LC-MS/MS法測定血塞通注射液中五種皂苷成分的含量

楊崇儀　吳凡　張紅宇　王莉　王瑋

【摘 要】 目的：研究建立運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）同時測定血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷R、三七皂苷R1的定性定量方法，用于血塞通注射液的質(zhì)量控制。方法：采用CAPCELL CORE C18色譜柱（2.1mm×150mm， 2.7μm），柱溫30℃，流動相：A（超純水）和 B（乙腈），使用梯度洗脫如下：0.01～3.00min，95%A;3.00～4.00min，95%A～30%A;4.00min～10.00min，30%A;10.00min～12.00min，30%A～95%A; 12.00min～15.00min，95%A。流速設(shè)定為 0.300mL/min。總運(yùn)行時間為15.0min。采用多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）的掃描方式下正負(fù)離子同時監(jiān)測，離子源為 ESI 源。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均高于 0.9988;日內(nèi)精密度和日間精密度（RSD）分別小于 4.14%和 4.87%;回收率在 94.3%～106.9%之間。被分析成分48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。結(jié)論：建立并驗證了運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷R、三七皂苷R1的定性定量方法，該方法已成功地應(yīng)用于云南地產(chǎn)的9批次的血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1的定性和定量分析。

【關(guān)鍵詞】 血塞通注射液;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;人參皂苷;三七皂苷

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）13-0034-10

三七（Panax notoginseng （Burk.）F. H. Chen）為五加科人參屬植物，是我國名貴中藥材，是云南道地中藥材資源。血塞通注射液為三七提取物制劑，主要成份為三七總皂苷，有活血祛瘀、通脈活絡(luò)等功效，主要用于中風(fēng)偏癱、瘀血阻絡(luò)證，動脈粥狀硬化性血栓性腦梗塞、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞見瘀血阻絡(luò)證者，臨床應(yīng)用廣泛并且療效確切，是一種具有重要應(yīng)用前景的中藥品種。血塞通注射液的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3590-2001（Z）-2011，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的含量測定所用方法為HPLC法[1]，檢測時間為60min，耗時較長而且靈敏度低。其主要成分三七總皂苷和三七三醇皂苷的含量測定的標(biāo)準(zhǔn)方法收載于《中國藥典》2015版[2、3]，三七三醇皂苷的測定也采用HPLC法，測定時長為90分鐘。LC-MS/MS技術(shù)是近年最新發(fā)展起來的重要的分離和分析方法，擁有液相色譜的優(yōu)越分離性能，串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）相較于單質(zhì)譜（MS）具有更高選擇性、更高靈敏度和更高準(zhǔn)確度，LC-MS/MS具有分析范圍廣，分離能力強(qiáng)，定性分析結(jié)果可靠，自動化程度高等優(yōu)點[4]。運(yùn)用LC-MS/MS技術(shù)能夠避免繁瑣和復(fù)雜的衍生化前處理，同時能夠得到化合物保留時間、分子量及特征離子對等豐富的信息。在對未知成分的研究中，通過質(zhì)譜檢測器給出的大量結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合同類已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，即可對未知成分進(jìn)行分析;在已知成分的測定中，相較于傳統(tǒng)色譜法具有更高準(zhǔn)確度和靈敏度[5]。檢索現(xiàn)有的研究文獻(xiàn)，對血塞通注射液進(jìn)行有效成分測定的方法多為液相色譜法[6-13]，檢測時長最短為24min[7]，應(yīng)用LC-MS/MS測定三七總皂苷中一個或幾個皂苷成分的研究文獻(xiàn)也有報道，但研究對象為三七原料[14-15]或其他品種的注射液[16]，應(yīng)用LC-MS/MS對血塞通注射液中三七總皂苷進(jìn)行測定的文獻(xiàn)未見報道。研究建立一種運(yùn)用LC-MS/MS法對血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1快速準(zhǔn)確定量的方法，相對于血塞通注射液的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，大大提高了檢測效率。并成功運(yùn)用該方法對來自云南不同生產(chǎn)企業(yè)的血塞通注射液進(jìn)行了含量測定，為云南血塞通注射液的生產(chǎn)企業(yè)提供了提升藥品標(biāo)準(zhǔn)、提高藥品質(zhì)量的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-30A高效液相色譜儀（含在線脫氣機(jī)、二元泵、自動進(jìn)樣器，日本島津公司）、TRIPLE QUAD 5500型質(zhì)譜儀（美國 AB Sciex公司）、CPA225D 型分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）、UPH-IV-90Z優(yōu)普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。

