紅花偽品及其染色物的檢測探討

郭欽安　李守俊

【摘 要】 目的：比較紅花與其一種偽品性狀的差異，建立HPLC及HPLC-MS法檢測紅花偽品中所使用的胭脂紅。方法：通過性狀鑒別與水試，發(fā)現(xiàn)了涉嫌染色的一種紅花偽品;采用HPLC法對(duì)所含的色素進(jìn)行定性鑒別，然后使用HPLC-MS法對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果：該偽品與紅花在花藥顏色以及水溶液顏色方面存在明顯差異，偽品中摻有胭脂紅染色物質(zhì)。結(jié)論：利用性狀差異，可以快速對(duì)紅花真?zhèn)芜M(jìn)行初篩;所建立的HPLC及HPLC-MS法專屬性較強(qiáng)，可以對(duì)紅花偽品中的胭脂紅進(jìn)行準(zhǔn)確定性。

【關(guān)鍵詞】 紅花;偽品;胭脂紅;HPLC-MS

【中圖分類號(hào)】R282.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）13-0057-04

紅花始載于《開寶本草》，原名“紅藍(lán)花”[1]。中華人民共和國藥典規(guī)定其來源為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛之功效[2]。主治婦女月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)閉經(jīng)，還適用于各種靜脈曲張、末梢神經(jīng)炎、跌打損傷、關(guān)節(jié)酸痛、腿腳麻木等癥。紅花為臨床常用品種，由于用途廣泛，貨源緊張，導(dǎo)致價(jià)格上漲，為賣相好看或造假，市場上摻偽染色現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，如有報(bào)道紅花飲片被酸性紅73、日落黃染色[3-4]，嚴(yán)重影響藥品療效，危害人類健康。近期筆者在日常工作中發(fā)現(xiàn)一種紅花的偽品，大小和顏色與紅花較為相似。為有效打擊這種違法行為，提供有力證據(jù)，本文首先從性狀入手，輔以水試，對(duì)紅花與其偽品進(jìn)行了鑒別，同時(shí)發(fā)現(xiàn)可能有非法染色物存在，進(jìn)而通過HPLC法對(duì)染色物質(zhì)進(jìn)行了定性，并應(yīng)用HPLC-MS法對(duì)染色物質(zhì)做了進(jìn)一步的確認(rèn)，證實(shí)該偽品中含有胭脂紅。對(duì)染色物確證時(shí)，采用了多反應(yīng)監(jiān)測和二級(jí)全掃描相結(jié)合的模式與相應(yīng)的對(duì)照品進(jìn)行比較，得出的結(jié)論更加可靠，以供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 OLYMPUS 520 照相機(jī);OLYMPUS SZX7體式顯微鏡;Waters 2695高效液相色譜儀（2998二極管陣列檢測器，美國Waters）;Waters AcQuity uplc XEVO TQD 高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）;AUW120D型電子分析天平（日本島津）;BRANSONIC 超聲波清洗機(jī)（美國BRANSON）;Medium-s300超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 材料 胭脂紅（批號(hào)：111771-201302）、檸檬黃（批號(hào)： 510004-201602）、金橙Ⅱ（批號(hào)：111769- 201302）、偶氮玉紅（批號(hào)：520054-201401）、酸性紅73（111773-201602）、日落黃（批號(hào)：510005-201602）等以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用紅花正品藥材為2018年6月于市場收集;紅花偽品為2018年7月抽檢樣品，實(shí)驗(yàn)樣品均保存于晉城市食品藥品檢驗(yàn)所標(biāo)本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 采用OLYMPUS SZX7體式顯微鏡觀察微觀形態(tài)特征，比較紅花與其偽品的不同點(diǎn)，然后采用水試的方法，觀察入水前后兩者的差異以及水的顏色變化。紅花為不帶子房的管狀花，長1～2 cm，表面紅黃色或紅色?；ü谕布?xì)長，先端5裂，裂片呈狹條形，長5～8 mm;雄蕊5，花藥聚合成筒狀，黃白色;柱頭長圓柱形，頂端微分叉。質(zhì)柔軟。偽品與紅花正品外觀較為相似，表面橙紅色，花藥顏色為橙紅色，質(zhì)松脆。如圖1所示。

