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    低鉛染毒促進非酒精性脂肪性肝病大鼠Hcy升高的分子機制研究*

    2019-10-24 06:22:46朱為梅張靜思楊紅玲華鵬徐麗芬
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2019年20期
    關鍵詞:鉛中毒染毒高脂

    朱為梅,張靜思,楊紅玲,華鵬,徐麗芬

    (1.云南省第三人民醫(yī)院,云南 昆明 650011;2.云南省老干部醫(yī)院,云南 昆明 650034)

    當前重金屬污染已經(jīng)成為影響人民群眾健康的一大病因[1-2]。2016年云南省第三人民醫(yī)院對云南省某重工業(yè)城市進行了大范圍鉛中毒和非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)流行病學調(diào)查,發(fā)現(xiàn)當?shù)芈糟U中毒廣泛流行,同時鉛中毒NAFLD患者血清同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)相對無鉛中毒NAFLD患者明顯升高[3]。因此筆者推測在NAFLD發(fā)生和發(fā)展過程中,鉛可能會損傷Hcy代謝酶,最終造成血清Hcy升高。為此本研究從Hcy合成和分解途徑考查鉛中毒對NAFLD大鼠的影響,為今后鉛中毒和NAFLD的治療提供一定的理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物和飼養(yǎng)條件無特定病原體級 SD 大鼠40只,體重160~180 g,雌雄各半,均購于昆明醫(yī)科大學動物實驗中心(動物合格證號:2011-007),購買后飼養(yǎng)于標準小動物飼養(yǎng)房,飼養(yǎng)溫度控制在18~26℃,濕度控制在55%~65%,光照和黑暗條件下各12 h,實驗經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核通過(審批號 R-082018044)。

    1.1.2 實驗材料普通和高脂飼料、墊料(昆明醫(yī)科大學動物實驗中心),Hcy檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),醋酸鉛(武漢博士德生物公司),鉛測定試劑盒(北京匯智泰康生物技術有限公司),白細胞介素 -1α(Interleukin-1α,IL-1α)和白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β) 試 劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子 -α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司),MTHFR、MTR、CBS和β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Santa公司),二抗(北京中山金橋公司),總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司),引物(上海生工生物工程股份有限公司)。

    1.1.3 實驗儀器可見光分光光度計(722-S 型,上海光學儀器廠),電子分析天平(FA1004型,上海光學儀器一廠),自動脫水機(ASP-300S型,德國Leica公司),臺式高速冷凍離心機(5427R型,德國Eppendorf公司),手動切片機(KM2245型,德國Leica公司),生物組織包埋機(BMJ-1型,上海珂淮儀器有限公司),生物攝影顯微鏡(Eclipse E200型,日本Nikon公司),全自動生化分析儀(C8008型,美國雅培公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組及處理所有大鼠在購買后給予適應性喂養(yǎng)2周,然后按照隨機數(shù)字表法將其分為普通飼料組、低鉛染毒普通飼料組(0.3 g/kg含醋酸鉛普通飼料)、高脂飼料組及低鉛染毒高脂飼料組(0.3 g/kg含醋酸鉛高脂飼料,劑量的確定根據(jù)參考文獻[4]報道的最低劑量),每組10只[4]。標準飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)8周后處死所有大鼠。

    1.2.2 標本采集大鼠分批次隔夜禁食 12 h,于次日采用4%水合氯醛3 ml/(kg·d)麻醉處死,將其固定于解剖板,采用心臟取血法收集血液,取5 ml置于抗凝管中交由本院檢驗科檢測,其余血液4 000 r/min離心10 min收集上清,備用于相關生化指標檢測。收集血液后,取出肝臟,統(tǒng)一切取肝左葉置于4%甲醛溶液中用于病理學檢測,其余肝臟切成4小塊,其中1小塊置入凍存管中備用于RNA檢測,其余直接放入超低溫冰箱中用于Western blotting和肝鉛檢測。

    1.3 觀察指標

    1.3.1 血清指標血清肝功能指標谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、Hcy、葉酸及維生素 B12的測定采用全自動生化分析儀,血鉛和肝鉛的測定儀器為分光光度計,IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的檢測儀器為全自動生化分析儀。血鉛、肝鉛、IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的測定嚴格按照試劑盒說明書進行。

