基于色譜法與質(zhì)譜法分析唾液酸的衍生方法的研究進(jìn)展

張啟偉, 鄭 琦

(江漢大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 交叉學(xué)科研究院, 光電化學(xué)材料與器件教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430056)

唾液酸(sialic acids)是神經(jīng)氨酸(neuraminic acid)的N-或O-取代衍生物,擁有相同的9碳核心結(jié)構(gòu),在自然界中已發(fā)現(xiàn)60余種[1,2]。神經(jīng)氨酸的N-或O-取代主要發(fā)生在C4、C5、C7、C8、C9位置,其中依據(jù)C5位置取代基團(tuán)的不同,唾液酸被分成3大類,即N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid, NeuAc)、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid, NeuGc)和酮基-脫氧壬酮糖酸(2-keto-3-deoxynononic acid, KDN);發(fā)生在其他位置的取代基團(tuán)主要包括乙?；?、磺酸基、乳?；⒓谆土姿峄萚3,4]。3種結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的唾液酸如圖1所示,其他唾液酸均為此3種唾液酸的衍生物。

圖1 唾液酸的基本結(jié)構(gòu)

唾液酸大量存在于包括人體和各種脊椎動(dòng)物體內(nèi),也存在于部分無(wú)脊椎動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中[3,5-9]。唾液酸有著廣泛的生物功能,可參與到細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞黏附與分化、神經(jīng)發(fā)育與記憶形成、腸道微生態(tài)平衡等生理過(guò)程;與此同時(shí),也與炎癥、癌癥、傳染病、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫疾病等病理性活動(dòng)密切相關(guān)[10-14]。為了深入理解唾液酸的生物功能,糖組學(xué)領(lǐng)域的科研工作者經(jīng)過(guò)幾十年的努力,陸續(xù)建立了多種表征分析方法。

以色譜法與質(zhì)譜法為核心的檢測(cè)技術(shù),是當(dāng)前唾液酸表征分析研究中最主要且應(yīng)用最廣泛的方法[15-17]。然而在通過(guò)色譜法、質(zhì)譜法分析天然唾液酸時(shí),經(jīng)常遭遇檢測(cè)靈敏度低、結(jié)構(gòu)易被破壞、色譜分離度差等問(wèn)題,因此在樣品前處理過(guò)程中,通常需要將唾液酸衍生化。衍生化的優(yōu)勢(shì)包括提高檢測(cè)靈敏度,穩(wěn)定唾液酸結(jié)構(gòu),增強(qiáng)色譜分離度,改變碎片化模式,強(qiáng)化結(jié)構(gòu)特征等。本文將重點(diǎn)對(duì)用于色譜與質(zhì)譜分析唾液酸的衍生方法進(jìn)行歸納和總結(jié),并展望該領(lǐng)域的應(yīng)用前景及發(fā)展趨勢(shì)等。

生物體內(nèi)的唾液酸,一部分以游離的形式存在;另一部分則經(jīng)常作為糖綴合物(glycoconjugates)的組成結(jié)構(gòu),以多種方式連接于其末端[18,19]。這使得關(guān)于唾液酸的色譜與質(zhì)譜分析方法大體上可分成4個(gè)層次,即單糖水平、寡糖水平、糖肽水平和糖蛋白水平。目前而言,在糖肽及糖蛋白等高水平上表征唾液酸仍然面臨極大困難,因而大部分衍生方法主要應(yīng)用于單糖與寡糖水平上。本文將從單糖、游離唾液酸、N/O-聚糖、糖脂等4個(gè)層面總結(jié)唾液酸的衍生方法。

1 單糖水平的唾液酸衍生方法

1.1 鄰苯二胺類試劑

連接于糖綴合物上的唾液酸能夠通過(guò)酸解、酶解等方法被解離[20,21]。解離后,唾液酸分子中的α-酮基-羧基能夠與鄰苯二胺類試劑的氨基發(fā)生反應(yīng),從而形成一種喹喔啉衍生物(見(jiàn)圖2)。在水溶液中,唾液酸能夠以α-吡喃糖、β-吡喃糖、非環(huán)狀酮等多種形式存在(以β-吡喃糖形式為主)[22]。而上述衍生方法的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)生成的喹喔啉衍生物能夠消除端基異構(gòu)體,防止單一結(jié)構(gòu)在色譜分離時(shí)因異頭碳而產(chǎn)生多色譜峰。因衍生物具有熒光效應(yīng),故此方法常用于唾液酸的液相色譜-熒光檢測(cè)分析中[15]。與此同時(shí),衍生后的唾液酸能夠呈現(xiàn)出更好的色譜分離度和質(zhì)譜電離效率,使得其在唾液酸的液相色譜-質(zhì)譜分析中也有較為廣泛的應(yīng)用[3,15,23]。

