離子色譜法測定馬來酸阿法替尼中雜質(zhì)二甲胺的含量

周黎明，尹寧寧，遲雙雙

(1.山東省食品藥品審評認證中心，山東 濟南 250014；2.山東亨利醫(yī)藥科技有限責任公司，山東 濟南 250000)

阿法替尼(Afatinib或BIBW2992)是由德國勃林格殷格翰公司研發(fā)的多靶點抗癌新藥， 2013年7月美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準Giotrif(阿法替尼片)用于表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的晚期(轉(zhuǎn)移性)非小細胞肺癌(NSCL)患者的治療，阿法替尼片劑的主藥成分為阿法替尼馬來酸鹽。Giotrif是酪氨酸激酶(TKI)受體的不可逆抑制劑。它與ErbB家族成員EGFR(ErbB1)、HER2(ErbB1)、ErbB3和ErbB4形成的所有同、異二聚體共價結(jié)合并阻斷信號傳導，受體突變和/或擴增引起的異常ErbB信號傳導和/或受體配體過度表達都可導致惡性表達[1-2]。阿法替尼目前被作為EGFR突變的一線治療藥物[3-7]。EGFR 基因突變可通過FDA 批準的診斷試劑進行檢測[8]。即使EGFR和HER2靶向治療失敗，阿法替尼仍是這一亞組患者的潛在新型治療選擇[5]。

二甲胺是一種低分子有機胺，廣泛存在于自然環(huán)境和水產(chǎn)品中，研究表明，二甲胺是對人體有毒的化合物，對眼和呼吸道有很強的刺激作用。眼睛接觸二甲胺可引起角膜渾濁、損傷，皮膚接觸液態(tài)二甲胺會引起壞死，在一些亞硝基和含硝基化合物存在下二甲胺易形成致癌物質(zhì)N-亞硝基化合物[9]。馬來酸阿法替尼的降解產(chǎn)物中含有二甲胺，為保證用藥安全，需對馬來酸阿法替尼中二甲胺進行限量考察。國內(nèi)外藥典暫未收載阿法替尼及其制劑的質(zhì)量標準，目前測定二甲胺的方法主要有高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、毛細管電泳法及離子色譜(IC)法等[10-13]，各方法均有不同的適用范圍。因此，本文根據(jù)二甲胺的特性，首次建立了IC法測定馬來酸阿法替尼中二甲胺的殘留量的方法，為馬來酸阿法替尼及其制劑的質(zhì)量控制以及評價其質(zhì)量的一致性提供可參考的依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑 Dionex ICS-1600離子色譜儀，電導檢測器； Mettler Toledo XPE205電子天平(十萬分之一)；Mili-Q超純水儀；二甲胺鹽酸鹽(國藥集團化學試劑有限公司，純度≥99.0%)；甲磺酸(阿拉丁，純度≥99.5%)；實驗用水為超純水；銨離子(國家標準物質(zhì)溶液，1.0 g·L-1)；鉀離子(國家標準物質(zhì)溶液，1.0 g·L-1)。

1.2 試驗溶液的配制

1.2.1 對照品溶液的配制 取二甲胺鹽酸鹽對照品約18 mg(相當于二甲胺10 mg)，精密稱定，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置200 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為二甲胺對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的配制 取馬來酸阿法替尼適量(相當于阿法替尼10 mg)，精密稱定，置10 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.3 系統(tǒng)適用性溶液的配制 取二甲胺鹽酸鹽、氯化鉀、氯化銨適量，用水制成每1 mL中約含二甲胺、鉀離子和銨離子各2 μg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

1.3 色譜條件 照離子色譜法(《中國藥典》2015年版0513離子色譜法)測定，用陽離子交換色譜柱(IonPac CG12A，250 mm×4 mm適用)，以10 mmol·L-1甲磺酸溶液為流動相；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測器為電導檢測器，檢測方式為抑制電導檢測，檢測器溫度35 ℃；進樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗 取空白溶劑水、系統(tǒng)適用性溶液，照“1.3”項下色譜條件注入離子色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明各離子間分離度均符合要求(見圖1～2)。