    1.3.2 肝臟組織病理學肝臟組織病理學檢查采用蘇木精 - 伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,其步驟按照常規(guī)方法進行:從中性甲醛溶液中取出肝臟組織,自來水過夜沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋、切片[5]。

    1.3.3 Westernblotting蛋白表達采用Western blotting檢測,從超低溫冰箱中取出肝臟組織,每組精確稱取100 mg,用組織裂解液裂解后離心并收集上清,BCA法檢測蛋白濃度并定量,每組各取50μg行SDS-PAGE,電泳完成后半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF,5%脫脂牛奶封閉2 h后洗滌3次,加入一抗[MTR(1 ∶ 2 000)、CBS(1 ∶ 3 000)、MTHFR(1 ∶ 3 000)和β-actin(1∶ 5 000)], 搖床搖動30 min后 置于4℃冰箱中過夜,次日取出后洗滌3次,加入二抗(l∶5 000)孵育1 h,洗滌3次,暗室曝光壓片。采用掃描儀收集圖像,Image J軟件計算并分析條帶灰度,每組實驗重復3次。

    1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR)采用天根總RNA提取試劑盒提取總RNA,定量并調(diào)平,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行擴增,反應條件:95℃預變性10 s,95℃變性 5 s,60℃退火 31 s,共40個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法測定并分析各組大鼠MTR、CBS和MTHFR mRNA相對表達量。見表1。

    表1 qRT-PCR 引物序列

    1.4 統(tǒng)計學方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較用方差分析,進一步兩兩比較用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 各組大鼠肝臟病理學

    普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組肝臟切片表面光滑,肝細胞排列緊密,而高脂飲食組和低鉛染毒高脂飼料組則出現(xiàn)明顯脂肪空泡,此外也有一定的炎癥因子浸潤,特別是低鉛染毒高脂飼料組,脂肪空泡更大且數(shù)量更多。見圖1。

    圖1 各組大鼠肝臟組織病理切片(×400)

    2.2 各組大鼠血鉛和肝鉛比較

    各組大鼠血鉛和肝鉛含量比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低鉛染毒普通飼料組和低鉛染毒高脂飼料組均高于普通飼料組(P<0.05),低鉛染毒高脂飼料組高于低鉛染毒普通飼料組和高脂飼料組(P<0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠血鉛和肝鉛比較(n =10,μg/ml,±s)

    表2 各組大鼠血鉛和肝鉛比較(n =10,μg/ml,±s)

    注:①與普通飼料組比較,P <0.05;②與低鉛染毒普通飼料組,P <0.05;③與高脂飼料組比較,P <0.05。

    組別 血鉛 肝鉛普通飼料組0.11±0.04 0.88±0.37低鉛染毒普通飼料組0.25±0.09① 2.42±0.87①高脂飼料組0.13±0.10 0.95±0.43低鉛染毒高脂飼料組0.32±0.12①②③ 3.22±1.19①②③F值 37.792 21.458 P值 0.000 0.000

    2.3 各組大鼠 AST、ALT 比較

    各組大鼠AST、ALT比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低鉛染毒普通飼料組、高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組均高于普通飼料組(P<0.05),高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組高于低鉛染毒普通飼料組(P<0.05),低鉛染毒高脂飼料組高于高脂飼料組(P<0.05)。見表3。

    表3 各組大鼠 AST、ALT 比較(n =10,u/L,±s)

    表3 各組大鼠 AST、ALT 比較(n =10,u/L,±s)

    注:①與普通飼料組比較,P <0.05;②與低鉛染毒普通飼料組,P <0.05;③與高脂飼料組比較,P <0.05。

    組別 ALT AST普通飼料組72.85±4.35 153.14±9.40低鉛染毒普通飼料組81.17±8.33① 171.43±12.27①高脂飼料組97.24±9.98①② 195.15±17.82①②低鉛染毒高脂飼料組118.75±18.34①②③ 233.19±19.16①②③F值 35.791 24.422 P值 0.000 0.000

