超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中苯海索

楊雨菲, 夏云燕, 吳 莎, 鄒巧根*

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院, 江蘇 南京 211816; 2.南京工業(yè)大學藥學院, 江蘇 南京 211816)

苯海索(C20H31NO, trihexyphenidyl),化學名為(±)-α-環(huán)己基-α-苯基-1-哌啶丙醇。苯海索為抗膽堿能藥物,通過抑制黑質(zhì)-紋狀體內(nèi)膽堿能神經(jīng)活性抑制副交感神經(jīng),用于緩解運動障礙、震顫等癥狀。苯海索通常被用于帕金森病的治療,臨床研究[1,2]顯示,單獨使用苯海索能夠顯著降低帕金森癥狀的發(fā)生,并且不良反應(yīng)相對較少。苯海索還可用于精神疾病的治療及輔助治療[3],可用于減緩精神分裂癥陰性癥狀、精神障礙、靜坐不能、流涎和撤藥等癥狀。有臨床研究[4]將苯海索與抗精神病藥物(包括氯氮平、維思通、奮乃靜、喹硫平、氯丙嗪和氟哌啶醇)聯(lián)用，用于減輕或預防由抗精神病藥物引起的錐體外系不良反應(yīng)。苯海索還可用于治療腦性癱瘓肌張力障礙[5],療效良好的同時無嚴重不良反應(yīng)。

基于苯海索熔沸點較低的性質(zhì),早期對于苯海索的體內(nèi)檢測多利用氣相色譜偶聯(lián)不同檢測器進行定量分析[6],也有通過液相色譜-質(zhì)譜法[7]和放射性免疫分析法[8]對苯海索進行定量檢測。目前對于苯海索血漿樣品的前處理方法主要采用液液萃取法和固相萃取法。液液萃取法常用的萃取劑為乙酸乙酯[7]、乙酸乙酯-正己烷(1∶3, v/v)[9]、環(huán)己烷[10]、庚烷[11]和苯-乙酸乙酯(1∶1, v/v)[12]等。固相萃取法利用Sep-Pak C18固相萃取柱[11]、Isolute HCX-5 (100 mg)混合模式固相萃取柱[13]提取樣品。有報道表明，生物樣本分析采用區(qū)別于傳統(tǒng)前處理方法的手段，包括利用新體系對樣品進行萃取[14]、衍生化前處理[15]等。針對苯海索體內(nèi)研究的新方向包括利用新型電極碳糊電極(CPE)對苯海索片劑及尿液樣本進行檢測[16]。此外,利用鈰(IV)(Ce(IV))或高錳酸鉀(KMnO4)在酸性介質(zhì)中誘導銅納米團簇(CuNCs)化學發(fā)光(CL)的方法也被用于苯海索的定量檢測[17]。通過對血漿[7-11,17]、血清[18]、全血[6,12]、頭發(fā)[19]和尿液樣本[10,13,16]的檢測,可對苯海索進行臨床用藥監(jiān)測和藥代動力學研究等。

現(xiàn)有的對于苯海索血漿樣品的檢測方法仍存在前處理方法繁瑣耗時、檢測分析時間長、不適用于大批量樣品檢測等問題,因而有必要開發(fā)一種簡便快捷、靈敏、適用于高通量分析的方法,以滿足人血漿中苯海索定量分析的檢測要求。

本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定人血漿中苯海索含量的方法。采用以甲醇為沉淀劑的蛋白質(zhì)沉淀前處理方法,提取過程快速簡便且回收率高,靈敏度良好。應(yīng)用本方法考察了空腹及餐后健康受試者的藥代動力學行為,并進行了生物等效性評價。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜儀配有LC-30AD液相色譜泵、DGU-20A5R脫氣機、CTO-20AC柱溫箱和SIL-30ACMP自動進樣器(Shimadzu公司,日本); API5500型三重四極桿質(zhì)譜儀、Turbo Spray離子源(Applied Biosytems/Sciex公司,美國); XP6微量天平(Mettler Toledo公司,瑞士); Heraeus Muitifuge X1R離心機(Thermo Fisher公司,美國); Milli DirectQ純水儀(Millipore公司,美國)。

