遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥家系A(chǔ)NK1基因新發(fā)剪切位點(diǎn)突變的不典型表型及表型差異探討

丁紅珂 潘小英 吳新華 張彥 吳菁 劉玲 曾玉坤余麗華 蘭菲菲,*

(1.廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442；2.廣東省婦幼保健院 婦幼代謝與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511442；3.廣東省婦幼保健院 信息管理科，廣東 廣州 511442)

遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(hereditary spherocytosis，HS)是一種遺傳性溶血性貧血，是由于基因突變導(dǎo)致紅細(xì)胞膜蛋白缺陷而引起的貧血，發(fā)病率約為1/5000，臨床表現(xiàn)為貧血及相關(guān)癥狀，且表現(xiàn)程度不一，存在一定的遺傳異質(zhì)性，通常表現(xiàn)為不同程度的貧血、黃疸、脾腫大、球形紅細(xì)胞增多、紅細(xì)胞滲透脆性增加等[1,2]。目前發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的與HS發(fā)病相關(guān)的基因有ANK1、SPTA1、SPTB、SLC4A1和EPB42，分別編碼錨蛋白、α血影蛋白、β血影蛋白、帶3蛋白和4.2蛋白，參與紅細(xì)胞膜之間的相互作用和脂質(zhì)雙分子層的構(gòu)成，其中以ANK1基因突變最為常見[3-6]。HS大部分為常染色體顯性遺傳，少數(shù)為常染色體隱性遺傳。

本文利用高通量測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)臨床表現(xiàn)不典型家系先證者和其父親在ANK1基因存在一個(gè)剪切位點(diǎn)的雜合突變：c.4381+1delG雜合(轉(zhuǎn)錄本號(hào)：NM_000037)(chr8:41,688,155)，染色體位置參考GRCh38/hg38版本，該突變位點(diǎn)尚未見報(bào)道。同時(shí)分析該家系基因突變遺傳學(xué)特點(diǎn)與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，并對(duì)第二胎進(jìn)行產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢。并為臨床遺傳咨詢醫(yī)生對(duì)HS臨床表現(xiàn)型差異的認(rèn)識(shí)提供更多的資料。

1 資料與方法

1.1 基本資料 實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)自廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心遺傳咨詢門診患者夫婦和患兒，母親為妊娠狀態(tài)?；純号?，11歲，出生后發(fā)現(xiàn)貧血，并伴有黃疸。輔助檢查：血紅蛋白在70～110g/L左右波動(dòng)，間接膽紅素升高58.5μmol/L，紅細(xì)胞生存時(shí)間28天，網(wǎng)織紅比例10.8%，紅細(xì)胞滲透脆性增加，抗堿血紅蛋白輕度升高3.25%。骨髓穿刺、末梢血涂片、地中海貧血基因、G6PD檢查未見明顯異常。腹部超聲提示膽囊多發(fā)小結(jié)石，脾大(厚35mm，斜徑106mm，肋下15mm)，懷疑為遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥，并對(duì)先證者及其父母進(jìn)行了高通量醫(yī)學(xué)外顯子基因檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 經(jīng)孕婦和家屬同意，簽署知情同意書后采集夫妻雙方及先證者外周靜脈血樣本2ml。發(fā)現(xiàn)突變后，孕母于孕19周在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)抽取胎兒羊水5ml用于基因檢測(cè)。

1.2.2 基因組DNA 提取羊水5ml用2000 rpm離心10min，丟棄上清留取羊水細(xì)胞待用。取外周血全血200μl及羊水細(xì)胞，使用Qiagen DNA Blood Mini Kit提取試劑盒(Qiagen公司，德國(guó))提取基因組DNA，按照試劑盒的操作說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取操作。

1.2.3 高通量外顯子基因檢測(cè) 提取的父母子家系DNA送廣州嘉檢醫(yī)學(xué)檢測(cè)公司進(jìn)行醫(yī)學(xué)外顯子(與人類疾病相關(guān)的4000個(gè)基因)基因測(cè)序，測(cè)序范圍包括50 902個(gè)編碼區(qū)總共含有8 591 731個(gè)堿基，包含外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)。平均覆蓋深度 221+/-140×，大于 10×覆蓋區(qū)間占99.7%，大于20×覆蓋區(qū)間占99.2%。

1.2.4 疑似新發(fā)突變的一代測(cè)序驗(yàn)證 針對(duì)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的疑似致病位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增后Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果分析 一代測(cè)序的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)，確定二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)的疑似致病突變。參考序列數(shù)據(jù)來(lái)自UCSC Genome Browser(http:∥genome.ucsc.edu)數(shù)據(jù)庫(kù)，序列版本號(hào)：GRCh38/hg38。

1.2.6 產(chǎn)前診斷 告知疑似致病突變的臨床意義，經(jīng)家屬知情同意后，用一代測(cè)序的方法進(jìn)行胎兒產(chǎn)前診斷。

2 結(jié)果

2.1 高通量外顯子基因檢測(cè)結(jié)果 父母子核心家系醫(yī)學(xué)外顯測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者及先證者父親ANK1基因存在一個(gè)剪切位點(diǎn)的雜合突變：c.4381+1delG(NM_001142446.2)，母親未發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)(圖1)。

圖1 先證者家系的高通量測(cè)序結(jié)果(ANK1基因?yàn)榉戳x鏈編碼基因)

2.2 一代測(cè)序驗(yàn)證和產(chǎn)前診斷結(jié)果 Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，先證者、先證者父親和胎兒該位點(diǎn)均為雜合。先證者父母經(jīng)考慮后決定保留胎兒，后順利分娩一女孩，目前5月齡，截至該文撰稿時(shí)血常規(guī)檢查未發(fā)現(xiàn)異常情況(圖2)。