    2.4 各組大鼠血清 Hcy、葉酸及維生素 B12 比較

    各組大鼠Hcy、葉酸及維生素B12比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組Hcy高于普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組(P<0.05),葉酸和維生素B12低于普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組(P<0.05);低鉛染毒高脂飼料組Hcy高于高脂飼料組(P<0.05),葉酸和維生素B12低于高脂飼料組(P<0.05)。見表4。

    表4 各組大鼠 Hcy、葉酸及維生素 B12 比較(n =10,±s)

    表4 各組大鼠 Hcy、葉酸及維生素 B12 比較(n =10,±s)

    注:①與普通飼料組比較,P <0.05;②與低鉛染毒普通飼料組,P <0.05;③與高脂飼料組比較,P <0.05。

    維生素B12/(ng/ml)普通飼料組5.42±0.32 5.12±0.36 1.11±0.21低鉛染毒普通飼料組5.47±0.34 5.03±0.41 1.05±0.15高脂飼料組6.86±0.75①② 4.59±0.58①② 0.76±0.18①②低鉛染毒高脂飼料組8.74±1.09①②③ 4.37±0.82①②③ 0.65±0.12①②③F值 4.242 3.386 4.487 P值 0.002 0.005 0.001組別 Hcy/(μmol/L)葉酸/(ng/ml)

    2.5 各組大鼠炎癥因子比較

    各組大鼠IL-1α、IL-1β、IL-6及TNF-α比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組均高于普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組(P<0.05),低鉛染毒高脂飼料組高于高脂飼料組(P<0.05)。見表5。

    表5 各組大鼠血清炎癥因子比較(n =10,ng/ml,±s)

    表5 各組大鼠血清炎癥因子比較(n =10,ng/ml,±s)

    注:①與普通飼料組比較,P <0.05;②與低鉛染毒普通飼料組,P <0.05;③與高脂飼料組比較,P <0.05。

    組別 IL-1α IL-1β IL-6 TNF-α普通飼料組0.24±0.05 0.22±0.06 0.75±0.12 1.65±0.21低鉛染毒普通飼料組0.25±0.07 0.23±0.05 0.78±0.15 1.72±0.40高脂飼料組0.42±0.12①② 0.39±0.09①② 1.42±0.25①② 2.23±0.52①②低鉛染毒高脂飼料組0.57±0.12①②③ 0.45±0.06①②③ 1.98±0.43①②③ 2.98±0.74①②③F值 35.465 32.647 21.438 24.872 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

    2.6 各組大鼠肝臟中MTHFR、MTR 及CBS蛋白相對表達量比較

    各組肝臟中MTR、CBS蛋白相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組大鼠肝臟中MTHFR蛋白相對表達量比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組低于普通飼料組(P<0.05),低鉛染毒高脂飼料組低于高脂飼料組(P<0.05);低鉛染毒普通飼料組與普通飼料組MTHFR蛋白相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6和圖2。

    表6 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS 蛋白相對表達量比較(n =10,±s)

    表6 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS 蛋白相對表達量比較(n =10,±s)

    注:①與普通飼料組比較,P <0.05;②與低鉛染毒普通飼料組,P <0.05;③與高脂飼料組比較,P <0.05。

    MTHFR MTR CBS普通飼料組0.52±0.08 0.63±0.06 0.55±0.04低鉛染毒普通飼料組0.57±0.06 0.65±0.04 0.56±0.05高脂飼料組0.36±0.07①② 0.61±0.07 0.58±0.07低鉛染毒高脂飼料組0.23±0.09①②③ 0.64±0.06 0.59±0.05 F值 22.385 1.476 1.886 P值 0.000 0.105 0.102組別

    圖2 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS 蛋白相對表達量比較(n =10,±s)

    2.7 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS mRNA相對表達量比較

    各組肝臟中MTR、CBS mRNA相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組大鼠肝臟中MTHFR mRNA相對表達量比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組低于普通飼料組(P<0.05),低鉛染毒高脂飼料組低于高脂飼料組(P<0.05);低鉛染毒普通飼料組和普通飼料組MTHFR mRNA相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表7和圖3。