鹽酸苯海索對照品(純度100%,批號:1.2)購自法國European Pharmacopoeia公司;鹽酸苯海索-d11(純度98.0%,批號:13-YSW-162-1)購自加拿大TRC公司。鹽酸苯海索片受試制劑(2 mg,批號:1806001)購自天津力生制藥有限公司;鹽酸苯海索片參比制劑(2 mg,批號:1257989M)購自美國Watson公司。乙腈和甲醇購自德國Merck公司;甲酸和醋酸銨購自阿拉丁公司;異丙醇購自永華化學科技江蘇有限公司,以上試劑均為色譜級。超純水為實驗室純水儀自制。

1.2 標準溶液的配制

稱取適量鹽酸苯海索對照品,用甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的標準儲備液,于2～8 ℃保存;用乙腈-水(30∶70, v/v)配制質(zhì)量濃度為2.00、4.00、20.0、40.0、100、300、700和800 ng/mL的標準工作溶液和質(zhì)量濃度為2.00、5.00、40.0和600 ng/mL的質(zhì)控樣品工作溶液。

稱取適量鹽酸苯海索-d11對照品,經(jīng)過質(zhì)量校正系數(shù)進行校正,用甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的內(nèi)標儲備液,于2～8 ℃保存;用乙腈-水(30∶70, v/v)稀釋至25 ng/mL,作為內(nèi)標工作液。

1.3 血漿樣品前處理

向96孔板中加入50 μL血漿樣品,然后加入10 μL 25.0 ng/mL內(nèi)標工作溶液和10 μL 100 mmol/L醋酸銨水溶液,渦旋混勻;加入400 μL甲醇沉淀,振蕩混勻,于4 ℃以4 000 r/min離心5 min;轉(zhuǎn)移100 μL上清液于40 ℃吹干,用300 μL乙腈-水(30∶70, v/v)復溶,進樣分析。

1.4 分析條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C8柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國Waters公司);柱溫:40 ℃;自動進樣器溫度:5 ℃;流速:0.4 mL/min;流動相A:乙腈-水(95∶5, v/v);流動相B: 0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L醋酸銨);進樣量:5 μL。洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序

A: acetonitrile-water (95∶5, v/v); B 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution containing 5 mmol/L ammonium acetate.

離子源:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度(TEM): 550 ℃;離子化電壓(IS): 2 500 V;碰撞氣(CAD)壓力:0.06 MPa;噴霧氣(GS1)壓力:0.4 MPa;輔助加熱氣(GS2)壓力:0.4 MPa。苯海索反應(yīng)檢測離子對為302.3→98.0 (m/z),碰撞電壓(CE)為32 V;苯海索-d11反應(yīng)檢測離子對為313.2→98.1 (m/z), CE為33 V;苯海索及苯海索-d11的去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)和碰撞室出口電壓(CXP)分別為100、10和13 V。苯海索及苯海索d-11的質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 苯海索和苯海索-d11的質(zhì)譜圖

1.5 臨床試驗方案

本次試驗為隨機、自身交叉、兩序列兩周期、設(shè)盲的人體生物等效性試驗。以力生制藥研制的鹽酸苯海索片(2 mg)為受試制劑,以Watson生產(chǎn)的鹽酸苯海索片(2 mg)為參比制劑進行空腹和餐后的單次口服給藥的生物等效性相關(guān)試驗。該臨床試驗在獲得倫理委員會批準后開展進行。相鄰兩周期之間設(shè)置清洗期,時間為14 d。

研究分為兩部分,第一部分為空腹給藥,第二部分為餐后給藥,兩部分各篩選30例受試者。受試者充分了解實驗內(nèi)容后簽署知情同意書。其中空腹試驗中22號受試者因故主動退出,因此未納入生物等效性分析。

試驗每例受試者在每個周期服藥前1 h內(nèi)(記為0 h)及服藥后15、30、45、60、80、100、120和150 min,以及3、4、6、8、12、24、36、48、72、96和120 h采血。所采集的血樣置于含有肝素鈉為抗凝劑的采血管中,采集完成后于1 h內(nèi)于2～8 ℃以4 000 r/min離心10 min,獲得血漿樣品。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

