帶蒂胃漿肌瓣管修復(fù)豬膽總管缺損的實(shí)驗(yàn)研究

高蘇平，馬大喜，韓 江，蔡 端

(1.上海市健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院普通外科，上海 201318；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科，上海 200040)

肝外膽管損傷(extrahepatic bile duct injury，EBDI)是膽囊切除術(shù)嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，包括開腹膽囊切除術(shù)(open cholecystectomy，OC)和腹腔鏡膽囊切除術(shù)(laparoscopic cholecystectomy，LC)。EBDI在OC術(shù)中的發(fā)生率為0.1%～0.3%，在LC術(shù)中的發(fā)生率為0.4%～0.6%[1-3]。膽總管損傷修復(fù)最經(jīng)典的方法是膽總管空腸Roux-en-Y吻合術(shù)，但術(shù)后可出現(xiàn)消化性潰瘍、腸液反流、膽道反復(fù)感染等問題，甚至可誘發(fā)膽管癌。眾多學(xué)者研究認(rèn)為，保留Oddi括約肌功能的膽總管損傷修復(fù)手術(shù)是理想的術(shù)式，其中利用自體組織修復(fù)膽總管損傷是比較符合生理狀況的治療手段。本實(shí)驗(yàn)建立豬膽總管缺損模型，采用帶蒂胃漿肌瓣管修補(bǔ)膽總管缺損，保留其Oddi括約肌功能，探討帶蒂胃漿肌瓣管修復(fù)膽總管缺損的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康雄性成年實(shí)驗(yàn)豬(湖北白豬)18頭，體質(zhì)量14.5～15.5 kg，由上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要藥物、試劑與儀器注射用青霉素鈉購自四川制藥制劑有限公司(批準(zhǔn)文號：H51021742)，諾氟沙星膠囊購自安徽三精萬森制藥有限公司(批準(zhǔn)文號：H34022906)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色劑購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司，細(xì)胞角蛋白7(cell keratin 7，CK7)一抗和Calretinin一抗及二抗購自北京中山金橋生物有限公司；日立 7600全自動生物化學(xué)分析儀購自日本日立公司，CX41型光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制作所有豬分欄飼養(yǎng)，并隨機(jī)分為帶蒂胃漿肌瓣管組、膽總管斷端吻合組和膽腸內(nèi)引流組，每組6頭。豬麻醉后，剖腹、切除十二指腸上段0.5～0.8 cm長的膽總管，建立膽總管缺損模型。

1.3.2 手術(shù)方法帶蒂胃漿肌瓣管組豬采用帶蒂胃漿肌瓣管修復(fù)膽總管：先在臨近膽總管處切取2 cm×3 cm帶蒂胃漿肌瓣，以漿膜面為內(nèi)壁，環(huán)繞直徑為0.5 cm 支撐管，再用可吸收縫線縫合成漿肌瓣管，然后翻轉(zhuǎn)漿肌瓣管，依序于膽總管上、下斷端分別吻合，漿肌瓣管外包帶蒂大網(wǎng)膜。膽總管斷端吻合組豬采用膽總管斷端吻合修復(fù)膽總管：先將膽總管游離切斷，然后膽總管內(nèi)置支撐管，再用可吸收縫線行斷端吻合。膽腸內(nèi)引流組豬采用膽腸內(nèi)引流術(shù)，先將豬切斷的膽總管遠(yuǎn)端關(guān)閉，然后膽總管近端與近段空腸行Rox-en-Y膽總管空腸吻合術(shù)，所有操作均在眼鏡式手術(shù)放大鏡下進(jìn)行，采用顯微血管吻合技術(shù)。3組豬術(shù)中給予靜脈滴注青霉素鈉10萬U預(yù)防感染，術(shù)后第1、2、3天飲水中給予諾氟沙星0.1 g，每日1次。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 存活情況術(shù)后觀察各組豬的一般情況及存活情況。

1.4.2 肝功能指標(biāo)3組豬術(shù)前及術(shù)后4、12周經(jīng)耳靜脈抽血，測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)水平。

1.4.3 肝組織和膽總管大體檢查和顯微檢查各組豬于術(shù)后12周進(jìn)行安樂死，迅速開腹，取出肝臟進(jìn)行大體檢查。切除修復(fù)區(qū)膽總管及附近肝臟，Zamboni固定液固定，甲醇梯度脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋，切片、展片、烤片，行HE染色，梯度脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察肝臟和膽總管內(nèi)壁顯微結(jié)構(gòu)。