圖2 唾液酸與鄰苯二胺反應(yīng)生成喹喔啉衍生物的示意圖

已報(bào)道的鄰苯二胺類試劑主要包括鄰苯二胺(o-phenylenediamine, OPD)、3,4-二氨基甲苯(3,4-diaminotoluene, DAT)、1,2-二氨基-4,5-二甲氧基苯(1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzene, DDB)、4,5-二甲基-1,2-苯二胺(4,5-dimethylbenzene-1,2-diamine, DMBA)、4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine, DMB)等(見(jiàn)圖2)[24-28]。其中,DMB因具有熒光信號(hào)強(qiáng)、能夠顯著提高色譜分離度等優(yōu)勢(shì),成為在單糖水平上衍生唾液酸的首選衍生試劑[15],相關(guān)方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成商業(yè)化試劑盒。相較于DMB,其他鄰苯二胺類試劑具有價(jià)格低廉、易獲得同位素標(biāo)記物等優(yōu)勢(shì),同樣具有重要的應(yīng)用價(jià)值。值得注意的是,此類試劑也可以和其他α-酮酸發(fā)生反應(yīng),例如α-酮戊二酸、丙酮酸、對(duì)羥基苯丙酮酸等。因此在對(duì)生物樣品進(jìn)行直接衍生分析時(shí)需要注意信號(hào)干擾等問(wèn)題[15]。

鄰苯二胺類試劑衍生的唾液酸在串聯(lián)質(zhì)譜分析中能夠產(chǎn)生特征性碎片離子。以被DMB衍生的唾液酸為例,其可以產(chǎn)生m/z313、295、283、229等碎片離子,有利于唾液酸的鑒別[3,29]。此類試劑衍生的唾液酸,即便含有不同的修飾基團(tuán),其碎片化模式依然非常相似,難以通過(guò)質(zhì)譜有效辨別不同結(jié)構(gòu)。因而在鑒定同分異構(gòu)體、修飾基團(tuán)的連接位置等方面，此方法應(yīng)用性不強(qiáng)。

鄰苯二胺類試劑衍生方法的主要缺陷有兩點(diǎn):樣品濃度會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這意味著衍生過(guò)程伴隨著未知的副反應(yīng);同一條件對(duì)不同唾液酸的衍生效率并不完全相同,存在衍生歧視的風(fēng)險(xiǎn)[28,30-32]。這些問(wèn)題導(dǎo)致此類試劑在唾液酸混合物的定量分析研究中存在局限性。

圖3 苯胺類試劑衍生唾液酸的示意圖

1.2 苯胺類試劑

標(biāo)記唾液酸的代表性苯胺類試劑為2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone, AMAC),其通過(guò)還原胺化作用與唾液酸的α-酮基發(fā)生反應(yīng)[33,34]。然而,常規(guī)的還原胺化反應(yīng)條件易引起脫羧作用,從而導(dǎo)致生成大量相對(duì)分子質(zhì)量減少44的產(chǎn)物,即衍生后的樣品中既包含完整產(chǎn)物,也存在中性丟失產(chǎn)物(見(jiàn)圖3),嚴(yán)重制約了此方法的應(yīng)用。為了盡可能提高產(chǎn)物的單一性,Szabo等[34]通過(guò)改變反應(yīng)條件以提高脫羧作用發(fā)生的概率,從而只生成中性丟失產(chǎn)物。除AMAC外,7-氨基萘-1,3-二磺酸(7-aminonaphtalene-1,3-disulfonic acid)、4-氨基苯磺酸(4-aminobenzene sulfonic acid)等苯胺類試劑也已被用于衍生唾液酸。不同之處在于,這些試劑的磺酸基具有強(qiáng)負(fù)電荷屬性,主要用于毛細(xì)管電泳以及負(fù)離子模式下的質(zhì)譜分析[35,36]。

