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    INPP5E基因影響小鼠胚胎神經(jīng)管閉合的分子機(jī)制研究*

    2019-10-24 06:22:46秦佳星王秀偉官臻牛勃郭金王建華鐘儒剛
    關(guān)鍵詞:小鼠水平

    ,秦佳星 ,王秀偉 ,官臻 ,牛勃,郭金,王建華,鐘儒剛

    (1.北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100124;2.首都兒科研究所 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室,北京 100020)

    肌醇多聚磷酸5-磷酸酶(INPP5E)基因編碼INPP5E蛋白,該基因敲除后小鼠出現(xiàn)無腦和露腦的神經(jīng)管缺陷(neural tube defects,NTD)表型[1-3]。NTD為胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天畸形,是環(huán)境因素與遺傳因素復(fù)雜交互作用的結(jié)果,環(huán)境因素包括母體營養(yǎng)、地理及社會經(jīng)濟(jì)狀況等,而母體葉酸(folic acid,FA)與NTD的發(fā)生密切相關(guān)[4-8]。FA在體內(nèi)以四氫葉酸的形式參與一碳單位的代謝,與DNA甲基化過程等表觀遺傳修飾相關(guān)。本研究通過FA缺乏NTD小鼠模型,研究該基因影響胚胎神經(jīng)管閉合的分子機(jī)制,為NTD的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動物7~8 周體重 18~20 g 的無特定病原體級C57BL/6J成年健康雌鼠20只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)。在20~24℃恒溫、40%~60%恒濕的條件下,鼠繁殖飼料喂養(yǎng)(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司),常規(guī)飲水,自由取食。動物房中不定時提供食物和水。本研究已獲得首都兒科研究所實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:DWLL2016004)。

    1.1.2 試劑和儀器兔源甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、INPP5E單克隆抗體(美國Abcam公司),蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)公司),脫脂奶粉(美國BD Difco 公司),預(yù)染 Marker(美國 Thermo Scientific公司),30%聚丙烯酰胺(上海碧云天生物技術(shù)公司),一步法動物組織活性蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司),DNA提取純化試劑盒(德國QIAGEN公司),DNA修飾試劑盒(美國Chemicon公司)。EG1150石蠟包埋機(jī)(德國Leica公司),Model200/2.0蛋白質(zhì)電泳儀(美國Bio-Rad公司),221BR Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell(美國 Bio-Rad 公司),Image Quant LAS 4000mini(美國General Electric 公司),酶標(biāo)儀(美國 Perkin Elmer公司),7500實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀(美國Applied Biosystems公司),多用凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)等。

    1.2 方法

    1.2.1 動物模型及標(biāo)本采集雌鼠體重達(dá) 20 g 后,與雄鼠合籠過夜(18:00至次日6:00),次日觀察是否出現(xiàn)陰栓,出現(xiàn)陰栓可認(rèn)為12:00時為胚胎發(fā)育第0.5天。

    取16只孕鼠,在胚胎發(fā)育第7.5天時隨機(jī)分為對照組和NTD組進(jìn)行處理,每組8只。對照組腹腔注射0.9%氯化鈉NaCl,NTD組采用腹腔注射4.5 mg/kg甲氨蝶呤,干擾FA代謝從而復(fù)制NTD小鼠模型[9-10]。在胚胎發(fā)育第11.5天頸部脫臼處死小鼠,取胚胎,體視顯微鏡下觀察胚胎畸形情況。

    1.2.2 蘇木精 - 伊 紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色 將胚胎固定于100 g/L 甲醛溶液中,在乙醇溶液中脫水,在二甲苯溶液中浸泡,之后放入石蠟嵌入包埋,將石蠟塊用組織切片機(jī)進(jìn)行神經(jīng)管組織部位切片,厚度為5 mm,將切片放入二甲苯和乙醇溶液中脫蠟,隨后放入蘇木精染色液中約10 min,水沖洗后用伊紅液浸染3 min,再置于水中洗去浮色。

