固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂產(chǎn)品中10種頭孢類藥物

章 豪, 吳銀良, 張宜文, 許秀琴, 徐 峰

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(寧波), 浙江 寧波 315040;2.北京市計(jì)量檢測(cè)科學(xué)研究院, 北京 100012)

頭孢類藥物屬于廣譜抗生素,臨診應(yīng)用的頭孢類藥物均為半合成物質(zhì),殺菌力強(qiáng),較青霉素類穩(wěn)定,目前已發(fā)展到第五代[1]。然而過(guò)量使用頭孢類藥物會(huì)對(duì)人體健康帶來(lái)潛在的危害,對(duì)兒童、老人,特別是胎兒的影響更大,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致胎兒病變、畸形、流產(chǎn)甚至死亡[2,3]。由于細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性和過(guò)敏反應(yīng)等原因,目前我國(guó)已制定了頭孢類藥物的最高殘留限量:頭孢氨芐在牛肌肉、肝、腎、脂肪和奶中的最高限量分別為200、200、1 000、200和100 μg/kg;頭孢喹肟在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪和牛奶中的最高限量分別為50、100、200、50和20 μg/kg;頭孢噻呋在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪、牛奶中的限量分別為100、200、600和200 μg/kg,其中頭孢噻呋的殘留量以其代謝產(chǎn)物呋喃甲?；^孢噻呋檢測(cè)含量計(jì)算[4]。但目前頭孢類藥物在蜂產(chǎn)品中暫無(wú)限量規(guī)定。

目前對(duì)包括頭孢類藥物在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析的方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[5-18]、高效液相色譜法(HPLC)[19-24]、毛細(xì)管電泳法[25,26]和微生物法[27]。20世紀(jì)90年代以后,絕大多數(shù)生物有機(jī)體中的β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析采用液相色譜進(jìn)行測(cè)定。然而使用液相色譜法測(cè)定時(shí)存在的主要問(wèn)題是未經(jīng)衍生化測(cè)定時(shí),基體干擾較大;而經(jīng)衍生化測(cè)定后靈敏度雖有所提高,但也只能作為一種篩選方法進(jìn)行使用,對(duì)于分析多種頭孢類藥物仍存在極大難度。而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)是一種集多組分定性、定量和高效分離于一體的系統(tǒng),用于分析蜂產(chǎn)品中頭孢類藥物不僅能夠顯著提高方法的靈敏度和定性的準(zhǔn)確度,而且能夠降低前處理的成本和工作量[28]。而不論是采用HPLC還是UPLC-MS/MS方法測(cè)定,通常都采用固相萃取小柱進(jìn)行樣品的凈化和富集[6,8,13]。根據(jù)頭孢類藥物的相關(guān)報(bào)道[29,30],考慮到藥物的理化特性,前處理中凈化一般選用Oasis HLB固相萃取小柱,且凈化過(guò)程往往需要活化、淋洗和洗脫等費(fèi)時(shí)費(fèi)力的步驟。近來(lái),Oasis PRIME HLB固相萃取小柱簡(jiǎn)單快速的通過(guò)式凈化方案被用于快速有效地去除食品基質(zhì)中的各種主要干擾物,包括脂肪、磷脂以及色素等[28]。Oasis PRIME HLB固相萃取小柱省去傳統(tǒng)的活化、平衡步驟,樣品經(jīng)提取后直接過(guò)柱,這種樣品凈化方法簡(jiǎn)單、快速、有效,適合大批量日常分析檢測(cè),但目前并未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱用于蜂產(chǎn)品抗生素的樣品前處理。

本研究采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱,通過(guò)對(duì)樣品前處理方法和儀器條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了基于UPLC-MS/MS測(cè)定3類主要蜂產(chǎn)品(蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉)中頭孢類藥物殘留的分析方法。該方法檢測(cè)周期短,準(zhǔn)確度和精密度高,能滿足多種蜂產(chǎn)品樣品中頭孢類藥物的檢測(cè)需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC XevoTMTQ-S micro超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(ESI)及MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司);低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); Vortex Genie 3漩渦振蕩器(德國(guó)IKA公司)。

頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(頭孢匹林、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢乙腈、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟、去乙酰基頭孢匹林、頭孢噻肟,純度均大于95%,德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司);甲酸(色譜純,美國(guó)Tedia公司);乙腈、甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司); Oasis PRIME HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL,美國(guó)Waters公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取適量(精確至0.1 mg)10種頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用30%(v/v)乙腈水溶液溶解,配制質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃ 保存；分別準(zhǔn)確吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于100 mL容量瓶中,用30%(v/v)乙腈水溶液稀釋,配制質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃保存。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液：采用1.2.2節(jié)樣品處理方法制備空白蜂產(chǎn)品樣品溶液,稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2樣品處理