2.2 專屬性試驗 考慮到樣品中的其他常規(guī)離子可能會干擾測定，作者將與二甲胺離子較難分離的Na+、NH4+、K+分別注入離子色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖3。

2.3 線性關(guān)系及范圍試驗 分別配制濃度為0.020 9、0.104 5、0.209 0、0.522 5、1.045、3.135 μg·mL-1的供試品溶液，分別精密量取20 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系試驗結(jié)果

以濃度(C)對峰面積(A)進行線性回歸，得線性回歸曲線方程為：A=91 346C-2 341.2，r=1.00(n=6)。二甲胺溶液的濃度在0.020 9～3.135 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，該線性范圍涵蓋二甲胺檢測標準限度和檢測定量限。

2.4 定量限與檢測限 逐步稀釋對照品溶液(0.522 5 μg·mL-1)，以信噪比約為10∶1，為定量限；以信噪比約為3∶1，為檢測限。試驗結(jié)果表明該方法的定量限為0.4 ng，相當于供試品進樣濃度的0.002%；檢測限為0.16 ng，相當于供試品進樣濃度的0.000 8%。

2.5 重復性 精密稱取馬來酸阿法替尼影響因素試驗(光照10 d，已降解出一定量的二甲胺)樣品適量(相當于阿法替尼10 mg)，精密稱定，置10 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，平行制備6份。精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果二甲胺含量的平均值為0.06%(正常樣品二甲胺含量為0.01)，RSD為0.18%(n=6)，結(jié)果表明方法的重復性良好。

2.6 儀器精密度 精密量取線性供試品溶液(0.522 5 μg·mL-1)20 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進樣6針，峰面積的平均值為43 985，RSD為0.59%(n=6)。

2.7 準確度試驗 供試品貯備液：精密稱取馬來酸阿法替尼741.56 mg(以阿法替尼計約500 mg)，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為貯備液。

二甲胺對照品溶液：精密量取鹽酸二甲胺對照品約18.09 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為二甲胺對照品貯備液；精密量取1 mL，置200 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(濃度約為0.5 μg·mL-1)。

供試品溶液：量取上述二甲胺對照品貯備液(濃度：100.02 μg·mL-1)25.00 mL，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別量取0.80、1.00、1.20 mL各3份，分別置50 mL量瓶中，向其中各加入供試品貯備液10 mL，再加水稀釋至刻度，搖勻，作為回收率供試品溶液。

樣品準確度測定的平均回收率為98.91%，RSD為0.91%(n=9)，結(jié)果見表2，由以上結(jié)果可知該方法的準確度良好，測定方法準確可靠。

2.8 耐用性 精密量取上述“3.1”項下系統(tǒng)適用性溶液20 μL，分別調(diào)整甲磺酸溶液濃度、色譜柱柱溫、流速等條件，依法測定，考察銨離子、鉀離子與二甲胺離子的分離度，結(jié)果見表3。

耐用性試驗結(jié)果表明，流動相的流速、甲磺酸濃度及柱溫在微小范圍內(nèi)變動，對二甲胺及相近離子的測定無影響，表明該方法耐用性良好。

2.9 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(0.500 1 μg·mL-1)，分別于配制后0、2、4、8、16、24 h，精密量取20 μL注入離子色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，結(jié)果供試品溶液中二甲胺離子峰面積在24 h內(nèi)的RSD為1.78%(n=6)，表明供試品溶液24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表2 準確度試驗結(jié)果

表3 耐用性試驗結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 空白溶劑中存在微量鈉離子，可能來源于配制流動相及溶劑過程中的玻璃容器，但不干擾二甲胺離子的檢測。

3.2 本方法通過對二甲胺的專屬性、線性與范圍、精密度及準確度等方法學驗證試驗研究，說明該方法能夠準確可靠地測定馬來酸阿法替尼中雜質(zhì)二甲胺的含量。