食管鱗狀細(xì)胞癌患者microRNA-127-3p的表達(dá)水平及臨床意義

符佳，汪砥，江金瓊，劉勁，段華新

（1.湖南省人民醫(yī)院 腫瘤科，湖南 長沙 410005；2.長沙市中心醫(yī)院 腫瘤科，湖南 長沙 410004）

我國食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）發(fā)病率較高，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1-2]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與諸多分子機(jī)制有關(guān)[3-5]。明確其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，有利于ESCC早期診斷與靶向治療[6]。有研究表明，microRNA（miRNA）與胚胎發(fā)育、器官形成及腫瘤形成關(guān)系密切，其中miR-127-3p與乳腺癌、宮頸癌等腫瘤形成密切相關(guān)[7]。有研究表明SKI基因是miR-127-3p潛在的靶基因，但在ESCC中鮮有報(bào)道[8]。因此，本研究探討ESCC患者癌組織中miR-127-3p及SKI蛋白表達(dá)水平與腫瘤分期、患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年2月—2015年2月于湖南省人民醫(yī)院和長沙市中心醫(yī)院行外科手術(shù)的ESCC患者80例。其中，男性52例，女性28例；平均年齡（57.1±7.6）歲?；颊呔春喜⒂绊懮娴闹卮蠹膊?，術(shù)中取適量切除的癌組織及癌旁組織（距癌組織≥5 cm正常食管上皮組織），放置于液氮中保存。ESCC診斷最終經(jīng)病理證實(shí)且分化程度明確。參照2009年第7版國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[9]，其中Ⅰ期患者22例，Ⅱ期患者31例，Ⅲ期27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均自愿簽署知情同意書，并對(duì)患者隨訪至2018年2月。

1.2 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司），0.25%胰酶（美國Invitrogen公司），ALP活性檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程有限公司），二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國HeraeusHolding公司），Olympus倒置顯微系統(tǒng)（TH4-200，南京天龍光電儀器廠），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀（LightCycler480，德國羅氏診斷有限公司），TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

本研究中使用的ESCC細(xì)胞株Eca109、Kyse150及正常食管上皮細(xì)胞Het-1a均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。由液氮罐中迅速取出凍存的細(xì)胞，37℃水浴鍋解凍，接種于一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25 cm2）中，加入 5 ml DMEM 培養(yǎng)液，放入 37℃培養(yǎng)箱在 5% CO2條件下培養(yǎng)，換液頻率為2 d/次。當(dāng)貼壁細(xì)胞匯合度達(dá)到約90%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代，計(jì)數(shù)細(xì)胞后按1×105個(gè)/ml濃度接種繼續(xù)培養(yǎng)，將傳至第3～5代的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。

1.4 RNA 提取

1.4.1 組織中提取由液氮中取出食管癌患者組織，加入研缽中，迅速磨成粉末狀；取出100 mg新鮮研磨的粉末加入含1 ml Trizol裂解液的EP管中，混合均勻。室溫靜止5 min，加入200μl氯仿，充分混勻后室溫放置 10 min ；4℃、3 500 r/min 離心 15 min，取上層水相，裝于含1.5 ml RNase-free水的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，置于冰上30 min；取出離心管，4℃、3 500r/min 離心 15 min，得到 RNA 沉淀 ；75% 酒精500μl洗滌RNA，沉淀2次，風(fēng)干；加入RNase-free的水50μl，室溫溶解RNA；NanoDrop測(cè)定RNA濃度，置于-20℃條件下備用。

1.4.2 細(xì)胞中提取對(duì)各組細(xì)胞予以 0.25% 胰酶消化，將消化后的細(xì)胞懸液置于15 ml離心管中；在4℃、500 r/min低速離心2 min，棄上清，放置冰上；滴入1 ml Trizol裂解液重懸，混勻細(xì)胞，放置冰上；向Trizol裂解液中加入200μl氯仿，劇烈震蕩細(xì)胞懸液，室溫放置 5～10 min，在 4℃、3 500 r/min 離心 15 min ；取上層水相，裝入含 1.5 ml RNase-free水的離心管中，放入等體積異丙醇，混勻后，放置冰上30～35 min ；在 4℃、3 500 r/min 離心 15 min，獲取RNA沉淀；75%酒精500μl洗滌RNA沉淀2次，風(fēng)干；放入50μl RNase-free水，室溫溶解RNA；NanoDrop測(cè)定RNA濃度，置于-20℃條件下備用。

