益生菌中膽鹽水解酶作用機制研究進展

唐洪玉，宋馨，夏永軍，艾連中，王光強

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海，200093)

益生菌(probiotics)是一類通過改善宿主體內(nèi)的微生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用的活性微生物總稱。它們可粘附于宿主腸黏膜表面，通過影響外源菌及病原體定殖的方式來改善腸道菌群結構、促進腸道有益菌增殖、抑制有害菌的生長、提高機體免疫力、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂等重要生理功效，同時在腸道免疫失調(diào)引發(fā)的一系列腸道慢性感染性疾病以及腸應激綜合征等疾病的預防和治療上也有著廣泛的應用[1]。一般認為，益生菌被服用后只有保持較高活性才能發(fā)揮有效作用，但由于服用后要經(jīng)受胃酸、膽鹽等環(huán)境后才能最終到達活性位點，因此膽鹽耐受性是選擇益生菌的重要標準之一[2]。膽汁酸(bile acid， BA)是在肝臟中由膽固醇合成的兩親性分子，它們儲存在膽囊并在機體攝食后釋放到小腸中，可促進脂質(zhì)的乳化和增溶。近年來，已有研究表明BA是信號傳導分子，其通過法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)和G蛋白偶聯(lián)膜受體5(TGR5)介導信號激活宿主體內(nèi)與膽汁酸、脂質(zhì)、碳水化合物代謝及能量消耗和炎癥相關基因的表達，在調(diào)節(jié)宿主新陳代謝、生理、營養(yǎng)和免疫功能中發(fā)揮重要作用[3]。而膽鹽是膽汁酸在堿性膽汁中的主要存在形式，在脊椎動物的脂質(zhì)消化中起重要作用，負責膽汁參與脂肪的消化和吸收。大量研究表明，益生菌不但可通過膽鹽水解酶來提高自身的膽鹽脅迫抗性，從而增加其在腸道中的存活幾率和穩(wěn)定性[4]，而且還能通過膽鹽水解酶直接參與膽汁酸調(diào)控而實現(xiàn)其部分功能特性[5]，因而益生菌膽鹽水解酶一直是研究的熱點。

1 膽鹽水解酶

1.1 膽鹽水解酶的特點

膽鹽水解酶(bile salt hydrolase，BSH)，屬于甘氨酸水解酶家族的N-端水解酶成員。不同來源的BSH在氨基酸數(shù)量、最適pH和溫度、分子質(zhì)量、底物偏好及酶催化效率方面均存在較大差異[6]。BSHs主要由314～338個氨基酸編碼組成，BSH單體分子質(zhì)量在34～42 kDa。最適pH范圍為3.8～7.0，在30～55 ℃時，BSHs活性最佳。

大多數(shù)BSHs以同型四聚體的形式存在，而來自脆弱芽孢桿菌ATCC 25285的LaCRL1098_BSH、BlBB536_BSH和BSH，分別以同源二聚體、同源六聚體及同源八聚體形式存在[7]。約翰遜乳桿菌100-100中的4種BSH以同源或異源三聚體形式存在[8]。此外，在其他菌株中也觀察到多種形式BSH的出現(xiàn)，如唾液乳桿菌LGM14476中的 BSHs為同源二聚體[9]。

前人研究表明， BSH存在6個活性位點，分別為Cys2、Arg18、Asp21、Asn82、Asn175和Arg228[10]。在蛋白自身酶解過程中，初始的甲硫氨酸(Met)被去除后Cys2便成為催化中心，這是Ntn水解酶超家族的共同點。因此，Cys2的巰基(SH)對BSH催化至關重要。LIANG等[11]研究表明，Asn82與BSH的活性密切相關。

BSH具有底物特異性。BSH可能會識別膽鹽中的類固醇核或氨基酸側鏈(圖1)。相關動力學數(shù)據(jù)表明，BSH底物的識別部位為氨基酸側鏈，且大多數(shù)BSH傾向水解甘氨結合膽鹽，這主要由?；墙Y合膽鹽中硫原子引起的位阻所致[12]。還有研究表明，類固醇核及氨基酸側鏈的修飾也會影響B(tài)SH的底物偏好[13]。最近，通過對膽鹽進行分子對接和比較結構分析，表明BSH可以通過與疏水性類固醇的疏水性相互作用來識別底物[14-15]。

圖1 膽鹽的化學結構

1.2 膽鹽水解酶在益生菌中的分布

在檢索了公共數(shù)據(jù)庫美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中的蛋白數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)，BSH主要分布于乳酸菌和雙歧桿菌中。同時，乳酸菌和雙歧桿菌通常用作益生菌菌株，也是胃腸道菌群的重要組成部分。