1.3 甲基化試劑

在強(qiáng)堿性條件下,通過(guò)碘甲烷(methyl iodide)將分子中羥基、羧基、氨基上的氫原子用甲基取代,是最早建立的唾液酸衍生方法之一[37],一般稱之為全甲基化方法。全甲基化方法自建立后又多次被優(yōu)化,目前仍然是衍生寡糖的重要方法之一[16]。另一類甲基化方法則先衍生羧基,然后再衍生羥基等其他基團(tuán)。例如,在用氯化氫的甲醇溶液將羧基甲基化后,可以通過(guò)乙酸酐吡啶溶液(acetic anhydride pyridine)、雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide)等試劑將唾液酸分子乙?；蚬柰榛痆38,39]。但是自鄰苯二胺類試劑被廣泛應(yīng)用后,上述方法已較少用于單糖水平上的唾液酸分析,而且苛刻的反應(yīng)條件易破壞唾液酸的某些修飾基團(tuán)[40],進(jìn)一步限制了相關(guān)方法的應(yīng)用。

另有一種兩步衍生方法，先用重氮甲烷(diazomethane)衍生羧基后，再用七氟丁酸(heptafluorobutyric acid)衍生羥基。該反應(yīng)的生成物既可以保留唾液酸的修飾基團(tuán)(如乙?；⒓谆?,又可在氣相色譜-質(zhì)譜分析中產(chǎn)生特征性碎片離子,有利于鑒定修飾基團(tuán)的連接位置以及同分異構(gòu)體等[41,42]。此方法具有反應(yīng)速率高且生成物穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),但由于重氮甲烷存在不穩(wěn)定性和高危險(xiǎn)性,使其應(yīng)用受到了限制。

1.4 烷基胺類試劑

苯胺類試劑主要和唾液酸的α-酮基發(fā)生反應(yīng),而烷基胺類試劑則通常被用于衍生羧基,已報(bào)道的試劑包括十七氟癸胺(heptadecafluoroundecylamine, HFUA)、4-(N,N-二甲基氨基)-7-(2-氨基乙基氨基)-2,1,3-苯并惡二唑(4-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-7-(2-aminoethylamino)-2,1,3-benzoxadiazole)、4-(N,N-二甲基氨基)-7-哌嗪子基-2,1,3-苯并惡二唑(4-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazole)等[43-45]。此類試劑能夠同時(shí)衍生唾液酸及其氧化產(chǎn)物,例如NeuAc及其氧化產(chǎn)物4-(乙酰氨基)-2,4-二脫氧-D-甘油-D-半乳糖辛酸(4-(acetylamino)-2,4-dideoxy-D-glycero-D-galacto-octonic acid, ADOA)可以用于評(píng)估生物體遭受的氧化壓力等[44]。以HFUA為代表的含氟衍生試劑,因其衍生物可以特異性地保留在含氟固定相的色譜柱上,并與樣品中的其他非氟組分分離,故而能夠有效減少液相色譜以及LC-MS分析中的干擾信號(hào)[45]。

與苯胺類試劑相似,烷基胺類試劑無(wú)法消除端基異構(gòu)體,使得單一唾液酸易形成多個(gè)色譜峰,大大增加了色譜圖的復(fù)雜性[45]。先消除端基異構(gòu)體再衍生唾液酸是一種可行的方案。已有文獻(xiàn)[46]報(bào)道,唾液酸能夠被雙氧水氧化從而轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬?duì)分子質(zhì)量減少28的產(chǎn)物,即ADOA,此產(chǎn)物無(wú)端基異構(gòu)體,或許可以在胺類試劑衍生唾液酸的研究中發(fā)揮重要作用。

2 游離唾液酸的衍生方法

糖綴合物上的唾液酸在衍生反應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)生解離,從而干擾游離唾液酸的定量分析,而使用苯二胺類試劑衍生游離唾液酸的關(guān)鍵在于選擇合適的反應(yīng)條件以抑制解離的發(fā)生。最常用的鄰苯二胺類試劑是DMB,典型的衍生條件是在酸性環(huán)境下保持50 ℃恒溫2.5 h;改變條件至4 ℃并延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至48 h,即可有效衍生樣品中游離的唾液酸[18]。DMBA也可以通過(guò)類似方法抑制解離并衍生游離的唾液酸[47]。