    1.2.3 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法取 20 ml小鼠血漿,加入1.0 g活性炭,冰上輕柔攪拌1 h,4℃、20 000 r/min 離心 5 min,上清為無 FA 小鼠血漿結(jié)合酶,分裝儲存于-70℃?zhèn)溆?。?1.5天用提取緩沖液對對照組及NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織樣品進(jìn)行勻漿。100℃加熱提取 15 min,20 000 r/min 離心 15 min,在上清中加入血漿結(jié)合酶,將多聚谷氨酸FA分解為小分子的單谷氨酸FA,37℃孵育1.5 h后100℃加熱5 min,20 000 r/min 離心 20 min,用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測上清液。

    1.2.4 重亞硫酸鹽測序法在兩組小鼠胚胎發(fā)育第11.5天采用重亞硫酸鹽測序法檢測胚胎神經(jīng)組織中INPP5E基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平。使用DNA提取純化試劑盒提取基因組DNA于-20℃保存。NTD組DNA采用DNA修飾試劑盒進(jìn)行重亞硫酸鹽處理,將NTD組中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U),PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(T),反之發(fā)生甲基化的C無變化。利用UCSC在線查詢INPP5E基因 CpG 島,使用 Methyl Primer Express V1.0軟件設(shè)計重亞硫酸鹽測序法引物,正向引物:5’-GGTTTAGTTATTGGGAAGGAGT-3’,反向引物:5’-AAATTAAACAAAATTAAATCCACCAAA-3’。 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為328 bp,共檢測該區(qū)域8個CpG甲基化位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為50μl,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 10 min,95℃變性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸30 s,共40個循環(huán),72℃繼續(xù)延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,在300 mm紫外燈下觀察結(jié)果,凝膠成像分析系統(tǒng)記錄處理數(shù)據(jù),純化后經(jīng)Sanger法測序,使用BiQ Analyzer軟件進(jìn)行分析,將C信號的峰高與C+T信號的峰高進(jìn)行比較,來定量每個CpG二核苷酸位點(diǎn)中的甲基化水平。

    1.2.5 Westernblotting 通過 Western blotting 檢測INPP5E蛋白的相對表達(dá)量。在胚胎發(fā)育第11.5天對發(fā)育正常小鼠胚胎及發(fā)育缺陷小鼠胚胎進(jìn)行解剖,收集神經(jīng)組織,用CelLytic MT蛋白裂解液提取正常胚胎神經(jīng)組織總蛋白,使用布拉德福德光譜蛋白質(zhì)法測蛋白含量。對蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后取下凝膠,進(jìn)行電轉(zhuǎn)移,電轉(zhuǎn)移后的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)在10%脫脂牛奶中室溫輕搖,封閉1.5 h。將PVDF放入玻璃皿內(nèi),加入一定體積稀釋的I抗(1∶1 000),4℃過夜。之后用抗鼠II抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液ECL顯色,使用影像處理軟件分析,GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

    1.2.6 qRT-PCR采用qRT-PCR檢測兩組胚胎發(fā)育第11.5天小鼠胚胎神經(jīng)組織中INPP5EmRNA的相對表達(dá)量。20μl PCR 反應(yīng)液 :SYBR? Premix DimerEraser?(2×)10μl、PCR 正向引物(10μmol)0.6μl、PCR 反 向 引 物(10μmol)0.6μl、ROX 參比染料(50×)0.4μl、模板 2μl、ddH2O 6.4μl,采用序列分析和熔解曲線分析對PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性3 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 32 s,共 40個循環(huán),72℃繼續(xù)延伸 34 s。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗(yàn);計數(shù)資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組小鼠胚胎表型及 HE 染色結(jié)果

    對照組小鼠胚胎發(fā)育第11.5天胚胎外觀較為飽滿圓滑,頭部前、中及后腦泡均已經(jīng)發(fā)育形成,脊柱表面完整無裂口(見圖1A);可見明顯的耳泡、眼泡,尾部彎曲細(xì)長。HE染色顯示神經(jīng)管發(fā)育良好,細(xì)胞排列密集整齊(見圖1B、C)。