使用WinNonlin 8.0軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)并計算藥代動力學參數(shù),同時對參數(shù)進行統(tǒng)計分析。將達峰濃度(Cmax)、時間從零點到最后一個時間點的血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-t)和時間從零點到無窮大時的血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-∞)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析,并通過計算90%置信區(qū)間的方法對參比制劑和受試制劑進行生物等效性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1線性關(guān)系

取空白血漿950 μL,加入不同濃度的標準工作液50 μL,配制成苯海索質(zhì)量濃度分別為0.100、0.200、1.00、2.00、5.00、15.0、35.0和40.0 ng/mL的血漿樣品,按1.3節(jié)描述進行前處理并進樣分析。在Analyst軟件中積分,以待測物與內(nèi)標峰面積的比值(y)為縱坐標、待測物的血藥濃度(x, ng/mL)為橫坐標進行線性回歸,權(quán)重因子(w)為1/x2。結(jié)果表明,苯海索在0.100～40.0 ng/mL范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 4～0.999 0,線性關(guān)系良好。

圖2 人血漿中苯海索及苯海索-d11的典型提取離子色譜圖

2.1.2準確度和精密度

取空白血漿950 μL,加入不同濃度的質(zhì)控工作液50 μL,配制成定量下限(LLOQ)、低、中、高4個水平(0.100、0.250、2.00和30.0 ng/mL)的質(zhì)控樣品,每個水平各重復6個,按1.3節(jié)方法進行前處理,并連續(xù)測定3批,考察批內(nèi)、批間的準確度和精密度。實驗結(jié)果顯示,批內(nèi)和批間準確度分別為97.9%～115.5%和103.1%～110.5%,批內(nèi)和批間精密度分別為2.5%～10.7%和4.5%～7.8%。表明方法準確度及精密度均良好。

2.1.3選擇性

取6批不同來源的空白血漿,通過1.3節(jié)方法進行前處理(其中內(nèi)標工作液以乙腈-水(30∶70, v/v)代替)后進樣檢測。取空白血漿、定量下限濃度血漿樣品、定量上限(ULOQ)濃度(40.0 ng/mL)的血漿樣品和健康受試者單劑量口服2 mg鹽酸苯海索片1.0 h后的血漿樣品,按1.3節(jié)方法進行前處理(其中含定量上限濃度苯海索的血漿樣品中內(nèi)標工作液用乙腈-水(30∶70, v/v)代替)后進樣檢測,相關(guān)色譜圖見圖2。實驗結(jié)果顯示，不同來源空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對苯海索及苯海索-d11的測定無干擾,同時待測物和內(nèi)標互相不干擾測定。

2.1.4基質(zhì)效應(yīng)

取來自6個受試者的空白基質(zhì),在低、中、高3個水平(0.250、2.00和30.0 ng/mL)下分別計算苯海索及內(nèi)標的基質(zhì)因子,并且計算經(jīng)內(nèi)標歸一化后的基質(zhì)因子?；|(zhì)因子是指在基質(zhì)中待測物的響應(yīng)峰面積與純?nèi)芤褐写郎y物響應(yīng)峰面積的比值,內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子為待測物的基質(zhì)因子與內(nèi)標基質(zhì)因子的比值。結(jié)果顯示,高、中、低3個水平的質(zhì)控樣品經(jīng)內(nèi)標校正后的基質(zhì)因子分別為99.0%、99.0%和101%,表明基質(zhì)效應(yīng)不影響苯海索的定量測定。

以高脂(含300 mg/dL甘油三酯)和溶血(將全血渦旋后加入對應(yīng)體積的空白基質(zhì)中混勻配制成2.0%(v/v)溶血血漿)基質(zhì)配制低水平(0.250 ng/mL)和高水平(30.0 ng/mL)血漿樣品,通過1.3節(jié)方法進行前處理后進樣分析,用于考察高脂和溶血對于樣品檢測的影響。結(jié)果顯示,高脂及溶血均不影響測定方法的準確度和精密度。