1.5 qRT-PCR

參考 TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作，對(duì)抽提的RNA進(jìn)行體外逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，得到cDNA產(chǎn)物。反應(yīng)條件：16℃孵育 30 min，42℃孵育 30 min，85℃加熱 5 min，4℃保存。以得到的cDNA為模版，予以qRT-PCR，采用 TaqMan? Universal PCR Master Mix 20 μl反 應(yīng) 體系，在PCR儀上操作，以U6作為表達(dá)檢測(cè)的內(nèi)參，ΔCT表示miR-127-3p的相對(duì)表達(dá)，其中ΔCT=CTU6-CTmiR-127-3p，反應(yīng)條件 ：95℃預(yù)變性 10 min，95 變性15 s，60℃退火 30 s，70℃延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)。見表1。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) SKI蛋白

對(duì)石蠟切片進(jìn)行2次脫蠟過程，對(duì)脫蠟后的組織進(jìn)行酒精梯度清洗：二甲苯孵育5 min，棄去二甲苯，加入新的二甲苯繼續(xù)孵育5 min，無水乙醇洗滌3 min，無水乙醇Ⅱ洗滌3 min，95%乙醇洗滌3 min，80%乙醇洗滌 3 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）洗滌 3次，3 min/次 ；將切片至于含0.01 mmol/L的檸檬酸緩沖液中，對(duì)切片進(jìn)行恢復(fù)，并放入微波爐，加熱15 min，冷卻至室溫；取出石蠟切片，置于含3%雙氧水中10～15 min，以防止內(nèi)源性過氧化物酶對(duì)切片組織的損傷，用1×PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次；按照1∶500加入SKI抗體，對(duì)石蠟組織切片進(jìn)行室溫孵育1 h或者4℃孵育過夜，用1×PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次；按照1∶1 000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，對(duì)石蠟組織切片進(jìn)行室溫孵育40 min，用1×PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次；加入DAB試劑盒中的顯色劑，室溫孵育5～10 min，然后清水沖洗；蘇木精復(fù)染室溫孵育3～5 min，清水沖洗；對(duì)染色后的切片進(jìn)行梯度酒精水化處理，然后樹膠封片觀察。采用上述同樣的操作方法，對(duì)組織切片中的SKI進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。同時(shí)以1×PBS緩沖液為一抗進(jìn)行孵育，作為免疫組織化學(xué)染色的陰性對(duì)照。對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（400倍），計(jì)算SKI蛋白陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)目的比例，陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目＞10%為陽性，＜10%為陰性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各細(xì)胞系中 miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量比較

Het-1a細(xì)胞中miR-127-3p相對(duì)表達(dá)量為（3.04±0.78），Eca109 為（2.38±0.53），Kyse150 為（1.42±0.51），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.506，P=0.000）；Het-1a高 于 Kyse150（P＜0.05），Eca109高于 Kyse150（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各細(xì)胞系中 miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

2.2 食管鱗癌與癌旁組織miR-127-3p相對(duì)表達(dá)量比較

食管鱗癌組織中miR-127-3p相對(duì)表達(dá)量為（0.86±0.23），癌旁組織為（1.84±0.35），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.547，P=0.000），癌組織高于癌旁組織。見圖2。

圖2 食管鱗癌與癌旁組織miR-127-3p相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

2.3 食管鱗癌與癌旁組織 SKI蛋白表達(dá)的比較

患者癌組織及癌旁組織中SKI蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。食管鱗癌中SKI蛋白表達(dá)陽性率為78.75%，陰性率為21.25%，癌旁組織中陽性率為13.75%，陰性率為86.25%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=67.982，P=0.000），癌組織高于癌旁組織。見圖3。

圖3 SKI蛋白光鏡圖（免疫組織化學(xué)×400）

2.4 不同臨床指標(biāo)患者的miR-127-3p低表達(dá)率比較

不同臨床分期患者miR-127-3p低表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ⅲ期高于Ⅱ期和I期。是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和飲酒史患者miR-127-3p低表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和飲酒史患者較高。見表2。