    NTD組小鼠胚胎的后腦部位神經(jīng)管未閉合,神經(jīng)組織裸露在胚胎外(見圖1D)。HE染色顯示后腦頂板未閉合,神經(jīng)腔面未完整,且細(xì)胞排列疏松(見圖1E、F)。

    2.2 兩組小鼠胚胎一般資料比較

    兩組胚胎的頂臀長度比較,采用t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.480,P=0.002),NTD組短于對照組。兩組胚胎的體重比較,采用t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=41.860,P=0.001),NTD組低于對照組。兩組胚胎畸形率比較,采用Fisher確切概率法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。見表1。

    2.3 兩組INPP5E基因啟動子區(qū)甲基化水平比較

    在引物擴(kuò)增的328 bp區(qū)域中,包含8個CpG二核苷酸。對照組與NTD組CpG甲基化水平分別為40.6%和9.4%,NTD組與對照組甲基化程度的比率為23.2%。兩組INPP5E基因啟動子區(qū)的甲基化水平比較,采用χ2檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.330,P=0.000),NTD組低于對照組。見圖2。

    圖1 兩組小鼠胚胎發(fā)育第11.5天的胚胎表型及HE染色結(jié)果

    表1 兩組胚胎一般資料比較

    圖2 INPP5E 基因 CpG 島的甲基化

    2.4 兩組小鼠胚胎組織中INPP5E相對表達(dá)量比較

    對照組和NTD組小鼠胚胎發(fā)育第11.5天時INPP5E蛋白相對表達(dá)量分別為(1.000±0.230)和(0.482±0.080),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.981,P=0.027),NTD組低于對照組。對照組和NTD組INPP5E mRNA相對表達(dá)量分別為(1.000±0.117)和(0.623±0.034),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.867,P=0.016),NTD組低于對照組。NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織中,INPP5E基因啟動子區(qū)的低甲基化可能是引起INPP5E mRNA表達(dá)降低的原因,從而影響胚胎神經(jīng)管的發(fā)育。見圖3、4。

    2.5 兩組小鼠胚胎神經(jīng)組織中FA及其相關(guān)代謝產(chǎn)物水平比較

    在最佳的超高效液相色譜條件下分離檢測FA及其相關(guān)代謝產(chǎn)物5-甲基四氫FA(5-methyltetrahydrofolate,5-MeTHF)、5- 甲酰四氫 FA(5-formyltetrahydrofolate,5-FoTHF)和同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平,分別在2.82、2.53、2.88和0.71 min被洗脫,進(jìn)一步通過串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。見圖4。

    圖3 兩組小鼠胚胎組織中 INPP5E 蛋白和mRNA 表達(dá)水平比較(n =8,±s)

    圖4 FA及其相關(guān)代謝產(chǎn)物質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

    FA在對照組及NTD組中的含量分別為(2.76±0.98)和(4.39±1.41)mg/g,5-MeTHF的含量分別為(9.55±2.38)和(4.62±1.98)mg/g,5-FoTHF的含量分別為(4.86±1.02)和(3.19±0.75)mg/g,Hcy的含量分別為(4.33±1.42)和(7.06±1.38)mg/g。兩組小鼠胚胎神經(jīng)組織中FA、5-MeTHF、5-FoTHF及Hcy水平比較,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.566、21.350、10.710 和118.200,P=0.022、0.002、0.009和0.000),NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織中FA和Hcy水平高于對照組,NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織中5-MeTHF和5-FoTHF水平低于對照組。見圖5。

    圖5 兩組小鼠胚胎神經(jīng)組織中FA及其相關(guān)代謝產(chǎn)物水平比較(n =8,±s)

