同型半胱氨酸通過(guò)YAP 通路調(diào)控大鼠冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞高反應(yīng)性的作用機(jī)制研究

陳玉龍，萬(wàn)招飛，劉小軍，范佳麗，薛嘉虹，王新宏

冠狀動(dòng)脈痙攣指冠狀動(dòng)脈驟然強(qiáng)烈收縮引起血管閉塞或接近閉塞，導(dǎo)致心肌缺血，進(jìn)而引發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣型心絞痛、心肌梗死或猝死等嚴(yán)重心血管事件，目前其發(fā)病率較高［1］。冠狀動(dòng)脈痙攣常突然發(fā)病，不易預(yù)測(cè)［2］，目前研究認(rèn)為冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）高反應(yīng)性是其發(fā)生的關(guān)鍵［3］。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的含硫非必需氨基酸，高Hcy（血Hcy ≥15 μmol）是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。既往研究表明，高Hcy 可作為冠狀動(dòng)脈痙攣型心絞痛的生物學(xué)標(biāo)志物之一［4］；另外，高Hcy 還能誘導(dǎo)小鼠冠狀動(dòng)脈痙攣［5］。但Hcy 引發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣的具體機(jī)制尚不清楚。YAP 是一種調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡的轉(zhuǎn)錄共激活子，由YAP1 基因表達(dá)，是Hippo信號(hào)通路下游的主要效應(yīng)子，因此其表達(dá)水平和功能受Hippo 信號(hào)通路調(diào)控。Hippo 信號(hào)通路被抑制，YAP 從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核并結(jié)合轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控多種生物學(xué)功能［6］。既往研究表明，YAP 激活可導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓［7］。但YAP 在冠狀動(dòng)脈VSMC 高反應(yīng)性中扮演何種角色及相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討Hcy 通過(guò)YAP 通路調(diào)控大鼠冠狀動(dòng)脈VSMC 高反應(yīng)性的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2018 年1—10 月，雄性SD 大鼠均購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量300～350 g，在清潔級(jí)動(dòng)物房單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，保持大鼠生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生，溫度為（24±1）℃，相對(duì)濕度為40%～60%，12 h 光照/黑暗交替。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)步驟經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑 DMT620 微血管張力測(cè)定儀（丹麥DMT 公司生產(chǎn)）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)）、電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司生產(chǎn)）、ChemiDoc XRS 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司生產(chǎn)）；DL-Hcy、內(nèi)皮素1（ET-1）、內(nèi)皮素B 型受體激動(dòng)劑蛇毒類(lèi)似物（sarafotoxin 6c，S6c）、YAP1抑制劑維替泊芬（verteporfin，VP）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；抗β-actin、內(nèi)皮素A 型（ETA）受體、內(nèi) 皮 素B 型（ETB） 受 體、YAP、ERK1/2、mTOR、AMPK、磷 酸 化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷 酸 化mTOR（p-mTOR）、磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體及抗Sirt1抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司或美國(guó)Cell Signaling 公司。

1.3 離體血管環(huán)制備及培養(yǎng) 對(duì)SD 大鼠實(shí)施安樂(lè)死后在無(wú)菌環(huán)境中迅速去除心臟，置于4 ℃標(biāo)準(zhǔn)鈉鹽緩沖液（NaCl 119 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaHCO315 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L）中，緩慢擠壓出心臟殘留血液。在體視顯微鏡下分離出間隔支、對(duì)角支和前降支，置于4 ℃標(biāo)準(zhǔn)鈉鹽緩沖液中，細(xì)金屬絲（40 μm）穿入血管腔去除內(nèi)皮，剝離外膜組織，將血管橫切成長(zhǎng)1.0～1.5 mm 的血管環(huán)。將新鮮的冠狀動(dòng)脈血管環(huán)作為A 組；在37 ℃、5%CO2條件下，將在含青霉素（100 U/L）和鏈霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈血管環(huán)作為B 組，將在Hcy（200 μmol/L）+含青霉素（100 U/L）和鏈霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈血管環(huán)作為C 組，將在VP（1 nmol/L）+含青霉素（100 U/L）和鏈霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈血管環(huán)作為D組，將在Hcy（200 μmol/L）+VP（1 nmol/L）+含青霉素（100 U/L）和鏈霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈血管環(huán)作為E 組；除A 組外冠狀動(dòng)脈血管環(huán)均培養(yǎng)24 h。