1.2 材料 人參皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1，批號：110703-201529，純度95.0%）、人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1，批號：110704-201424，純度93.7%）、人參皂苷Re（Ginsenoside Re，批號：110754-201525）、人參皂苷Rd（Ginsenoside Rd，1批號：10704-201424）、三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，批號：110745-201318）和三七總皂苷（Notoginseng Total Saponins，批號：110870-201002，含量以三七皂苷R1 6.9%、人參皂苷Rg1 28.0%、人參皂苷Rb1 29.7%、人參皂苷Re 3.8%、人參皂苷Rd 7.3%計）以上對照品購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇（色譜級，德國默克公司），乙腈（色譜級，德國默克公司），超純水。血塞通注射液收集于云南省不同企業(yè)，具體見表1。各待測物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖1。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL CORE C18柱（2.1mm I.D.×150mm， 2.7μm，SHISEIDO）;柱溫：30℃;流動相： A-B（水-乙腈）梯度洗脫，梯度洗脫程序如下，見表2;分析時間為 15.0min;流速：0.300mL/min;進(jìn)樣量：1.00μL。對照品的提取 MRM 色譜圖和樣品的MRM色譜圖比對見圖2。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）的掃描方式下正負(fù)離子同時監(jiān)測，離子源為 ESI 源，源噴射電壓設(shè)置為 5500 和-4500 V，源溫度（TEM）550℃，霧化氣壓力為55 psi，接口持續(xù)加熱，碰撞反應(yīng)氣使用氮?dú)?，氣簾氣壓力?35 psi，Q1 和 Q3 分辨率均為 0.1Da，駐留時間（dwell time）為 80 ms。

將每個皂苷成分的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1對照品溶液（濃度約1μg/mL）分別打入質(zhì)譜中，用MRM模式正負(fù)離子同時掃描，對前體離子（Q1）、產(chǎn)物離子（Q3）、去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，五種皂苷成分的響應(yīng)強(qiáng)度均優(yōu)于負(fù)離子的響應(yīng)強(qiáng)度。本實驗采用正離子對定量、負(fù)離子對定性的方式對五種皂苷成分進(jìn)行測定。由于負(fù)離子對不用于定量檢測，所以未對負(fù)離子對進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。正離子模式下的監(jiān)測離子對、去簇電壓（DP）及碰撞能量（CE）見表3。數(shù)據(jù)處理采用 AB Sciex公司提供的 Analyst軟件，1.6版本。五種皂苷成分的一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜產(chǎn)生的主要裂解碎片見表3和圖3。

2.2 對照品溶液的制備 分別稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1對照品適量，使用甲醇溶解并配制成一定濃度的貯備液，供質(zhì)譜條件優(yōu)化用。取三七總皂苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容，制得三七總皂苷儲備液，濃度為含三七總皂苷1.0775mg/mL。于-20℃下保存。

2.3 供試品溶液的制備 取血塞通注射液適量，按照一定比例，用甲醇稀釋定容后，用0.45μm濾膜過濾后制得供試品溶液，于4℃下保存。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限 取三七總皂苷儲備液，采用梯度稀釋法，用甲醇由高到低分別稀釋成8個濃度（4310ng/mL，2155ng/mL，1077.5ng/mL，538.75ng/mL，269.38ng/mL，134.69ng/mL，67.34ng/mL），0.45μm濾膜過濾后，取1.0μL進(jìn)樣，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。將三七總皂苷儲備液用甲醇逐步稀釋并進(jìn)行測定，以信噪比S/N=10和S/N=3時各對照品溶液的濃度為定量限和檢測限。

2.4.2 精密度、回收率和穩(wěn)定性 取血塞通注射液，按照適當(dāng)比例稀釋，得到中間液，再將中間液用兩倍的稀釋梯度稀釋為高、中、低三個不同濃度的供試液，用0.45μm濾膜過濾后，取1μl進(jìn)樣，每個濃度的供試液平行測定6份，按“2.1”項下的分析條件對供試液中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1進(jìn)行定量分析記錄峰面積，帶入當(dāng)日制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出5個皂苷的濃度，并計算RSD值。供試液于4℃下保存，于24h后同法再次測定，計算出5個皂苷的濃度，并計算RSD值。

取供試品溶液，于4℃下保存，分別于0h、24h、48h 測定五種皂苷的濃度，平行測定6份，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。

精密量取供試品溶液1.0mL，加入甲醇1.0mL旋渦混勻后，取1.0μL進(jìn)樣，測定五種皂苷的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算濃度（記錄為A濃度）。精密量取高、中、低（4156ng/mL、2078ng/mL、1039ng/mL）三個濃度水平的對照品溶液1.0mL，分別加入到1.0mL的供試品溶液中，旋渦混勻后，制得含有高、中、低濃度的三七總皂苷的供試品加樣回收溶液（外加對照品的濃度值為2078ng/mL、1039ng/mL、519ng/mL），每個濃度平行制備 6 份進(jìn)行測定，測定供試品加樣回收溶液中五種皂苷的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算出五種皂苷在加樣回收溶液中的含量（記錄為B濃度），B濃度與A濃度的差值即為實測的對照品濃度值。帶入按回收率公式：實測的對照品濃度值/外加對照品的濃度值×100%。計算五種皂苷的回收率。