稱取蜂蜜樣品約5.00 g、蜂王漿樣品約2.50 g、蜂王漿凍干粉樣品約1.00 g(精確至0.01 g),分別置于50 mL離心管中,分別加入乙腈-水(80∶20, v/v)溶液20 mL,渦旋振蕩1 min。蜂蜜樣品直接移取溶液,蜂王漿、蜂王漿凍干粉樣品以9 500 r/min高速離心5 min,移取上清液至Oasis PRIME HLB固相萃取小柱,收集全部流出液,流出液在40 ℃下氮?dú)獯蹈?用1 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇(95∶5, v/v)溶液溶解,渦旋振蕩,過(guò)0.22 μm濾膜,用于UPLC-MS/MS分析。

1.2.3色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為甲醇;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～4.5 min, 5%B～50%B; 4.5～6.0 min, 50%B; 6.0～6.1 min, 50%B～5%B; 6.1～7.5 min, 5%B;流速0.30 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件

多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM); ESI源正離子模式電離;脫溶劑氣流速:1 000 L/h;錐孔氣流速:50 L/h;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;毛細(xì)管電壓:2.0 kV; RF透鏡電壓:0.5 V;萃取錐孔電壓:25 V;頭孢類藥物的相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

基于LC-MS/MS測(cè)定頭孢類藥物殘留大多采用ESI源正離子模式電離的分析方法[5-18]。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水(5∶95, v/v)溶液分別配制10種頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0 mg/L),利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀自帶的Intellistart軟件分別獲得10種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量(見(jiàn)表1),發(fā)現(xiàn)它們?cè)谡x子模式下均獲得了較好的響應(yīng)。

表1 10種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量

* Quantitative ion.

本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈和甲醇作為色譜流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)頭孢類藥物的分離效果,發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用乙腈作為有機(jī)相時(shí),頭孢哌酮、頭孢乙腈等頭孢類藥物的響應(yīng)較差,而采用甲醇作為有機(jī)相時(shí),10種藥物的響應(yīng)均較好,因此確定甲醇為有機(jī)相。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

生物樣品中頭孢類藥物的常用溶劑有甲醇[5]、甲醇-水[9]和乙腈-水[5,6,13]等。因蜂產(chǎn)品特別是蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品中通常含有蛋白質(zhì)和磷脂類物質(zhì),用甲醇或甲醇-水溶解時(shí)樣液較混濁,需進(jìn)一步凈化去除蛋白質(zhì)。而用乙腈溶解時(shí),因蛋白質(zhì)變性沉淀,溶解后雜質(zhì)少,且溶劑澄清,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,目前用于動(dòng)物性食品溶解的乙腈溶液中乙腈含量均高于60%[5,12,19],因此本研究使用乙腈、乙腈-水(80∶20, v/v)和乙腈-水(60∶40, v/v)3種溶劑對(duì)蜂產(chǎn)品在200 μg/kg加標(biāo)水平下進(jìn)行溶解上樣,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水(60∶40, v/v)上樣時(shí),不能使所有頭孢類藥物的回收率達(dá)到75%以上;而采用乙腈-水(80∶20, v/v)上樣時(shí),所有頭孢類藥物的回收率均大于75%;采用乙腈上樣時(shí),所有頭孢類藥物的回收率大于75%,但考慮到乙腈的強(qiáng)洗脫能力,樣品以及小柱中所含的雜質(zhì)也會(huì)一起被洗脫下來(lái),失去了過(guò)柱凈化的目的,因此確定以乙腈-水(80∶20, v/v)進(jìn)行溶解上樣。