1.4 血管收縮張力測(cè)定 在新鮮或培養(yǎng)24 h 的冠狀動(dòng)脈血管環(huán)（去除內(nèi)皮）內(nèi)穿兩根微細(xì)鋼絲，其中一端連接myograph system 傳感器，另一端連接微調(diào)裝置，接入PowerLab 系統(tǒng)持續(xù)記錄血管收縮張力。每個(gè)血管環(huán)給予2 mN 的預(yù)張力后穩(wěn)定1.0～1.5 h，期間每15 min 更換1 次恒溫（37 ℃）的標(biāo)準(zhǔn)鈉鹽緩沖液，血管環(huán)穩(wěn)定后采用高鉀緩沖液（K＋60 mmol/L）檢驗(yàn)血管收縮活性兩次并計(jì)算平均值，將平均值作為ETA受體或ETB受體激動(dòng)劑收縮強(qiáng)度的參照標(biāo)準(zhǔn)，高鉀緩沖液引起的血管收縮張力＞1.0 mN 的血管環(huán)可用于正式實(shí)驗(yàn)。S6c 使用前先采用標(biāo)準(zhǔn)鈉鹽緩沖液稀釋成濃度梯度，以濃度累加法將藥物由最低濃度依次加入浴槽，數(shù)秒內(nèi)引起血管收縮，當(dāng)收縮曲線達(dá)到最高不再繼續(xù)上升時(shí)即加入下一濃度的藥物，所測(cè)累積濃度-反應(yīng)曲線即代表ETB受體誘導(dǎo)的血管收縮情況。待血管張力恢復(fù)基線后（提示ETB受體已完全消耗分解）以同樣的方法加入ET-1，所測(cè)累積濃度-反應(yīng)曲線即代表ETA受體誘導(dǎo)的血管收縮情況。S6c 和ET-1 誘導(dǎo)的血管壓力變化以60 mmol/L K+誘導(dǎo)的血管收縮百分比表示。

1.5 Western blot法 采用Western blot法檢測(cè)ETA受體、ETB受體、YAP 及ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、Sirt1 表達(dá)水平，具體如下:采用細(xì)胞裂解液裂解離體培養(yǎng)血管環(huán)，4 ℃環(huán)境下12 000×g離心20 min，取上清液，嚴(yán)格按照Pierce BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)蛋白表達(dá)，蛋白變性后SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入適當(dāng)濃度的一抗，將膜在4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，洗脫后加入適當(dāng)濃度的二抗，置于37 ℃環(huán)境下孵育60 min，顯色后利用ChemiDoc XRS 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，Quality One 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值，并與內(nèi)參β-actin 比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy 上調(diào)冠狀動(dòng)脈VSMC 的ETA受體、ETB受體、YAP 表達(dá)及其受體介導(dǎo)的血管收縮 Hcy 可增強(qiáng)S6c 和ET-1呈濃度依賴方式介導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈血管收縮，見(jiàn)圖1。A、B、C 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin 及YAP/β-actin 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 值分別為5.516、30.028、40.494，P 值分別為0.044、0.001、＜0.01）；C組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin 及YAP/β-actin 高于A 組和B 組，B組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的ETB受體/β-actin 及YAP/β-actin高于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖2～3）。2.2 VP 抑制由Hcy 上調(diào)冠狀動(dòng)脈VSMC 的ETA受體、ETB受體、YAP 表達(dá)及其受體介導(dǎo)的血管收縮 VP 能有效抑制由Hcy 上調(diào)的S6c 和ET-1 呈濃度依賴方式介導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈血管收縮，見(jiàn)圖4。B、C、D、E 組大鼠冠狀動(dòng)脈血管環(huán)ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin及YAP/β-actin 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 值分別為17.593、109.180、149.356，P 均＜0.01）；C 組大鼠冠狀動(dòng)脈血管環(huán)ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin及YAP/β-actin 高于B、D、E 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖5～6）。

