TMEM67基因突變所致的Joubert綜合征一家系及臨床遺傳學分析

李陳 魏然 王逾男 何薇 趙馨 丁紅珂 楊朝湘 盧建 尹愛華*

(1.廣東省婦幼保健院 醫(yī)學遺傳中心，廣東 廣州 510010；2.廣東省婦幼保健院 醫(yī)學影像科，廣東 廣州 510010)

Joubert綜合征(MIM213300)是一種罕見的以小腦蚓部發(fā)育不良(中-后腦畸形)伴發(fā)作性呼吸過度、眼球運動障礙、共濟失調(diào)和智力低下為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性遺傳病，也常與腎臟及肝臟等內(nèi)臟發(fā)育異常相關[1]。Joubert綜合征的主要遺傳方式為常染色體隱性遺傳，少部分為X連鎖隱性遺傳。它的典型神經(jīng)影像學表現(xiàn)為“磨牙征”[2]。Joubert綜合征的發(fā)病率低，在活產(chǎn)兒中約為1/100 000～1/80 000[3]。由于Joubert綜合征存在臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性及致病基因的不明確性，Sanger測序不適用于Joubert綜合征的基因診斷。在二代測序技術(next-generation sequencing，NGS)的推動下，全外顯子高通量測序技術發(fā)展迅速，NGS可以通過反復測序同一區(qū)域的DNA片段，達到很高的靈敏度和準確度，同時能在很短的時間內(nèi)完成上百億堿基的測序，效率高，為基因組分析提供了新的方法[4]。本研究利用全外顯子高通量測序技術對一Joubert綜合征家系進行突變基因檢測，并對檢測到的突變位點進行Sanger測序驗證，不僅成功鑒定了一種導致Joubert綜合征的新突變，豐富了Joubert綜合征的病因信息，同時為罕見疾病的產(chǎn)前診斷及臨床確診提供了一套可行的新方法。

1 材料與方法

1.1 病歷資料 穆某某，40歲，因“外院超聲發(fā)現(xiàn)胎頭變形、雙腎增大、羊水過少”于廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診。既往史：G5P1A3，既往3次均因“胎兒雙腎異常、羊水過少”引產(chǎn)，引產(chǎn)后未行進一步檢查。自然流產(chǎn)1次，2006年剖宮產(chǎn)一女嬰，健存?，F(xiàn)為第5次懷孕，2015年11月11日本院Ⅲ級超聲提示：孕25+周，胎兒雙側(cè)多囊腎聲像，嚴重羊水過少，Dandy-Walker變異型(圖1)。本院MRI提示：胎兒小腦蚓部顯示不明確，軸位上中腦層面可見“臼齒征”，雙側(cè)小腦上腳增粗；第四腦室增寬擴大，并與后顱窩池相通。多擬Joubert綜合征畸形改變(圖2)。雙側(cè)側(cè)腦室及后顱窩池輕度增寬，雙側(cè)嬰兒型多囊腎，羊水過少。入院診斷：①胎兒異常；②羊水過少；③遺傳咨詢(不良孕產(chǎn)史)；④高齡孕產(chǎn)婦妊娠監(jiān)督；⑤瘢痕子宮。本研究家系既往無遺傳病家族史，非近親婚配，夫婦雙方均體健。經(jīng)遺傳咨詢，夫妻雙方知情選擇行產(chǎn)前診斷(羊水)，行胎兒染色體分析、微陣列分析及全外顯子測序檢查；夫婦雙方同時行外周血染色體測序分析，測序結(jié)果均經(jīng)Sanger測序驗證。測序及Sanger驗證結(jié)果顯示存在致病基因位點，夫婦雙方要求引產(chǎn)并行胎兒尸檢。本研究家系既往無遺傳病家族史，非近親婚配，夫妻雙方均體健。本研究獲得了廣東省婦幼保健院機構(gòu)審查委員會及廣州醫(yī)科大學倫理委員會的批準。所有樣品的采集均取得了參與者的書面知情同意書。

圖1胎兒Ⅲ級超聲圖像(左圖：腦部Dandy-Walker變異型；右圖：多囊腎)

圖2 胎兒頭顱磁共振圖像(小腦蚓部“臼齒征”)

1.2 實驗方法

1.2.1 羊水及外周血DNA提取 用QIAGEN公司基因組DNA提取試劑盒QIAGEN DNA Blood Mini Kit按試劑盒說明書提取羊水及外周血DNA，使用Nanodrop2000超微量分光光度計進行提取DNA的定量。

1.2.2 羊水培養(yǎng)及染色體核型分析 常規(guī)操作進行羊水細胞原位培養(yǎng)、收獲、制片和G顯帶，全自動掃描儀掃描、拍照。按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2009)標準進行G顯帶染色體核型分析診斷。必要時加做C顯帶、N顯帶；