表2 不同臨床指標(biāo)患者的 miR-127-3p 低表達(dá)率比較 %

2.5 食管鱗癌患者 miR-127-3p 的表達(dá)與預(yù)后

42例食管鱗癌患者癌組織miR-127-3p低表達(dá)，38例患者高表達(dá)。20個(gè)月時(shí)miR-127-3p低表達(dá)患者生存率為47.6%，高表達(dá)患者為73.7%，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.946，P=0.026）。miR-127-3p低表達(dá)患者中位無進(jìn)展期（20個(gè)月）短于miR-127-3p高表達(dá)患者（30個(gè)月）。見圖4。

圖4 癌組織中miR-127-3p表達(dá)水平與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

我國食管癌發(fā)病例數(shù)占全球一半以上，為食管癌高發(fā)國家，目前miRNA與食管癌關(guān)系的研究日益深入[10]。miRNA在食管癌中的表達(dá)存在差異，并且能調(diào)節(jié)食管癌的增殖、凋亡、侵襲及遷移等生物學(xué)特性，這些證據(jù)表明miRNA參與食管癌發(fā)生、發(fā)展等病理過程[11-12]。對(duì)miRNA與食管癌關(guān)系的研究，目前主要集中在 miR-21、miR-203、miR-375、miR-106b-25、miR-143及miR-196a等的異常表達(dá)[13]。王江峰等[14]研究結(jié)果提示在84例食管鱗癌組織中，相比于癌旁組織，癌組織中miR-29b低表達(dá)48例，正常表達(dá)28例，而高表達(dá)只有8例；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)癌組織中miR-29b低表達(dá)的患者，其腫瘤浸潤程度低，TMN分期早，預(yù)后效果較好；羅君等[15]在食管鱗癌患者組織中檢測(cè)miR-31的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其相比正常組織中表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其表達(dá)上調(diào)可能會(huì)促進(jìn)鱗癌發(fā)生、發(fā)展過程。KURASHIGE等[16]對(duì)患者血漿中的miR-21進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌患者術(shù)后血漿miR-21明顯表達(dá)下調(diào)，暗示其可能與食管癌患者預(yù)后相關(guān)。趙鑫等[17]通過對(duì)在大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，加入脂多糖對(duì)大鼠進(jìn)行誘導(dǎo)，可上調(diào)細(xì)胞中SKI蛋白的表達(dá)，表明其可能參與炎癥的發(fā)生；JIANG等[18]通過第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)miRNAs進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)miR-127-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平的下調(diào)是由于DNA甲基化與組蛋白乙酰化的作用，從而導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)被抑制；對(duì)其進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-127-3p可通過靶向調(diào)控SKI蛋白，激活TGF-β信號(hào)的傳導(dǎo)過程，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，但對(duì)食管鱗癌的研究鮮有報(bào)道。

本研究對(duì)80例ESCC患者進(jìn)行miR-127-3p的表達(dá)檢測(cè),結(jié)果癌組織中存在低表達(dá)；進(jìn)一步通過細(xì)胞學(xué)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-127-3p在食管鱗癌細(xì)胞中低表達(dá)，且在臨床分期Ⅰ期中表達(dá)最低；分析患者的臨床特征與miR-127-3p在癌組織中的表達(dá)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-127-3p的表達(dá)水平與患者性別、年齡以及吸煙史無關(guān)，而與患者食管鱗癌的分期、有無轉(zhuǎn)移及飲酒史相關(guān)。表明食管鱗癌組織中miR-127-3p的表達(dá)與食管癌的發(fā)生有關(guān)，其表達(dá)上調(diào)與食管鱗癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)，暗示其在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用；筆者同時(shí)對(duì)80例患者進(jìn)行了隨訪觀察，其中42例患者食管鱗癌組織中的miR-127-3p存在低表達(dá)，而38例患者食管鱗癌組織中的miR-127-3p相比于癌旁組織變化無差異；繪制生存曲線進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-127-3p患者中位無進(jìn)展期長于miR-127-3p低表達(dá)患者。

綜上所述，在ESCC患者中，相比癌旁組織，癌組織中miR-127-3p存在低水平表達(dá)。進(jìn)一步體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，miR-127-3p在食管鱗癌細(xì)胞中存在低表達(dá)，并且與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。