2.3 固相萃取小柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)對(duì)Oasis PRIME HLB和Oasis HLB兩款固相萃取小柱進(jìn)行了比較。我們?cè)诜洚a(chǎn)品中選取最為主要的蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉3類基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn),從每一類基質(zhì)中選取代表樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn),其中,蜂蜜中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林3種頭孢類藥物的添加水平為4、20、200 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加水平為1、20、200 μg/kg;蜂王漿中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林3種藥物的添加水平為8、40、200 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加水平為2、20、200 μg/kg;蜂王漿凍干粉中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林3種藥物的添加水平為20、50、200 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加水平為5、50、200 μg/kg。結(jié)果表明,樣品采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化后的回收率(75.0%～89.8%)均優(yōu)于采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化的結(jié)果(60.0%～71.0%)。結(jié)果還顯示,在無(wú)需活化、淋洗和洗脫等復(fù)雜的步驟下,樣品采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化后,無(wú)論是在回收率還是基質(zhì)干擾方面,均優(yōu)于采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化的結(jié)果。這可能是因?yàn)閷?duì)于蜂產(chǎn)品特別是蜂王漿和蜂王漿凍干粉中的磷脂和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),相比Oasis HLB固相萃取小柱,Oasis PRIME HLB固相萃取小柱可以更好地吸附這些雜質(zhì),不僅無(wú)需活化、淋洗和洗脫等這些費(fèi)時(shí)費(fèi)力的前處理步驟,在顯著縮短凈化時(shí)間的同時(shí)還能延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命[31,32]。因此本實(shí)驗(yàn)采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱作為凈化小柱。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

基質(zhì)效應(yīng)主要是由于樣品在離子化時(shí)基質(zhì)成分與目標(biāo)化合物相互競(jìng)爭(zhēng)電離所致,包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。在UPLC-MS/MS定性定量分析中,基質(zhì)效應(yīng)會(huì)對(duì)儀器的靈敏度和重復(fù)性產(chǎn)生影響,進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)采用(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%的計(jì)算方法對(duì)10種頭孢類藥物在蜂產(chǎn)品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察。當(dāng)結(jié)果大于100%時(shí)表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),小于100%時(shí)表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng),結(jié)果越接近100%基質(zhì)效應(yīng)越小。由表2可以看出,蜂產(chǎn)品有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)作用,10種頭孢類藥物均存在不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。為了能更準(zhǔn)確地測(cè)定目標(biāo)化合物,本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)。采用蜂產(chǎn)品空白基質(zhì)液配制1～1 000 μg/L橫跨3個(gè)數(shù)量級(jí)的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(其中頭孢乙腈、頭孢哌酮和頭孢唑林為5～1 000 μg/L)進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定分析,以峰面積對(duì)相應(yīng)質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2),如表2所示。10種頭孢類藥物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的r2均大于0.999,線性關(guān)系良好。按3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算,10種頭孢類藥物的檢出限(LOD)為0.15～1.5 μg/kg;按S/N=10計(jì)算,10種頭孢類藥物的定量限(LOQ)為0.50～5.0 μg/kg。農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定頭孢喹肟、頭孢氨芐在動(dòng)物性食品中的最大殘留限量為20～1 000 μg/kg,而本方法檢出限低至0.15～1.5 μg/kg,因此能滿足蜂產(chǎn)品中頭孢類藥物含量分析的需要。

表2 10種頭孢類藥物在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

表2 (續(xù))

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 回收率與精密度

選取蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉3類基質(zhì)進(jìn)行添加回收試驗(yàn),計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表3。頭孢類藥物在蜂蜜空白樣品中的加標(biāo)MRM色譜圖見(jiàn)圖1。蜂蜜中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林的添加量為4 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加量為1 μg/kg,每批次同一水平5個(gè)平行樣品,重復(fù)測(cè)定3次。

由表3可知,10種頭孢類藥物的加標(biāo)回收率為75.0%～89.8%,RSD為1.4%～4.6%。上述結(jié)果表明,該方法對(duì)測(cè)定蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉中10種頭孢類藥物的殘留均具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 10種頭孢類藥物在蜂蜜、蜂王漿、蜂王漿凍干粉中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

表3 (續(xù))

圖1 蜂蜜加標(biāo)樣品的MRM色譜圖

2.6 方法應(yīng)用

采用優(yōu)化后的儀器條件和前處理?xiàng)l件分別對(duì)隨機(jī)采集的50個(gè)蜂產(chǎn)品(含蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉)樣品進(jìn)行分析,均未檢出上述10種頭孢類藥物。我們參照GB/T 22942-2008《蜂蜜中頭孢唑啉、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了復(fù)測(cè),結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本工作建立了同時(shí)分析蜂產(chǎn)品中10種頭孢類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,樣品經(jīng)乙腈-水(80∶20, v/v)溶液提取后離心,上清液經(jīng)Oasis PRIME HLB固相萃取柱凈化,氮吹后復(fù)溶進(jìn)樣分析。方法具有精密度和準(zhǔn)確度高、檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn),能滿足蜂產(chǎn)品中10種頭孢類藥物含量分析的需要。