上述方法現(xiàn)已成為分析游離唾液酸的常規(guī)策略,除此之外,近些年也有其他方法被報(bào)道[27,48]。氯化氫的正丁醇溶液可以直接衍生游離唾液酸,此反應(yīng)在無(wú)水條件下進(jìn)行以抑制糖綴合物上的唾液酸發(fā)生解離[48]。先從樣品中分離游離的唾液酸,再進(jìn)行衍生化處理,這也是一種有效的分析策略[27,49]。雖然此方法操作復(fù)雜,但適用性更廣泛。采取簡(jiǎn)化前處理的方式,通過(guò)在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜分析也可以直接分析游離的唾液酸[50]。

3 在N/O-聚糖水平上的唾液酸衍生方法

寡糖是一種由幾個(gè)至幾十個(gè)單糖單元聚合而成的碳水化合物,經(jīng)常作為糖綴合物的重要組成部分通過(guò)多種途徑參與生物體的生理功能。一般而言,可以將寡糖分為4大類:N-聚糖(N-glycan)、O-聚糖(O-glycan)、糖胺聚糖(glycosaminoglycan)和糖脂(glycosphingolipid)[51]。其中,糖胺聚糖很少被唾液酸化(sialylation),目前僅在硫酸角質(zhì)素(keratan sulfate)中發(fā)現(xiàn)了此現(xiàn)象[52-54];其他寡糖則經(jīng)常發(fā)生唾液酸化。因此,本文不討論糖胺聚糖,僅從N-聚糖、O-聚糖和糖脂的層面總結(jié)在寡糖水平上的唾液酸衍生方法。

N-聚糖連接于蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基上,O-聚糖主要連接于蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基上,二者結(jié)構(gòu)較為相似,衍生方法基本可以通用。在N/O-聚糖水平上的唾液酸衍生方法,除至今仍被廣泛使用的全甲基化外,近些年來(lái)又相繼發(fā)展了以醇類、胺類試劑為核心的方法[16]。已有較為全面的文獻(xiàn)[16,55]總結(jié)了這些方法的原理,本文僅從衍生試劑的角度歸納并補(bǔ)充相關(guān)內(nèi)容。

3.1 醇類試劑

在有偶聯(lián)劑存在的情況下,甲醇/乙醇能夠與唾液酸的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)[56,57]。該反應(yīng)對(duì)連接位置不同的唾液酸具有很高的選擇性。如前文所述,唾液酸經(jīng)常連接于糖蛋白的末端,且與糖鏈的連接方式也較為多樣化,尤以α2,3-與α2,6-連接最為常見(jiàn)。其中,以α2,6-連接的唾液酸的羧基能夠與醇類衍生試劑發(fā)生酯化反應(yīng);以α2,3-連接的唾液酸則能夠與相鄰的單糖殘基(通常是半乳糖)發(fā)生縮合反應(yīng),生成內(nèi)酯。衍生反應(yīng)的高選擇性使得糖鏈產(chǎn)生結(jié)構(gòu)差異與相對(duì)分子質(zhì)量差異,有利于在色譜與質(zhì)譜分析中鑒定唾液酸的連接方式。以甲醇衍生為例,如果糖鏈中存在α2,6-連接的唾液酸,則相對(duì)分子質(zhì)量增加14(見(jiàn)圖4a);如果糖鏈中存在α2,3-連接的唾液酸,則相對(duì)分子質(zhì)量減少18(見(jiàn)圖4b)[57]。此類方法通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量差異鑒別不同連接方式的唾液酸,一般稱之為“連接特異性”(linkage-specific)衍生方法。