1.4.4 膽總管CK7和Calretinin 表達(dá)的測定各組豬膽總管石蠟切片脫蠟、水化，抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗3次，加入封閉劑進(jìn)行封閉。分別加入CK7、Calretinin 一抗室溫下孵育2 h，PBS清洗3次；滴加試劑盒增強(qiáng)劑室溫孵育20 min，加入二抗孵育30 min；PBS清洗3次；加入二氨基聯(lián)苯胺顯色10～15 min；自來水沖洗，復(fù)染，PBS清洗3次；甲醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。細(xì)胞呈現(xiàn)黃色或棕色染色即為陽性表達(dá)細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 各組動物存活情況各組豬手術(shù)均順利完成，均未出現(xiàn)術(shù)中死亡情況，術(shù)后均未出現(xiàn)膽漏。

2.2 各組豬膽總管及肝臟標(biāo)本大體觀帶蒂胃漿肌瓣管組有5頭豬肝臟呈紫紅色，表面光滑，質(zhì)地柔軟；膽總管修復(fù)段質(zhì)地較柔軟，管壁平整，管腔光滑通暢。有1頭豬術(shù)后支撐管脫入腸管導(dǎo)致梗阻性黃疸，其肝臟呈土黃色，表面光滑，質(zhì)地韌硬，且膽總管修復(fù)段管壁增厚，內(nèi)有黏凍狀、泥沙狀膽泥阻塞膽總管；修復(fù)段近端膽總管和肝內(nèi)膽管擴(kuò)張明顯，膽囊增大，膽汁淤積。膽總管斷端吻合組豬吻合口未見明顯狹窄，膽總管質(zhì)地柔軟，管壁平整，管腔光滑，肝臟呈紫紅色，表面光滑，質(zhì)地柔軟。膽腸內(nèi)引流組5頭豬吻合口未見明顯狹窄，膽總管質(zhì)地柔軟，管壁平整，管腔光滑，肝臟呈紫紅色，表面光滑，質(zhì)地柔軟；1頭豬術(shù)后膽管炎發(fā)作，其肝臟組織充血腫脹。

2.3 各組豬肝臟顯微結(jié)構(gòu)結(jié)果見圖1。術(shù)后12周，帶蒂胃漿肌瓣管組豬肝臟間質(zhì)內(nèi)少量散在粒細(xì)胞，呈輕度炎癥反應(yīng)；膽總管斷端吻合組豬肝臟間質(zhì)內(nèi)大量粒細(xì)胞聚集，呈明顯炎癥反應(yīng)；膽腸內(nèi)引流組豬肝臟間質(zhì)可見散在粒細(xì)胞，亦呈輕度炎癥反應(yīng)。

A:帶蒂胃漿肌瓣管組，光標(biāo)處示少量散在炎癥細(xì)胞；B:膽總管斷端吻合組，光標(biāo)處示大量炎癥細(xì)胞聚集；C:膽腸內(nèi)引流組，光標(biāo)處示散在炎癥細(xì)胞。

圖1 各組豬術(shù)后12周肝臟組織的顯微結(jié)構(gòu)(HE染色，×100)

Fig.1 Microstructure of liver tissue of pigs in each group ( HE staining，×100 )

2.4 各組豬膽總管的顯微結(jié)構(gòu)結(jié)果見圖2。術(shù)后12周帶蒂胃漿肌瓣管組豬胃漿肌瓣管腔面完整覆蓋著單層柱狀上皮，中外層為增生肌纖維、纖維組織，可見散在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并見較完整的毛細(xì)血管。膽總管斷端吻合組豬膽總管黏膜下可見大量成纖維細(xì)胞，并部分纖維化；膽腸內(nèi)引流組豬術(shù)后吻合口亦可見上皮增生，局部纖維化。

A:帶蒂胃漿肌瓣管組；B:膽總管斷端吻合組；C:膽腸內(nèi)引流組。

圖2 帶蒂胃漿肌瓣管組豬胃漿肌瓣管內(nèi)壁的顯微結(jié)構(gòu)(HE染色，×100)

Fig.2 Microstructure of inner wall of gastric seromuscular flap tube of pigs in pedicled gastric pulp muscle flap tube group(HE staining,×100)

2.5 各組豬膽總管免疫組織化學(xué)結(jié)果結(jié)果見圖3和圖4。3組實(shí)驗(yàn)豬術(shù)后12周膽總管內(nèi)壁黏膜上皮細(xì)胞中CK7呈陽性表達(dá)，表明為膽道來源上皮；Calretinin呈陰性表達(dá)，表明為非間皮組織。