與文獻[6]報道一致，檢索過程中發(fā)現(xiàn)有許多菌株存在多個BSH基因。篩選出主要產(chǎn)bsh的乳酸菌菌種整理成表1。如植物乳桿菌WCFS1有4個bsh基因(bsh1、bsh2、bsh3、bsh4)，約氏乳桿菌DPC 6026有3個bsh基因(氨基酸序列分別為AEB93337.1、AEB93154.1、AEB92403.1)，嗜酸乳桿菌LA4和LA11均有2個bsh基因(bshA和bshB)(數(shù)據(jù)來源于NCBI)。

表1 部分益生菌中的膽鹽水解酶分布情況

目前關于不同乳酸菌膽鹽水解酶的活性已有較為系統(tǒng)的研究，但在BSH多重同源物上的研究仍需進一步完善。LAMBERT等[16]對植物乳桿菌WCFS1的BSH研究表明，4個bsh基因的表達量會顯著影響膽鹽水解酶活性、底物偏好、膽鹽耐受性等性質(zhì)，這為其他菌種bsh基因的研究奠定了基礎。LIANG等[11]通過建立乳桿菌科的BSH序列的本地數(shù)據(jù)庫(BSH-SDL)，根據(jù)親緣關系將bsh基因分為5個亞型，系統(tǒng)地闡明了乳桿菌中BSH的分子基礎，有利于高BSH活性菌株的篩選。同時，對攜帶多個bsh基因的菌株進行分析，發(fā)現(xiàn)不同種屬間菌株bsh基因表達存在顯著差異，而同一種屬間菌株bsh基因表達差異并不顯著，這也為研究BSH蛋白序列在進化關系和活性位點方面的特征以及對膽鹽代謝的具體影響上開辟了新途徑。

1.3 膽鹽水解酶抑制劑

結合膽鹽因有兩親性，具有更高效的脂肪溶解能力，而益生菌產(chǎn)生的 BSH可解結合膽鹽不利于動物脂肪的積累[17]。因此，在畜牧業(yè)抑制BSH活性已被確定為一個潛在的既保持益生菌用作動物飼料補充劑，又調(diào)節(jié)動物體內(nèi)脂質(zhì)和能量平衡，以確保體質(zhì)量增加的方法[6]。據(jù)報道，一些抗生素類生長促進劑(antibiotic growth promoter, AGPs)如四環(huán)素和羅沙酮，研究發(fā)現(xiàn)，這類抗生素可直接抑制腸道中的BSH酶活性[18]。但APGs在動物中長期使用易產(chǎn)生抗藥性，停止使用AGPs是保護公眾健康的全球趨勢，因此需要發(fā)掘AGPs的有效替代品。SHELTON等[19]和LIU等[20]研究表明，銅離子(CuCl2)和鋅離子(ZnSO4)是有效的BSH抑制劑，當使用高濃度的銅離子和鋅離子時，可有效改善豬等家禽的生長性能和飼料效率，然而，長期使用高劑量的銅離子或鋅離子容易導致銅/鋅中毒及環(huán)境污染。近年，SMITH等[21]通過高通量篩選系統(tǒng)(high throughput screening, HTS)篩選出核黃素、咖啡酸苯乙酯等有希望的BSH抑制劑。ADHIKARI等[22]開發(fā)出一種新型BSH抑制劑的篩選系統(tǒng)，并鑒定出一種鉛化合物GR-7，可有效抑制小鼠體內(nèi)外膽鹽的水解，且不會顯著影響腸道細菌的生存能力。本研究為開發(fā)安全、高效率的BSH抑制劑提供了新方向。另外，加強BSH底物抑制劑的合理開發(fā)，對于膳食補充益生菌來提高動物飼料效率和生長性能具有重要意義。

2 膽鹽水解酶的生理功能

2.1 營養(yǎng)作用

BSH水解結合膽鹽可產(chǎn)生游離膽汁酸和氨基酸，其中，甘氨酸可代謝成氨和CO2，?；撬峥纱x成氨、CO2和硫酸鹽，可被用作碳源和氮源，具有BSH活性的菌株在生長時便可獲得營養(yǎng)優(yōu)勢。HUIJGHEBAERT等[23]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)BSH的梭狀桿菌可利用?；撬嶙鳛殡娮邮荏w，且在?；墙Y合膽鹽存在的情況下生長速度明顯加快。在長雙歧桿菌中也觀察到，bsh基因伴隨編碼腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的基因glnE共轉(zhuǎn)錄[24]。其中，glnE基因負責參與氮元素調(diào)節(jié)的級聯(lián)反應。因此，BSH的去結合膽鹽作用很可能為益生菌在腸道的存活提供了營養(yǎng)保障。