1.2.3 羊水染色體微陣列分析及QF-PCR分析 羊水DNA使用Agilent公司生產(chǎn)的的芯片進行全基因組掃描檢測，數(shù)據(jù)分析參照DECIPHER、ISCA、0MIM、DGV、UCSC等數(shù)據(jù)庫。胎兒取材母血DNA污染鑒定結(jié)果：D13S305、D18S978、D21S11等11個STR位點測序分析提示無母體DNA污染。

1.2.4 羊水DNA二代測序 定制羅氏NimbleGen全外顯子捕獲探針對全外顯子區(qū)域DNA捕獲并富集，使用illumina HiSeq2500(Illumina, SanDiego，CA，USA)進行高通量測序。數(shù)據(jù)分析：①基本信息分析：去接頭污染，去低質(zhì)量后進行原始數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計；②使用BWA比對軟件，將數(shù)據(jù)與參考序列進行比對統(tǒng)計；③根據(jù)測序深度、突變質(zhì)量，對檢測得到的SNP進行過濾篩選，得到高質(zhì)量可靠的突變譜；④篩選出的變異對蛋白功能影響的預測：使用sIFT、Plovphen-2、Mutation Taster等基于同源比對，蛋白結(jié)構(gòu)的保守性等的算法，預測篩選出的變異對蛋白質(zhì)的影響。

1.2.5 Sanger測序 根據(jù)高通量測序結(jié)果用Sanger測序?qū)ρ蛩毎鸇NA及父母外周血DNA進行突變位點的檢測和驗證。采用Primer5軟件設計引物，擴增TMEM67基因第12個外顯子序列。引物序列為：TMEM67-E12F：GGGATAAACAAGGTAGTATAAAGACATT，TMEM67-E12R：GGG-TCTAAGTCCACCAGCAAT。PCR擴增條件為：95℃5 min，95℃30 s、，58℃30 s，72℃5min、，72℃30 s，共進行38個循環(huán)反應。

2 結(jié)果

2.1 臍血染色體核型與染色體微陣列分析 胎兒羊水染色體及微陣列分析未見異常。

2.2 二代測序結(jié)果分析 胎兒臍血測序及Sanger驗證結(jié)果顯示：TMEM67基因第12個外顯子上發(fā)生了雙重錯義突變，位點分別為c.1175C>G及c.1250A>G。其中c.1175C>G來源于父親，c.1250A>G 來源于母親 (圖3)。Mutation Taster根據(jù)遺傳方式及家系中分布情況推測該位點為疾病相關變異，相關數(shù)據(jù)庫及文獻未見報道。TMEM67基因突變與Joubert綜合征6型相關，為常染色體隱性遺傳。臨床主要表現(xiàn)為精神運動發(fā)育遲緩、小腦蚓部發(fā)育不良引起的共濟失調(diào)、腎囊腫、視網(wǎng)膜發(fā)育不良等。

圖3 TMEM67基因Sanger測序峰圖A、B.胎兒臍血TMEM67基因；C.母方外周血TMEM67基因；D.父方外周血TMEM67基因

2.3 引產(chǎn)后胎兒尸檢結(jié)果分析 引產(chǎn)后胎兒尸檢結(jié)果提示：胎兒小腦蚓部完全缺如，心臟室間隔缺損，雙腎發(fā)育不良伴多囊腎。符合胎兒Joubert綜合征，符合產(chǎn)前診斷的結(jié)果。

3 討論

Joubert綜合征(Joubert syndrome，JBTS，213300)是一種常染色體隱性遺傳病，以小腦蚓部發(fā)育不全為特征，伴有低張力、發(fā)育遲緩、呼吸模式異常和眼球運動異常。枕葉腦膨出和多指畸形偶有報道。臨床上Brancati等人[5]將Joubert綜合征是否合并其他異常分為6型，即單純型Joubert綜合征、Joubert綜合征合并眼部異常、Joubert綜合征合并腎臟異常、Joubert綜合征合并眼腎異常、Joubert綜合征合并肝臟異常、Joubert綜合征合并口面指畸形。目前遺傳學上根據(jù)致病基因不同又將Joubert綜合征分為35種，TMEM67基因異常導致的Joubert綜合征屬于基因分型JBST6型，約占Joubert綜合征的6%～10%[6]。

本文我們描述了一對非近親婚配的夫婦，共懷過4次產(chǎn)前超聲異常的胎兒。前三胎均在外院行產(chǎn)前檢查，提示有“雙腎增大、羊水過少”，未行染色體及基因檢測。第5胎在本院產(chǎn)前超聲診斷為腦部Dandy-Walker變異型及雙側(cè)多囊腎聲像、嚴重羊水過少，胎兒腦部MRI見特征性“臼齒征”，懷疑Joubert綜合征。當產(chǎn)前超聲及MRI發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常時我們首選染色體核型及微陣列技術檢測，因此本文中進行了羊水核型及微陣列檢測，結(jié)果均為正常。同時根據(jù)胎兒特征性Joubert綜合征可疑腦部異常征象，我們進行了羊水全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)了一種TMEM67基因的新型雙重雜合突變(c.1175C>G及c.1250A>G)，且這兩種雜合突變分別遺傳自父母，同時表型正常的大女兒僅為雜合子。這兩種雜合突變類型均未被報道過，且此兩個變異位點均可引起編碼氨基酸的改變。結(jié)合該病遺傳特性、受檢胎兒臨床資料及家系基因檢測結(jié)果，強烈提示兩個變異位點為疾病相關變異[7]。因此，我們考慮TMEM67基因的雙重雜合突變(c.1175C>G及c.1250A>G)為異常胎兒的致病原因。