2.3 突變位點(diǎn)致病性分析

2.3.1 人群頻率 c.4381+1delG雜合位點(diǎn)，未見中國(guó)人群頻率數(shù)據(jù)庫(kù)收錄(https:∥diseasedx.virgilbio.com/search?search=8:41688155Cdel&version=38)，提示人群頻率較低，屬于罕見變異，排除多態(tài)性可能。

2.3.2 軟件預(yù)測(cè) 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)提示可能影響剪切功能，分析預(yù)測(cè)值如圖3。

圖3 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3.3 保守性分析 c.4381+1delG雜合(NM_000037)在物種間高度保守(圖4)。

圖4 c.4381+1位點(diǎn)物種間保守型分析(ANK1基因?yàn)榉戳x鏈編碼基因)

3 討論

紅細(xì)胞膜組成成分包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖，胞膜蛋白主要由跨膜蛋白和外周錨蛋白組成。ANK1基因編碼外周錨蛋白，HS的發(fā)病原因與ANK1基因突變導(dǎo)致錨蛋白異常有關(guān)，研究報(bào)道的ANK1基因突變有幾十種[7,8]，突變導(dǎo)致HS的臨床表現(xiàn)型也各不相同。ANK1基因位于8號(hào)染色體p11.2區(qū)域，42個(gè)外顯子共編碼1881個(gè)氨基酸[9]，具有不同的轉(zhuǎn)錄本。錨蛋白是紅細(xì)胞膜蛋白的重要組成成分，主要功能是維持紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。錨蛋白缺陷或者其他異常會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞膜不穩(wěn)定，紅細(xì)胞形狀改變成球形[10]，容易發(fā)生破裂。本研究中先證者高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)ANK1基因存在c.4381+1delG雜合突變，遺傳自父親，該突變點(diǎn)位于經(jīng)典的剪切位點(diǎn)上，軟件預(yù)測(cè)可以導(dǎo)致mRNA產(chǎn)生新的剪切位點(diǎn)，影響野生蛋白結(jié)構(gòu)。該突變位點(diǎn)國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，結(jié)合先證者病史和臨床表現(xiàn)，考慮該突變位點(diǎn)為疑似致病性突變。

HS的臨床表現(xiàn)主要為不同程度的溶血性貧血、黃疸、脾腫大、紅細(xì)胞球型改變、紅細(xì)胞滲透脆性增加，HS的臨床表現(xiàn)型差異較大，有的僅僅表現(xiàn)為輕微的貧血，容易漏診或者誤診[11]。本研究中的先證者出生后發(fā)現(xiàn)有貧血癥狀，血紅蛋白在70～110g/L左右波動(dòng)，伴有黃疸。膽囊有多發(fā)小結(jié)石，脾腫大(厚35mm，斜徑106mm，肋下15mm)，檢測(cè)結(jié)果排除了G6PD和地中海貧血。實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)間接膽紅素升高(58.5μmol/L)，紅細(xì)胞生存時(shí)間降低，網(wǎng)織紅比例增加，紅細(xì)胞滲透脆性增加，抗堿血紅蛋白輕度升高3.25%。骨髓穿刺無(wú)異常，血涂片并未見到球形紅細(xì)胞改變，不屬于典型的HS表現(xiàn)，提示該突變位點(diǎn)對(duì)錨蛋白的功能影響可能不是高度破壞性的，至少在維持紅細(xì)胞的形態(tài)上沒(méi)有明顯的功能損害，推測(cè)可能與突變位置有關(guān)，該突變位點(diǎn)位于cDNA的后1/4區(qū)域，剪切位點(diǎn)，發(fā)生改變，從而影響了之后7個(gè)外顯子的翻譯，該蛋白的主要功能區(qū)位于第1～827位氨基酸的89 kDa結(jié)構(gòu)域、第1234～1362位氨基酸的UPA結(jié)構(gòu)域和第1383～1881位氨基酸的55 kDa調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，本家系突變位于55 kDa調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域區(qū)域，剪切后產(chǎn)生新的氨基酸序列，未能完全破壞該蛋白功能，可能是導(dǎo)致先證者有紅細(xì)胞滲透脆性的增加但并無(wú)球形紅細(xì)胞典型表現(xiàn)的遺傳學(xué)因素。先證者父親外周血檢測(cè)僅提示平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度MCHC值偏高(356g/L)，血涂片無(wú)異常，臨床表現(xiàn)明顯輕于先證者。這種表現(xiàn)型的差異，可能與個(gè)體之間不同的遺傳背景相關(guān)，提示可能存在基因之間的相互作用關(guān)系。產(chǎn)前診斷提示胎兒也存在該位點(diǎn)突變，但家屬經(jīng)過(guò)考慮后決定繼續(xù)妊娠，后正常分娩一女嬰，目前血常規(guī)檢查未提示有異常情況，需要進(jìn)一步隨訪觀察。

本研究發(fā)現(xiàn)的HS患者，由于其沒(méi)有典型的球形紅細(xì)胞改變，父親只有輕度HS相關(guān)的臨床表型，臨床診斷容易漏診或者誤診。通過(guò)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該家系A(chǔ)NK1基因1個(gè)未見報(bào)道的剪切突變位點(diǎn)，且家系臨床表型差異較大，豐富了ANK1基因的突變譜，同時(shí)提示該突變存在表現(xiàn)型差異，為臨床診斷提供新的遺傳學(xué)證據(jù)。