2.1.5提取回收率

將低、中、高3個水平(0.250、2.00和30.0 ng/mL)的待測物苯海索樣品進行前處理,與未經(jīng)提取處理的樣品進行比較,考察回收率。結(jié)果表明,低、中、高3個水平血漿樣品中苯海索的提取回收率分別為98.4%、95.2%和94.9%,顯示該蛋白質(zhì)沉淀的前處理方法提取回收率較高。

表2 健康受試者空腹(n=29)及餐后(n=30)服用受試制劑及參比制劑后的主要藥代動力學參數(shù) (mean±SD)

Tmax: time ofCmax;Cmax: maximum plasma concentration; AUC0-t, AUC0-∞: areas under the plasma concentration-time curves from zero to the last measurable concentration or to infinity;t1/2: terminal half-life.

2.1.6穩(wěn)定性

實驗分別考察了低含量(0.250 ng/mL)和高含量(30.0 ng/mL)血漿樣品的凍融穩(wěn)定性、長期儲存穩(wěn)定性、前處理過程中的穩(wěn)定性和全血穩(wěn)定性。取在不同實驗條件下放置的樣品,通過1.3節(jié)前處理方法處理后進樣分析。實驗結(jié)果顯示,血漿樣品于-80 ℃經(jīng)過4次凍融、室溫條件下放置26 h、處理后在進樣室(2～8 ℃)放置7 d、于-80 ℃保存77 d,低濃度質(zhì)控樣品及高濃度血漿樣品對比理論值的相對誤差為-4.6%～10.5%,表明在上述條件下苯海索血漿樣品均穩(wěn)定。

配制含待測物的全血樣品,部分全血樣品離心獲得血漿作為零時間點樣品,其余全血樣品在室溫和冰浴條件下分別放置2 h后離心獲得血漿作為全血穩(wěn)定性樣品,將穩(wěn)定性樣品與零時間點樣品經(jīng)過1.3節(jié)樣品前處理后進樣分析,結(jié)果顯示全血樣品冰浴及室溫放置2 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.2 血漿樣品中苯海索的測定

采用上述方法測定健康受試者在空腹和餐后單次給予鹽酸苯海索參比制劑和受試制劑(2 mg)后的血藥濃度,以時間為橫坐標、血藥濃度為縱坐標分別繪制參比制劑和受試制劑在空腹和餐后的苯海索血藥濃度-時間曲線。受試者空腹及餐后單劑量口服鹽酸苯海索片后前24 h平均血藥濃度-時間曲線見圖3。

圖3 受試者空腹及餐后單劑量口服鹽酸苯海索片后前24 h的平均血藥濃度-時間曲線

如表2所示，采用WinNonlin 8.0軟件,選擇非房室模型,按實際采血時間及血藥濃度計算主要藥代動力學參數(shù)。分別將Cmax、AUC0-t和AUC0-∞對數(shù)轉(zhuǎn)換,計算獲得其90%置信區(qū)間?？崭乖囼炛蠧max、AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間為82.2%～99.4%、82.3%～97.3%和83.4%～97.9%,餐后條件下分別為100.8%～122.8%、96.8%～112.4%和96.6%～112.1%,均在80.0%～125.0%范圍內(nèi),表明參比制劑和受試制劑在空腹和餐后條件下吸收速度和吸收程度均無顯著差異,具有生物等效性。

通過對比餐后和空腹試驗結(jié)果,進食對于Cmax起到降低作用,并且達峰時間獲得較大延長。而對于AUC0-t和AUC0-∞并無顯著差異。因此,進食較大地影響了鹽酸苯海索的吸收速度,而對于吸收程度并無較大影響,食物對于苯海索體內(nèi)濃度的波動具有較大影響,參比制劑和受試制劑受食物影響的體內(nèi)行為相似。

3 結(jié)論

本文建立了靈敏、高效、準確的UPLC-MS/MS法定量分析人血漿中的苯海索,并應(yīng)用于空腹和餐后苯海索片人體生物等效性評價。該方法靈敏度高,前處理方法簡便快捷,可應(yīng)用于大批量樣品分析,為仿制藥的質(zhì)量研究和控制提供參考。