2.5 樣品中五種皂苷成分含量測定 分別取“表1”中9個批次的血塞通注射液作為樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述方法進(jìn)行檢測，記錄五種皂苷的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中五種皂苷的成分的含量。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗證

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以對照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。相關(guān)系數(shù)為 r>0.9988 ，線性關(guān)系良好，所得回歸方程、線性范圍、LOD 和 LOQ 見表4。

3.1.2 精密度、回收率和穩(wěn)定性 5 種皂苷的日內(nèi)精密度及日間精密度的 RSD 值分別小于 4.14%和 4.87%，說明方法精密度良好，詳見表5和表6。供試品溶液于4℃下保存，分別于0h、24h、48h 測定五種皂苷的濃度，結(jié)果顯示供試品溶液穩(wěn)定性較好，RSD≤7.32%，具體數(shù)據(jù)詳見表7。5 種皂苷低、中、高 3 種濃度的加樣回收率范圍為 94.02%～106.20%，表明方法回收率良好。

3.2 血塞通注射液樣品中的五種皂苷成分的含量測定9批血塞通注射液中的的五種皂苷成分的含量測定結(jié)果見表8。其中人參皂苷Rg1的含量范圍為28.39%～37.48%、人參皂苷Rb1的含量范圍為28.75%～43.01%、人參皂苷Rd的含量范圍為6.11%～11.53%、人參皂苷Re的含量范圍為2.945～6.10%、三七皂苷R1的含量范圍為5.82%～9.29%。由此可看出云南地產(chǎn)的，不同企業(yè)、不同批次的血塞通注射液中的五種皂苷成分的含量范圍跨度不大，且都符合現(xiàn)行血塞通注射液藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3590-2001（Z）-2011”的要求。來自同一生產(chǎn)企業(yè)的不同生產(chǎn)批號的血塞通注射液的五種皂苷成分的含量范圍差異較小，可見生產(chǎn)工藝都較為成熟穩(wěn)定。

[9]李華麗，王小龍，李梅榮，等.HPLC法測定三七中人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量[J].海峽藥學(xué)，2018，30（5）：86-88.

[10]劉嘉柳，蘇草茵，鄭艾妮，等.整體柱液相色譜法分離三七及其制劑中8種皂苷的研究[J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報，2017，33（6）：743-747.

[11]靳慧娟.高效液相法測定血塞通注射液中皂苷含量[J].黑龍江科技信息，2017（6）：170.

[12]王時云，羅春陽，周建軍，等.全自動二維液相色譜系統(tǒng)測定注射用血塞通中人參皂苷Rb1含量[J].湘南學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2017，19（2）：16-20.

[13]李蘭杰. 血塞通注射液中皂苷類藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D].長春：吉林大學(xué)，2016.

[14]Chen W， Dang Y， Zhu C. Simultaneous determination of three major bioactive saponins of Panax notoginseng using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and a pharmacokinetic study[J]. Chinese Medicine，2010（5）：12

[15]郭楓，劉煥煥，王彩艷，等.陰離子交換樹脂純化三七總皂苷的液質(zhì)聯(lián)用分析[J].科學(xué)技術(shù)與工程，2017，17（31）：199-203.

[16]Yang L， Xu SJ， Wu ZF， et al. Determination of Ginsenoside-Rg1 in Human Plasma and its Application to Pharmacokinetic Studies Following Intravenous Administration of‘Shenmai Injection[J]. Phytother. Res， 2009，1（23）：65-71.

[17]楊逸，楊麗瑛，戴景峰，等.人參皂苷Rg1藥理活性的研究進(jìn)展[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2012，23（12）：3121-3123.

[18]楊秋婭，李曉宇，劉皋林.人參皂苷Rb1的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)雜志，2013，48 （15） ：1233-1237.

[19]馬增春，肖勇，趙佳偉，等.人參皂苷Re對 H9c2 心肌細(xì)胞 CYP450 酶的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2016（4）：494-498.

[20]張琛，趙鋼.人參皂苷Rd的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2011，20（11）：953-958.

[21]楊晶晶，劉英，王承瀟，等. 三七皂苷R1的現(xiàn)代研究進(jìn)展.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（5）：463-467.

（收稿日期：2019-04-20 編輯：劉斌）