圖4 唾液酸的連接特異性衍生示意圖

3.2 胺類試劑

與醇類試劑相似,以甲胺、二甲胺、異丙胺等為代表的胺類試劑也可以在無(wú)水條件下與α2,3-、α2,6-連接的唾液酸發(fā)生特異性反應(yīng)。其中,α2,6-連接的唾液酸發(fā)生羧基酰胺化反應(yīng);α2,3-連接的唾液酸發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng),通過(guò)質(zhì)譜分析衍生后的糖鏈就可以鑒定唾液酸的連接方式[58,59]。截至目前,已經(jīng)被用于連接特異性衍生的試劑有10余種,不同試劑的衍生效果存在一些差異性,以異丙胺的特異性最高[59]。值得注意的是,連接特異性的衍生方法主要適用于樣品中僅含有α2,3-與α2,6-連接的唾液酸,而對(duì)于α2,8-連接的結(jié)構(gòu),其能與相鄰?fù)僖核岬牧u基發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng)(見(jiàn)圖4c),模式與α2,3-連接的唾液酸較為相似[60]。

α2,3-連接的唾液酸形成的內(nèi)酯穩(wěn)定性不高,連接特異性的衍生方法被進(jìn)一步優(yōu)化,通過(guò)兩步反應(yīng)依次衍生α2,6-與α2,3-連接的唾液酸。在第一步反應(yīng)中,α2,6-連接的唾液酸被酯化或胺化,α2,3-連接的唾液酸被內(nèi)酯化;在第二步反應(yīng)中,內(nèi)酯化的唾液酸開(kāi)環(huán)后被其他胺類試劑繼續(xù)衍生[59,61]。兩步反應(yīng)既保證了衍生產(chǎn)物的特異性,也增強(qiáng)了其穩(wěn)定性,逐漸成為表征酸性N/O-聚糖的常用方法之一。

胺類試劑的特異性衍生作用通常在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑存在的情況下發(fā)生。若改變反應(yīng)條件則可以消除這種特異性,例如,在1-羥基苯并三唑不存在的情況下,甲胺、甲苯胺可以同時(shí)胺化α2,3-、α2,6-和α2,8-連接的唾液酸[60,62,63]

3.3 肼類試劑

與胺類試劑相似,肼類試劑也可以與唾液酸的羧基發(fā)生縮合反應(yīng),生成酰肼衍生物。事實(shí)上,已有多種肼類試劑被用于衍生寡糖的還原端,但用于衍生唾液酸的試劑仍然不多,主要為乙酰肼(acetohydrazide)[40]。另一種肼衍生方法則是由羥基在強(qiáng)氧化劑作用下生成的酮基與肼類試劑發(fā)生反應(yīng)[64]。當(dāng)氧化劑高碘酸鈉的濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí),寡糖的末端殘基均可與肼反應(yīng);若降低高碘酸鈉的濃度至1 mmol/L,則只有糖鏈末端的唾液酸殘基與肼反應(yīng),通過(guò)此方法可以選擇性富集唾液酸化的糖肽[15,65]。

4 在糖脂水平上的唾液酸衍生方法

糖脂是一類由寡糖與脂類共價(jià)連接而成的糖綴合物,部分糖脂的糖鏈末端含有唾液酸殘基,以神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)最為典型。神經(jīng)節(jié)苷脂大量存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,參與眾多生理過(guò)程,并在一些疾病中發(fā)揮重要作用[6,66]。一般而言,通過(guò)質(zhì)譜的負(fù)離子模式可以直接分析唾液酸化的糖脂[67,68],不過(guò),因衍生后的糖脂在提高色譜分離度以及穩(wěn)定唾液酸殘基等方面具有一些優(yōu)勢(shì),故衍生化方法在相關(guān)研究中也有較為廣泛的應(yīng)用。

4.1 甲基化試劑

全甲基化方法于20世紀(jì)60年代已被用于衍生糖脂,現(xiàn)如今仍然是重要的糖脂衍生方法之一[66,69,70]。常規(guī)的全甲基化方法會(huì)掩蓋天然分子中的甲基化修飾,研究者采用氘代碘甲烷衍生神經(jīng)節(jié)苷脂,并在藍(lán)指海星(Linckialaevigata)中發(fā)現(xiàn)了C8位置存在天然甲基化修飾的唾液酸[71]。全甲基化衍生一般需要在強(qiáng)堿性試劑(如氫氧化鈉)存在的情況下發(fā)生;若改變反應(yīng)條件,取消強(qiáng)堿性試劑,則碘甲烷主要與唾液酸的羧基反應(yīng)生成甲酯類物質(zhì)[72,73]。類似地,3-甲基-1-對(duì)甲苯基三氮(3-methyl-1-p-tolyltriazene)可以代替碘甲烷完成羧基的甲基化反應(yīng)[74,75]。相對(duì)于全甲基化方法而言,甲基化的反應(yīng)條件較為溫和,有利于抑制唾液酸殘基上的修飾基團(tuán)被破壞。值得注意的是,甲基化方法主要衍生α2,3-與α2,6-連接的唾液酸,而α2,8-連接的唾液酸易在反應(yīng)過(guò)程中被內(nèi)酯化[60],通過(guò)此現(xiàn)象應(yīng)當(dāng)可以特異性地鑒別α2,8-連接的結(jié)構(gòu)。