基因TMEM67(NC_000008.11)位于染色體8q21.13-q22.1位置，全長約12.67Mb，由Smith[8]2006年在大鼠中發(fā)現(xiàn)。人TMEM67基因編碼一種由995個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，稱為Meckelin蛋白，蛋白質(zhì)量約108KD，與大鼠Meckelin蛋白有84%的同源性。2007年Baala等人[9]首次在一個近親家庭中發(fā)現(xiàn)TMEM67基因異常導致的JBST6，這個家庭兩次妊娠都因“超聲發(fā)現(xiàn)胎兒后顱窩異常及腎臟”增大于孕晚期引產(chǎn)，夫婦雙方攜帶了兩種不同的TMEM67基因突變并遺傳給胎兒。后Dawe等人[10]2007年利用原位雜交技術在人類胚胎中發(fā)現(xiàn)，Meckelin蛋白在腎、肝、視網(wǎng)膜、后腦、蝶骨和腦中線均有表達。在發(fā)育中的肢體軟骨中也有很強的表達，尤其是在指(趾)軟骨中。同時他們利用免疫組化技術發(fā)現(xiàn)，18～20周齡人胎兒腎臟在近端腎小管上皮細胞中檢測到中等至高表達的Meckelin蛋白。

TMEM67基因缺陷可導致多種綜合征，包括RHYNS 綜合征、COACH 綜合征，Joubert綜合征6型(JBST6)，Meckel-Bruber綜合征3型(MKS3)，Bardet-Biedl綜合征14型等。由TMEM67基因異常導致的JBST6型往往伴有視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良與腎臟異常。2009年Otto等人[11]在120例無血緣關系JBST患者中發(fā)現(xiàn)4例(3.3%)為TMEM67突變引起。4例患者均有共濟失調(diào)、低張力或精神運動遲緩或小腦蚓部發(fā)育不良。且4例患者均在8～15歲期間出現(xiàn)終末期腎病、肝纖維化，同時也有眼部受累，包括失明、視網(wǎng)膜退行性變或視網(wǎng)膜色素瘤。2013年Du E等人[12]研究表明，TMEM67基因可通過激活ERK和JNK依賴的信號通路導致腎臟疾病的發(fā)生。本文中胎兒出現(xiàn)的主要表現(xiàn)為典型的JBST表現(xiàn)腦部“臼齒征”及腎臟異常改變，符合TMEM67基因異常引起的JBST6型特征。

通過二代測序技術，我們發(fā)現(xiàn)了疾病相關的異常基因改變。隨著基因技術的發(fā)展，產(chǎn)前診斷越來越多地采用更先進的分子遺傳學檢測技術，如CMA和NGS。2018年，ISPD SMFM和PQF就基因測序用于胎兒診斷發(fā)表了聯(lián)合聲明，內(nèi)容包括：對于CMA等公認檢測方法無法提供有效信息的胎兒，目前可采用測序診斷技術進行胎兒評估[13]。與該聲明一致，我們首先采用染色體核型和CMA輔助產(chǎn)前診斷，最終通過二代測序技術確認了TMEM67的新發(fā)復合雜合突變?yōu)橹虏≡?。本文表明二代測序技術是對產(chǎn)前診斷十分有幫助和有效的檢查，特別是對于臨床鑒別診斷模糊的胎兒。為NGS應用于產(chǎn)前診斷的適用性提供了有力證據(jù)。同時，此TMEM67的復合雜合突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)且與JBST6相關，這不僅幫助家庭確定和避免未來妊娠的復發(fā)風險，同時更對這種罕見疾病提供了更多的基因診斷信息和有更深刻的了解。

綜上所述，我們利用二代測序技術首次發(fā)現(xiàn)了一種TMEM67新發(fā)復合突變(c.1175C>G合并c.1250A>G)，并且根據(jù)基因檢測結(jié)果及基因型-表型分析，確認此突變?yōu)樯衔乃黾蚁档倪z傳學病因。后我們的研究表明，二代測序技術是一個能夠有助于診斷胎兒產(chǎn)前超聲檢查異常的遺傳學病因的有效技術。在成功找到遺傳學病因后，可在下一次生育實現(xiàn)妊娠早期產(chǎn)前診斷及知情選擇PGD有效避免罕見遺傳病的發(fā)生。同時我們發(fā)現(xiàn)了Joubert綜合征的一種新發(fā)復合突變，豐富了Joubert綜合征的基因信息。