    3 討論

    INPP5E基因調(diào)節(jié)肌醇信號通路活性,參與胚胎神經(jīng)發(fā)育,其編碼的INPP5E蛋白存在于神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、纖毛軸絲、高爾基體、高爾基體膜、外周膜蛋白及質(zhì)膜內(nèi)側(cè)[11-14]。有研究發(fā)現(xiàn),INPP5E基因突變導(dǎo)致茹貝爾綜合征等疾病[15-17]。有研究顯示,INPP5E基因表達(dá)影響初級纖毛穩(wěn)定性,進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)管的閉合[18-20]。有學(xué)者報道INPP5E基因突變與神經(jīng)管畸形相關(guān),神經(jīng)管畸形是纖毛相關(guān)疾病的主要表型之一,是一種嚴(yán)重的出生缺陷,是由多種因素導(dǎo)致的神經(jīng)管部分或完全閉合不全,進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[21]。INPP5E基因突變會引起PI(3,4,5)P3和PI(4,5)P2的生成產(chǎn)物減少,并通過改變PI3K信號通路影響細(xì)胞增殖、存活、凋亡及初級纖毛穩(wěn)定性,從而導(dǎo)致后腦畸形及纖毛相關(guān)疾病[22-25]。

    DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾,參與基因表達(dá)調(diào)控,影響胚胎生長發(fā)育[26]。低甲基化的DNA在有絲分裂中易發(fā)生重組,導(dǎo)致基因發(fā)生缺失或易位,最終影響基因表達(dá)[27]。有研究報道NTD小鼠胚胎中,與細(xì)胞增殖相關(guān)的Ptch1、Pla2g4a、Foxgl基因的甲基化水平與對照組相比顯著降低,且qRT-PCR結(jié)果與甲基化水平改變相關(guān),推測甲基化的改變在NTD發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[28]。本研究采用腹腔注射4.5 mg/kg甲氨蝶呤,干擾FA代謝從而復(fù)制NTD小鼠模型,通過檢測對照組及NTD組小鼠胚胎中的FA及其代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織的FA含量明顯升高,且代謝產(chǎn)物5-MeTHF和5-FoTHF的含量明顯降低,說明此時FA代謝呈現(xiàn)紊亂趨勢;INPP5E基因啟動子區(qū)甲基化水平的顯著降低,推測FA代謝失衡引起甲基化供體不足,導(dǎo)致INPP5E基因啟動子區(qū)甲基化水平顯著降低,從而影響該基因的正常表達(dá),干擾神經(jīng)管的閉合。以上結(jié)果表明在神經(jīng)發(fā)育早期,需要INPP5E基因在一定水平上表達(dá)調(diào)控神經(jīng)管正常閉合。

    本研究發(fā)現(xiàn)NTD小鼠胚胎INPP5E蛋白和mRNA相對表達(dá)量低于正常小鼠。說明INPP5E基因在發(fā)育早期影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,本研究結(jié)果表明NTD小鼠胚胎神經(jīng)組織的INPP5E蛋白和mRNA相對表達(dá)量下降,參與FA代謝紊亂神經(jīng)管閉合失敗,造成小鼠露腦畸形。INPP5E基因表達(dá)水平的改變是否通過PI3K信號通路活性影響初級纖毛形成,其具體機(jī)制尚需在細(xì)胞內(nèi)干擾INPP5E基因的表達(dá),如用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞上進(jìn)行INPP5E基因敲除實(shí)驗(yàn)。同時,檢測PI(3,4,5)P3和PI(4,5)P2及初級纖毛的形成可進(jìn)一步研究該基因?qū)ε咛ド窠?jīng)發(fā)育的影響。

    因此,INPP5E基因在調(diào)節(jié)胚胎神經(jīng)發(fā)育中起重要作用,NTD組小鼠胚胎神經(jīng)組織中該基因的表達(dá)降低,推測由于FA代謝失衡引起甲基化供體不足,使該基因啟動子區(qū)發(fā)生低甲基化,進(jìn)而引起基因異常表達(dá)導(dǎo)致NTD的發(fā)生。對INPP5E基因調(diào)控胚胎神經(jīng)發(fā)育分子機(jī)制的進(jìn)一步闡明,對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷相關(guān)疾病的早期診斷及防控具有重要的意義。

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