC培養(yǎng)基上清液中IL-5、IL-13水平高于PBS干預(yù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；IL-33中和抗體阻斷后，2組受試者PBMC培養(yǎng)基上清液中IL-5、IL-13水平低于IL-33刺激后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)PBS干預(yù)、IL-33刺激、IL-33中和抗體阻斷后，COPD組患者PBMC培養(yǎng)基上清液中IL-5、IL-13水平均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 體外培養(yǎng)干預(yù)后2組受試者細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-5和IL-13水平比較

Tab.1 Comparison of the levels of IL-5 and IL-13 in the supernatant of cell culture medium between the two groups after culture interventioninvitro

組別nIL-5/(ng·L-1)IL-13/(ng·L-1)健康對(duì)照組46 PBS干預(yù)28.09±9.724.82±2.89 IL-33刺激41.40±4.66a6.44±2.23b IL-33中和抗體阻斷20.70±0.09c4.21±0.83cCOPD組50 PBS干預(yù)38.50±9.34d6.36±2.03 d IL-33刺激48.95±12.95be9.79±1.46be IL-33中和抗體阻斷22.90±4.26cf4.36±1.57cf

注：與同組PBS干預(yù)比較aP<0.05，bP<0.01；與同組IL-33刺激比較cP<0.01；與健康對(duì)照組PBS干預(yù)比較dP<0.01；與健康對(duì)照組IL-33刺激比較eP<0.01；與健康對(duì)照組IL-33中和抗體阻斷比較fP<0.01。

2.3 IL-33體外刺激后各組細(xì)胞中GATA3、CRTH2、ST2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較結(jié)果見表2。經(jīng)PBS干預(yù)、IL-33刺激、IL-33中和抗體阻斷，健康對(duì)照組受試者PBMC中GATA3、CRTH2、ST2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)PBS干預(yù)后，COPD組患者PBMC中GATA3、CRTH2、ST2 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于IL-33刺激后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。經(jīng)IL-33刺激后，COPD組患者PBMC中GATA3、CRTH2、ST2 mRNA相對(duì)表達(dá)量較健康對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.001) ；加入IL-33中和抗體阻斷后，COPD 組患者PBMC中GATA3、CRTH2、ST2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于經(jīng)IL-33刺激后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.001) 。

表2 體外培養(yǎng)干預(yù)后2組受試者細(xì)胞中GATA3、CRTH2、ST2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

組別nGATA3 mRNACRTH2 mRNAST2 mRNA健康對(duì)照組46 PBS干預(yù)0.75±0.180.82±0.140.84±0.21 IL-33刺激1.07±0.120.82±0.231.06±0.12 IL-33中和抗體阻斷0.73±0.250.83±0.280.77±0.21COPD組50 PBS干預(yù)0.86±0.16a1.01±0.23a1.36±0.19a IL-33刺激13.70±4.60b7.48±3.17b22.17±8.46b IL-33中和抗體阻斷0.77±0.18a0.81±0.10a1.30±0.12a

注：與COPD組IL-33刺激比較aP<0.001；與健康對(duì)照組比較bP<0.001。

3 討論

COPD是一種慢性炎癥性呼吸道疾病，對(duì)環(huán)境中有害因子的異常免疫反應(yīng)通常被認(rèn)為是導(dǎo)致其發(fā)病的主要原因[15]。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和人體受試者的研究，越來越多的證據(jù)表明，先天免疫系統(tǒng)的反應(yīng)對(duì)于COPD的發(fā)展至關(guān)重要[16-18]。

研究發(fā)現(xiàn)，COPD的發(fā)病過程可能存在ILC2細(xì)胞的參與[19-20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COPD患者外周血中ILC2比例顯著高于健康對(duì)照組，這與WU等[21]的研究結(jié)果相一致，ILC2細(xì)胞的占比反映了其在炎癥過程中功能活化情況。研究表明，ILC2可由肺上皮細(xì)胞及其他結(jié)構(gòu)細(xì)胞和免疫細(xì)胞釋放的IL-33、IL-25、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)等炎性介質(zhì)激活，促進(jìn)肺部的病理性炎癥反應(yīng)[22-24]。本研究對(duì)IL-33體外刺激ILC2細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-33體外刺激后COPD組患者ILC2相關(guān)因子CRTH2和核轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照組，COPD組患者IL-33受體ST2 mRNA表達(dá)水平也顯著高于健康對(duì)照組，同時(shí)檢測(cè)到IL-33體外刺激后COPD組患者Th2型細(xì)胞因子IL-5和 IL-13高表達(dá)。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子GATA3對(duì)ILC2細(xì)胞的功能是不可或缺的[25]，在GATA3缺失的情況下，淋巴樣祖細(xì)胞不能發(fā)育成為ILC2，當(dāng)GATA3表達(dá)減少時(shí)，ILC2會(huì)降低對(duì)IL-25、IL-33和TSLP的反應(yīng)，相應(yīng)地細(xì)胞因子分泌也減少[26]。KLEIN WOLTERINK等[27]在胎兒和成人肺中檢測(cè)到ILC2，并證實(shí)IL-33可刺激ILC2細(xì)胞高表達(dá)CRTH2，并促進(jìn)IL-13的產(chǎn)生，這表明人呼吸道ILC2也可能對(duì)IL-33發(fā)生反應(yīng)。ST2的表達(dá)水平可間接反映IL-33的生物學(xué)效應(yīng)。

本研究結(jié)果提示，在COPD進(jìn)程中ILC2發(fā)揮了生物學(xué)作用。COPD患者外周血ILC2細(xì)胞可經(jīng)IL-33刺激，高表達(dá)IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，從而引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)進(jìn)而參與COPD的發(fā)病過程。深入探討IL-33與ILC2細(xì)胞在COPD疾病中的作用機(jī)制，有望為COPD疾病中免疫反應(yīng)過程提供新的理論，可能為COPD細(xì)胞免疫治療新靶點(diǎn)的選擇提供新的基礎(chǔ)參考。