A:帶蒂胃漿肌瓣管組；B:膽總管斷端吻合組；C:膽腸內(nèi)引流組。

圖3 術(shù)后12周各組豬膽總管內(nèi)襯黏膜上皮細(xì)胞中CK7的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×100)

Fig.3 Expression of CK7 in lining mucosa of common bile duct of pigs at 12 weeks after operation in each group (immunohistochemistry staining，×100)

A:帶蒂胃漿肌瓣管組；B:膽總管斷端吻合組；C:膽腸內(nèi)引流組。

圖4 術(shù)后12周各組豬膽總管內(nèi)襯黏膜上皮細(xì)胞中Calretinin的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×100)

Fig.4 Expression of Calretinin in lining mucosa of common bile duct of pigs of pigs at 12 weeks after operation in each group( immunohistochemistry staining，×100)

2.6 各組豬手術(shù)前后肝功能比較結(jié)果見表1。3組豬術(shù)前TBIL、ALT、AST水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組豬術(shù)后4、12周TBIL、ALT、AST水平與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組豬術(shù)后4、12周TBIL、ALT、AST水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組豬手術(shù)前后肝功能比較

Tab.1 Comparison of liver function indexes of pigs before and after operation in each group

組別nTBIL/(μmol·L-1)術(shù)前術(shù)后4周術(shù)后12周ALT/(U·L-1)術(shù)前術(shù)后4周術(shù)后12周AST/(U·L-1)術(shù)前術(shù)后4周術(shù)后12周帶蒂胃漿肌瓣管組647.6±5.156.2±7.153.1±5.024.3±8.369.3±12.155.3±8.835.4±7.3458.4±89.3124.3±37.4膽總管斷端吻合組643.4±5.358.3±9.450.4±8.032.8±7.472.4±13.450.6±11.237.7±5.4511.7±101.8133.2±48.6膽腸內(nèi)引流組640.3±7.148.6±10.646.7±9.027.4±3.880.6±8.358.9±10.741.2±8.6631.4±143.8166.7±72.1

3 討論

EBDI多是醫(yī)源性損傷。目前LC已成為膽囊切除術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，其明顯減少了術(shù)后疼痛和住院時間，但相應(yīng)的并發(fā)癥也隨之增高，據(jù)報道，EBDI在LC術(shù)中的發(fā)生率為0.1%～0.3%，而在OC術(shù)中的發(fā)生率上升至0.4%～0.6%[1-3]。外傷性膽管損傷較少見，發(fā)生率約為0.1%[4]。膽腸吻合內(nèi)引流術(shù)是治療肝外膽總管損傷狹窄的經(jīng)典術(shù)式[5]。但膽總管下端Oddis括約肌存在并有功能時，應(yīng)用膽腸吻合內(nèi)引流術(shù)修復(fù)膽總管損傷狹窄不盡合理。有學(xué)者認(rèn)為,盡管膽腸吻合術(shù)是膽道損傷及狹窄的可選治療方式，但絕不是最佳治療方案[6]。無論膽道還是腸道，膽腸吻合均可造成其結(jié)構(gòu)和功能的極大損傷。黃志強(qiáng)[7]院士指出，將膽道系統(tǒng)作為一個整體器官來對待和更多地保存其生理功能的完整性，可能是治療損傷性膽管狹窄的發(fā)展方向。因此，保存膽總管下端括約肌已成為損傷性膽總管狹窄修復(fù)的最終目的。任何模式的膽腸吻合術(shù)均破壞了括約肌的自然防護(hù)作用，導(dǎo)致膽道感染、炎癥、膽管黏膜上皮細(xì)胞增生。

保留Oddis括約肌的EBDI修復(fù)手術(shù)主要有闌尾間置膽管重建術(shù)[6]、帶蒂臍靜脈瓣移植術(shù)[8-9]、帶蒂空腸瓣修補(bǔ)術(shù)[10]、帶蒂肝圓韌帶修復(fù)術(shù)[11]等。但是在行闌尾間置膽管重建術(shù)時闌尾周圍淋巴組織豐富且管腔較狹窄，一旦發(fā)生膽管炎時易導(dǎo)致膽汁排出不暢，難以在臨床推廣。上述膽管重建手術(shù)僅被少數(shù)學(xué)者所試用，缺乏進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及確切的臨床數(shù)據(jù)支持。