    表7 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS mRNA 相對表達量比較(n =10,±s)

    表7 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS mRNA 相對表達量比較(n =10,±s)

    注:①與普通飼料組比較,P <0.05;②與低鉛染毒普通飼料組,P <0.05;③與高脂飼料組比較,P <0.05。

    MTHFR MTR CBS普通飼料組1.01±0.02 1.00±0.04 1.01±0.02低鉛染毒普通飼料組0.97±0.04 0.97±0.05 1.03±0.06高脂飼料組0.62±0.06①② 1.01±0.06 1.02±0.05低鉛染毒高脂飼料組0.38±0.07①②③ 1.03±0.04 0.99±0.05 F值 20.189 1.441 1.533 P值 0.000 0.106 0.104組別

    圖3 各組大鼠肝臟中 MTHFR、MTR 及 CBS mRNA 相對表達量比較(n =10,±s)

    3 討論

    近年來國內(nèi)外對鉛中毒進行了大量的流行病學研究[2]。以我國為例,2009年以來鉛中毒特別是慢性鉛中毒呈高發(fā)態(tài)勢[6-7]。急性鉛中毒患者主要集中于鉛礦工作人員,而普通人群中多數(shù)為慢性鉛中毒,且發(fā)病人數(shù)更多、更廣。慢性鉛中毒患者與正常人群在多種疾病的發(fā)生率上沒有明顯差異,但是對于有基礎疾病的慢性鉛中毒患者血清多項指標則明顯高于正常人群,而Hcy則是一個差異指標。鉛中毒的脂肪肝患者血清Hcy較無鉛中毒的脂肪肝患者明顯升高。而Hcy的升高與患者代謝密切相關。

    Hcy在體內(nèi)的生成和分解主要通過MTHFR、MTR和CBS 3種酶來進行,首先為轉(zhuǎn)硫基途徑,調(diào)節(jié)酶蛋白為CBS,CBS可催化Hcy和絲氨酸縮合生成胱硫醚,胱硫醚進一步可生成谷胱甘肽以提高機體抗氧化能力[8-11]。另一條途徑為調(diào)節(jié)蛋白酶為MTR和MTHFR,在MTR的催化下Hcy和甲基四氫葉酸可生成蛋氨酸和四氫葉酸,蛋氨酸可直接被人體利用,而四氫葉酸則在MTHFR催化下重新生成甲基四氫葉酸。本研究顯示,各組MTR和CBS表達沒有差異,此外普通飼料組與低鉛染毒普通飼料組MTHFR表達無差異,而高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組MTHFR表達低于普通飼料組,同時低鉛染毒高脂飼料組也明顯低于高脂飼料組,這提示在大鼠攝入高脂飼料的同時給予低鉛染毒可以造成大鼠Hcy升高,其升高與MTHFR的表達異常相關。

    肝細胞的炎癥狀態(tài)與CBS、MTR和MTHFR有直接關系[11]。在肝臟炎癥發(fā)生的過程中,TNF-α是直接調(diào)控因子,TNF-α可直接活化IL-1α和IL-1β,此外TNF-α可激活肝臟Kupffer細胞,促進IL-6釋放[12]。肝臟炎癥反應發(fā)生后,可反作用刺激肝臟細胞,進而誘發(fā)Hcy代謝酶分泌異常,最終導致Hcy升高[13]。本研究結果顯示,相較于普通飼料組,低鉛染毒普通飼料組大鼠血清中IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α并沒有明顯升高。而與普通飼料組和低鉛染毒普通飼料組相比,高脂飼料組和低鉛染毒高脂飼料組IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α明顯升高。相較于高脂飼料組,低鉛染毒高脂飼料組IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α明顯升高,這提示低鉛染毒不會對正常大鼠炎癥因子和血清Hcy升高有促進作用,而在肝臟損傷后,則會明顯升高Hcy和炎癥反應。

    綜上所述,低鉛染毒對NAFLD大鼠Hcy升高有明顯促進作用,這與低鉛攝入可增加肝臟炎癥反應,降低肝臟中MTHFR表達有關。

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