圖1 A、B、C 組S6c、ET-1 誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈血管環(huán)收縮的累積濃度-反應(yīng)曲線Figure 1 Cumulative concentration-reaction curve for vasoconstriction of coronary artery mediated by S6c and ET-1 in groups A，B and C

圖2 A、B、C 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)ETA 受體、ETB 受體及YAP 電泳結(jié)果Figure 2 Electrophoretic results of ETA receptor，ETB receptor and YAP of coronary vascular ring in groups A，B and C

圖3 A、B、C 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)ETA 受體/β-actin、ETB 受體/β-actin 及YAP/β-actin 比較的條形圖Figure 3 Bar charts for comparison of ETA receptor/β-actin，ETB receptor/β-actin and YAP/β-actin of coronary vascular ring in groups A，B and C

2.3 Hcy 上調(diào)冠狀動(dòng)脈VSMC p-ERK1/2和p-mTOR 表達(dá) B、C、D、E 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 值分別為37.903、15.229、24.202、46.071，P 均＜0.01）；C 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR 高 于B、D、E 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)p-ERK1/2/ERK1/2高 于D 組，p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 高于C、D、E 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖7～8）。

3 討論

圖4 B、C、D、E組S6c、ET-1誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈血管環(huán)收縮的累積濃度-反應(yīng)曲線Figure 4 Cumulative concentration-reaction curve for vasoconstriction of coronary artery mediated by S6c and ET-1 in groups B，C，D and E

圖5 B、C、D、E 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)ETA 受體、ETB 受體及YAP 電泳結(jié)果Figure 5 Electrophoretic results of ETA receptor，ETB receptor and YAP of coronary vascular ring in groups B，C，D and E

ET-1 是一種有效的血管收縮因子，能誘導(dǎo)血管持續(xù)且強(qiáng)烈地收縮，其與受體結(jié)合后可發(fā)揮生物學(xué)功能。 ET-1 的受體主要包括ETA受體和ETB受體，正常生理狀態(tài)下ETA受體表達(dá)于VSMC，可介導(dǎo)血管收縮；而ETB受體則表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可通過(guò)釋放一氧化氮和前列腺環(huán)素而介導(dǎo)血管舒張。病理狀態(tài)下，ETB受體僅表達(dá)于VSMC 且呈高表達(dá)狀態(tài)，介導(dǎo)血管強(qiáng)烈收縮，增強(qiáng)VSMC 對(duì)ET-1 的高反應(yīng)性［8］。既往研究表明，心臟缺血再灌注能誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈VSMC 高表達(dá)ETB受體［9］。另外，一些心血管危險(xiǎn)因素如吸煙［10］、微氧化的低密度脂蛋白［11］和大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）［12］等均能上調(diào)冠狀動(dòng)脈VSMC 的ETA和ETB受體表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)血管平滑肌收縮的敏感性，提示冠狀動(dòng)脈VSMC 高反應(yīng)性在冠狀動(dòng)脈痙攣過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，而上調(diào)內(nèi)皮素受體表達(dá)可能是冠狀動(dòng)脈VSMC 高反應(yīng)性的關(guān)鍵原因之一。本研究結(jié)果顯示，Hcy 可增強(qiáng)S6c 和ET-1 呈濃度依賴方式介導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈血管收縮，且C 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin 高于A 組和B 組，B 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的ETB受體/β-actin高于A 組，提示Hcy 通過(guò)上調(diào)內(nèi)皮素受體而增強(qiáng)冠狀動(dòng)脈VSMC 高反應(yīng)性。