2.2 水試 取紅花及其偽品少許，分別加水25mL，浸漬數(shù)分鐘，濾液置于比色管中，日光下檢視，紅花濾液顯淡黃色，偽品濾液顯橙紅色。將浸漬后的紅花及偽品置于白紙上，日光下觀察，紅花顏色沒有發(fā)生變化，偽品顏色退去，變成淡棕色。如圖2、3所示。

2.3 HPLC-DAD法偽品染色物質(zhì)的檢測

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters XTERRA MS C18（4.6mm×150 mm， 5 μm）;流動(dòng)相A（甲醇）-B（0.01 mol/L乙酸銨溶液）按表1進(jìn)行梯度洗脫;柱溫30℃;流速：1.0 mL/min;檢測波長：508nm;二極管陣列檢測器檢測波長范圍：200～700 nm。

2.3.2 供試品溶液制備 分別取紅花與其偽品的粉末 0.1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理 20 min，濾過，取上清液作為供試品溶液。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 取胭脂紅對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含胭脂紅60 μg的對(duì)照品溶液。

2.3.4 樣品測定 取紅花供試品溶液、紅花偽品供試品溶液，以及對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.3.5 HPLC-DAD法結(jié)果 結(jié)果表明紅花偽品供試品溶液中呈現(xiàn)與胭脂紅對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰，且對(duì)照品和供試品中相應(yīng)色譜峰在200～700 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜相同。如圖3、4所示。

2.4 HPLC-MS法檢測

2.4.1 色譜-質(zhì)譜條件 色譜柱：waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×50 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相A（甲醇）-B（0.01 mol/L乙酸銨溶液）按表2進(jìn)行梯度洗脫;流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣體積：5 μL。質(zhì)譜條件離子源：電噴霧ESI;電離方式：ESI+ ;電噴霧電壓：0.7KV;離子源溫度：500℃;載氣流速：1000 L/H。掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測掃描、 二級(jí)質(zhì)譜全掃描，掃描范圍m/z 50～550，具體質(zhì)譜參數(shù)見表3。

2.4.2 供試品溶液制備 取紅花偽品的粉末 0.1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理 20 min，濾過，取上清液作為供試品溶液。

2.4.3 對(duì)照品溶液的制備 取胭脂紅對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含胭脂紅60 μg的對(duì)照品溶液。

2.4.4 樣品測定 取空白試劑、紅花偽品供試品溶液，對(duì)照品溶液分別稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后進(jìn)樣，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

2.4.5 HPLC-MS法結(jié)果 多反應(yīng)監(jiān)測掃描質(zhì)譜圖中，紅花偽品出現(xiàn)與胭脂紅對(duì)照試劑保留時(shí)間一致的準(zhǔn)分子離子峰;在二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中，紅花偽品出現(xiàn)與胭脂紅對(duì)照試劑相同的離子碎片特征峰，進(jìn)一步確證了紅花偽品供試品種中添加有胭脂紅色素（多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖、二級(jí)質(zhì)譜圖詳見圖5、6）。胭脂紅的準(zhǔn)分子離子[M-3Na+4H]+ 峰為m/z 539，其二級(jí)全掃描質(zhì)譜的特征離子碎片為 158.13、223.00、316.08。