有學(xué)者報道了采用靜脈、腹膜瓣等自體組織替代修復(fù)EBDI的動物研究，證實(shí)以聚全氟乙丙烯共聚物導(dǎo)管作為支撐管，通過自體靜脈補(bǔ)片修復(fù)膽管損傷是可行的[12-14]。BELZER等[15]采用靜脈補(bǔ)片修補(bǔ)長約1.5～4.0 cm的部分膽管壁缺損，取得良好效果。AYDIN等[16]成功地進(jìn)行了自體游離腹直肌鞘移植物修復(fù)膽管缺損的動物實(shí)驗(yàn)。國內(nèi)學(xué)者劉會春等[17]用大隱靜脈段結(jié)合內(nèi)襯支架修復(fù)山羊膽道缺損亦取得良好效果。韓江等[18]用自體腹膜管修復(fù)缺損膽總管后，使用帶蒂大網(wǎng)膜包裹，腹膜管的成活率高。但是，動物實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，采用自體靜脈和自體腹膜等組織修復(fù)肝外膽管缺損時，由于缺乏肌層，遠(yuǎn)期難以保持足夠的膽道張力，因此難以維持肝外膽道的通暢[12-14]。

本研究設(shè)計了帶蒂胃漿肌瓣管內(nèi)襯支撐管、外包裹大網(wǎng)膜修復(fù)膽管整段缺損的動物實(shí)驗(yàn)，采取內(nèi)支撐管技術(shù)，防止膽道狹窄的發(fā)生和發(fā)展。帶蒂胃漿肌瓣管組在臨近膽總管的胃壁大彎側(cè)切取2 cm×3 cm帶網(wǎng)膜右血管蒂的漿肌瓣，然后以所取胃壁漿肌瓣漿膜面為內(nèi)壁，圍繞直徑約0.5 cm的支撐管，再用可吸收縫線縫合成漿肌瓣管，依序于膽管上、下斷端分別吻合，漿肌瓣管外包帶蒂大網(wǎng)膜，從大體標(biāo)本的觀察發(fā)現(xiàn)，帶蒂胃漿肌瓣管組豬膽管修復(fù)段質(zhì)地較柔軟，管壁平整，管腔光滑通暢。病理學(xué)結(jié)果證實(shí)，帶蒂胃漿肌瓣管腔面覆蓋著單層柱狀上皮，且免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果證實(shí)為膽道來源，說明本組實(shí)驗(yàn)是成功的，使用帶蒂胃漿肌瓣管修復(fù)膽總管缺損，膽管上皮可逐漸由兩端向中央移行覆蓋漿肌瓣管腔面，完成缺損膽管的修復(fù)。胃壁面積大，切除部分胃壁漿肌層不影響胃的修復(fù)；保留胃大彎網(wǎng)膜右血管的胃漿肌瓣，移動范圍大，便于手術(shù)操作，且所取胃漿肌瓣血供好，張力小，修復(fù)段容易成活。帶蒂胃漿肌瓣管修復(fù)的膽管通暢性與“經(jīng)典”的膽管斷端對端吻合術(shù)及膽腸內(nèi)引流術(shù)相仿。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前及術(shù)后4、12周，3組豬肝功能各指標(biāo)組內(nèi)、組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。帶蒂胃漿肌瓣管組豬術(shù)后肝臟組織切片HE染色顯示，其肝臟間質(zhì)內(nèi)僅少量散在粒細(xì)胞，呈輕度炎癥反應(yīng)，說明保留Oddis括約肌的膽管修復(fù)術(shù)不會因膽腸反流導(dǎo)致肝臟嚴(yán)重炎癥。帶蒂胃漿肌瓣管組中1頭豬出現(xiàn)梗阻性黃疸，可能是由于支撐管脫入腸管使修復(fù)段膽總管缺乏有效的支撐造成膽總管狹窄，進(jìn)一步發(fā)展，膽汁淤積形成膽泥，出現(xiàn)膽總管結(jié)石而導(dǎo)致梗阻性黃疸。因此，選擇合適的支撐管及預(yù)防遠(yuǎn)期修復(fù)段膽管的狹窄仍需繼續(xù)研究。

在本實(shí)驗(yàn)獲得初步結(jié)果的基礎(chǔ)上，對1例膽總管損傷修復(fù)后狹窄3 a伴肝損傷、梗阻性黃疸患者，采用帶網(wǎng)膜右血管蒂胃漿肌瓣片修復(fù)狹窄段膽管，隨訪7個月效果良好(另撰文報道)。

綜上所述，帶蒂胃漿肌瓣管修復(fù)膽總管缺損，組織瓣血供好，無張力，膽管上皮可逐漸由兩端向中央移行覆蓋修復(fù)段管腔面，具有一定臨床應(yīng)用前景。