圖6 B、C、D、E 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)ETA 受體/β-actin、ETB 受體/β-actin 及YAP/β-actin 比較的條形圖Figure 6 Bar charts for comparison of ETA receptor/β-actin，ETB receptor/β-actin and YAP/β-actin of coronary vascular ring in groups B，C，D and E

圖7 B、C、D、E 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)p-ERK1/2、ERK1/2、p-mTOR、mTOR、p-AMPK、AMPK 及Shirt1 電泳結(jié)果Figure 7 Electrophoretic results of p-ERK1/2，ERK1/2，p-mTOR，mTOR，p-AMPK，AMPK and Shirt1 of coronary vascular ring in groups B，C，D and E

既往研究表明，YAP 是關(guān)鍵的血管生成調(diào)節(jié)因子［13-14］，其激活能促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓發(fā)生［7］。但目前YAP 與冠狀動(dòng)脈VSMC 高反應(yīng)性的關(guān)系尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，C 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的YAP/β-actin 高于A 組和B 組，B 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的YAP/β-actin高于A 組，提示Hcy 能上調(diào)冠狀動(dòng)脈VSMC 的YAP 表達(dá)。為了進(jìn)一步明確YAP 在Hcy 調(diào)控冠狀動(dòng)脈VSMC內(nèi)皮素受體中的作用，本研究通過(guò)阻斷YAP 而觀察Hcy 對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈VSMC 內(nèi)皮素受體表達(dá)及其受體血管收縮的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YAP 抑制劑VP 能有效抑制Hcy 上調(diào)的冠狀動(dòng)脈VSMC 的ETA和ETB受體及其受體介導(dǎo)的血管收縮。前期研究發(fā)現(xiàn)，Hcy 或高糖可通過(guò)ERK1/2、Sirt1、AMPK、mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)調(diào)控VSMC內(nèi)皮素受體［15-17］，那么YAP 能否通過(guò)以上通路影響Hcy 對(duì)冠狀動(dòng)脈VSMC 內(nèi)皮素受體的調(diào)控？本研究結(jié)果顯示，C 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR 高于B、D、E 組；B 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)p-ERK1/2/ERK1/2高 于D 組，p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 高于C、D、E 組，提示YAP 抑制劑僅能抑制由Hcy 上調(diào)的ERK1/2、mTOR 磷酸化表達(dá)，但對(duì)Hcy 下調(diào)的AMPK磷酸化和Sirt1 表達(dá)無(wú)影響，提示ERK1/2和mTOR 信號(hào)通路可能參與YAP 對(duì)內(nèi)皮素受體的調(diào)控。

綜上所述，Hcy 可能通過(guò)YAP 通路激活ERK1/2和mTOR 信號(hào)通路，上調(diào)VSMC 內(nèi)皮素受體，進(jìn)而增強(qiáng)冠狀動(dòng)脈VSMC 高反應(yīng)性，這將為高Hcy 致冠狀動(dòng)脈痙攣的具體作用機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，也為高Hcy 所致缺血性心血管疾病的診斷和臨床研究提供新的線索。

作者貢獻(xiàn)：陳玉龍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；萬(wàn)招飛進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；劉小軍進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；范佳麗進(jìn)行結(jié)果分析與解釋?zhuān)煌跣潞曦?fù)責(zé)撰寫(xiě)論文，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；薛嘉虹進(jìn)行論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

圖8 B、C、D、E 組冠狀動(dòng)脈血管環(huán)p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 比較的條形圖Figure 8 Bar charts for comparison of p-ERK1/2/ERK1/2，p-mTOR/mTOR，p-AMPK/AMPK and Shirt1/β-actin of coronary vascular ring in groups B，C，D and E