3 討論

3.1 紅花偽品的鑒別 研究發(fā)現(xiàn)偽品紅花與正品紅花性狀差別主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是質(zhì)感，正品紅花質(zhì)地柔軟，整體性好;偽品紅花質(zhì)地則較為松脆，整體性差，易散碎。二是花藥，正品紅花的花藥顏色為黃白色，明顯比外側(cè)花瓣顏色淺;偽品紅花的花藥顏色為同外側(cè)花瓣顏色一樣為橙紅色。分析認(rèn)為這種現(xiàn)象是由于偽品經(jīng)統(tǒng)一染色導(dǎo)致花瓣花藥顏色均為橙紅色，可以作為鑒別該偽品的關(guān)鍵特征。基于以上結(jié)論，本文可為基層執(zhí)法提供一種快速鑒別可疑偽品的便利方法，尤其是在沒有攜帶相關(guān)快速檢測設(shè)備的情況下，可抓住此性狀特征，對(duì)可疑品種第一時(shí)間進(jìn)行控制，防止非法流通，具有一定社會(huì)效益。

3.2 染色物的檢測 采用水試法，發(fā)現(xiàn)紅花偽品入水后，褪色，懷疑其被染色，參考藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法（國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件：2013007、2014016）對(duì)方法中涉及的色素進(jìn)行檢測，首先應(yīng)用薄層色譜方法對(duì)偶氮玉紅、酸性紅73、日落黃、檸檬黃、胭脂紅和金橙Ⅱ等6種染色物質(zhì)進(jìn)行了初篩，并在偽品供試品中檢測到胭脂紅種染色物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[5] ，應(yīng)用了HPLC-DAD和HPLC-MS的方法對(duì)偽品中染色物質(zhì)做了進(jìn)一步的確認(rèn)，證實(shí)偽品中含有胭脂紅。胭脂紅與歐盟標(biāo)準(zhǔn)禁用的蘇丹紅Ⅰ同屬于偶氮類色素，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示其有一定的致癌和突變作用，如果人在不知情的情況下長期使用了這種染色的紅花，容易引起暫時(shí)性或持久性的病理狀態(tài)，甚至危及生命，在藥品中是不允許添加的。為此，本文建立的HPLC以及HPLC-MS方法，能夠檢測紅花偽品中所摻入的胭脂紅色素，為紅花和其他藥材中非法使用胭脂紅的檢測提供參考，同時(shí)也為藥材中其他染色成分的檢測提供借鑒，為大力打擊中藥染色這種違法行為提供技術(shù)支撐，確保中藥質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效。

對(duì)紅花偽品測定的同時(shí)，對(duì)紅花正品和空白試劑也進(jìn)行了考察，紅花正品溶液和空白試劑在相應(yīng)色素色譜峰位置均未出現(xiàn)干擾峰，表明本文所建立的對(duì)胭脂紅色素檢測的HPLC和HPLC-MS法專屬性良好。參考文獻(xiàn)[6-9]，對(duì)藥品中違法添加色素的檢測，通常最終采用液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行檢出物的確認(rèn)，具體方法是通過與對(duì)照品的一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜相比較，查看是否一致。本文采用多反應(yīng)監(jiān)測和二級(jí)全掃描相結(jié)合的模式進(jìn)行測定，由于多反應(yīng)監(jiān)測可以通過對(duì)兩級(jí)離子的選擇，排除大量的干擾離子，降低了檢測背景，所以本模式可以提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，為藥品中色素類成分的檢測提供新的思路。

綜上，通過對(duì)一種紅花偽品的鑒別，發(fā)現(xiàn)與正品紅花有明顯的性狀差異，根據(jù)此鑒別點(diǎn)能夠迅速進(jìn)行初篩，可以用于快檢;同時(shí)經(jīng)過水試分析及現(xiàn)代分析儀器檢測，發(fā)現(xiàn)了紅花偽品中違法添加胭脂紅染色物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所建立的用于測定胭脂紅的HPLC以及HPLC-MS方法專屬性好，靈敏度高，可以為胭脂紅以及其他染色物質(zhì)的檢測提供參考。

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（收稿日期：2019-04-12 編輯：劉斌）