4.2 胺類試劑

近些年來(lái),胺化反應(yīng)逐漸被引入到唾液酸化糖脂的色譜與質(zhì)譜分析中。胺化試劑與羧基發(fā)生縮合反應(yīng)后能夠?qū)⑺嵝曰鶊F(tuán)中性化,有利于穩(wěn)定唾液酸殘基。糖脂被2-(2-吡啶胺)乙胺(2-(2-pyridilamino)ethylamine)衍生后,一方面能夠產(chǎn)生熒光從而便于通過(guò)液相色譜-熒光檢測(cè)方法分析;另一方面也可以改變二級(jí)質(zhì)譜的碎片化模式,有利于簡(jiǎn)化譜圖。對(duì)于烷基胺類試劑而言,其在無(wú)水條件下可以衍生唾液酸。而最近一項(xiàng)研究[60]表明,甲胺、乙胺等試劑在水溶液中依然可以高效率衍生唾液酸化糖脂;與之相對(duì),異丙胺、二甲胺等試劑在相同條件下卻幾乎不與羧基反應(yīng)。連接特異性的衍生方法也適用于糖脂,其中,α2,6-連接的唾液酸發(fā)生羧基酰胺化反應(yīng);α2,3-與α2,8-連接的唾液酸發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng),而內(nèi)酯化的唾液酸在開(kāi)環(huán)后可以繼續(xù)被其他胺類試劑衍生[60]。

在1 mmol/L高碘酸鈉存在的情況下,唾液酸殘基的C7與C8鍵斷開(kāi)后生成酮基,生成的酮基可被胺類試劑進(jìn)一步衍生,近期文獻(xiàn)[76]報(bào)道了一種基于此操作的同整質(zhì)量標(biāo)記(isobaric tag)[77]唾液酸化糖脂的方法。串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag)通常被用于標(biāo)記多肽、N/O-聚糖的還原端[78,79],上述方法則創(chuàng)新性地將其拓展應(yīng)用于標(biāo)記糖脂。不過(guò),此方法會(huì)破壞唾液酸殘基的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致關(guān)鍵的生物學(xué)信息被丟失。

5 結(jié)論與展望

經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展,研究者們已經(jīng)建立了多種唾液酸衍生方法,以便增強(qiáng)對(duì)其生物功能的認(rèn)識(shí)。但開(kāi)發(fā)新的衍生方法與檢測(cè)技術(shù)仍然是當(dāng)前糖生物學(xué)領(lǐng)域的重要話題與關(guān)鍵任務(wù)。

單糖水平上的唾液酸衍生方法應(yīng)當(dāng)致力于解決如下幾個(gè)問(wèn)題:第一,減少副反應(yīng)的發(fā)生;第二,消除目標(biāo)分子的端基異構(gòu)體等;第三,增強(qiáng)修飾基團(tuán)的連接位點(diǎn)與同分異構(gòu)體鑒別能力;第四,發(fā)展同位素標(biāo)記等相對(duì)定量分析技術(shù)。N/O-聚糖水平上的唾液酸衍生方法相對(duì)成熟,當(dāng)前主要面臨色譜分離度與檢測(cè)靈敏度不能滿足需求的問(wèn)題,以及相關(guān)方法沒(méi)有得到規(guī)范化應(yīng)用等問(wèn)題。糖脂水平上的衍生技術(shù)則需要考慮:第一,建立能夠改善待測(cè)分析物分子的碎片化模式的方法;第二,將N/O-聚糖衍生方法推廣到本領(lǐng)域內(nèi);第三,建立溫和的同位素標(biāo)記方法。