2.2 膜特性的改變

溶菌酶、磷脂酶以及抗菌肽(例如防御素)是腸道天然免疫的重要組成部分。細菌細胞膜的組成、流動性、滲透性、疏水性和凈電荷都與宿主的防御功能息息相關[25]。研究表明，BSH可促進膽固醇或膽汁酸進入細胞膜，引起膜的修飾，如增加不飽和脂肪酸的含量、改變膜的流動性，從而提高膜的柔韌性和強度[25-26]。據(jù)文獻[27]報道，高濃度的膽鹽會溶解磷脂并破壞細胞膜的脂質(zhì)雙分子層結構，BSH的存在可降低膽鹽的活性，從而防止細胞膜裂解。因此，具有BSH活性的益生菌可修飾細胞膜的結構和保護細胞膜的完整性，從而增強宿主體內(nèi)的免疫能力，這對抵抗病原菌引起的長期感染很重要。

2.3 膽鹽解毒

結合膽鹽對菌體具有較高的毒性。體外研究表明，?；墙Y合膽鹽通常在任何pH下對細菌細胞僅產(chǎn)生輕微影響，而甘氨結合膽鹽在酸性pH下對細胞具有極高的毒性[28]。BSH降低結合膽鹽毒性的機理主要包括：(1)將毒性較高的結合膽鹽水解為毒性較弱的次級膽鹽，從而降低對細菌的毒性；(2)改善結合膽鹽引起的細胞內(nèi)酸化。結合膽鹽進入細胞后，使細胞內(nèi)酸化呈現(xiàn)毒性，而 BSH作用產(chǎn)生的游離膽汁酸可轉(zhuǎn)化為較弱的解離物，通過重新捕獲共轉(zhuǎn)運質(zhì)子來防止ATP過度消耗，從而維持細胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)[29]；(3)維持膽汁酸臨界膠束濃度。膽汁酸在生理條件下以離子(類固醇骨架)形式存在，當高于臨界膠束濃度時會形成膠束，隨著臨界膠束濃度的降低，類固醇骨架的潛在膜毒性即增加[30]。而BSH可通過水解結合膽鹽產(chǎn)生膽汁酸來維持臨界膠束濃度，使菌株免于類固醇骨架誘發(fā)的細胞膜毒性。

2.4 胃腸道存活率

BSH具有解除結合膽鹽毒性的能力，可提高菌株在胃腸道中的存活率。研究表明，BSH酶有助于李斯特菌和布魯氏菌在胃腸道中的定殖[31-32]。在布魯氏菌中，敲除bsh基因使其對膽鹽更加敏感，并影響了其在腸道內(nèi)的黏附性和內(nèi)在化活性。最近，YANG等[4]研究發(fā)現(xiàn)，過表達bsh基因的植物乳桿菌，與正常植物乳桿菌相比，在小鼠胃腸道中的存活時間顯著增長。微生物對宿主表面的黏附能力是影響其在胃腸道存活的一個重要指標。與敲除bsh基因的植物乳桿菌相比，BSH過表達菌株和正常菌株對Caco-2腸道細胞的粘附數(shù)量均顯著增加[4]。因此，證實了BSH對于乳酸菌的存活及腸道粘附的重要性。

3 膽鹽水解酶在益生菌發(fā)揮益生功能中的作用

3.1 降膽固醇

血清膽固醇升高是誘發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的主要因素[33]?？墒褂盟幬镞M行治療，如他汀類及膽汁酸螯合劑等。但藥物價格通常昂貴，還可能產(chǎn)生不良副作用，如胃腸不適等。因此，膳食補充具有調(diào)節(jié)高脂血癥的益生菌是一種安全有效的替代方法，能夠維持宿主的脂質(zhì)水平而無不良副作用[34]。

大量研究表明，益生菌降低膽固醇的能力與BSH活性相關。MALPELIET等[35]研究表明，膳食補充低劑量羅伊氏CRL 1098發(fā)酵的酸奶(125 g, 106CFU/d)，可有效降低高膽固醇血癥受試者的總膽固醇(total cholesterol, TC)和低密度膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)水平，而高密度膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和甘油三酯(triglyceride, TG)水平?jīng)]有變化。WANG等[36]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌AR113和干酪乳桿菌 pWQH01可顯著降低高脂小鼠血清中的TC和LDL-C水平及動脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index, AI)。并且，還能調(diào)節(jié)與膽固醇代謝相關基因的表達來降低膽固醇水平，包括抑制肝FXR和小異二聚體伴侶(small heterodimer partner, SHP)基因的表達來抑制膽固醇的合成吸收，促進CYP7A1、肝X受體(liver X receptor, LXR)和低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor, LDLR)基因的表達來增加腸道膽固醇排泄。GUO等[37]通過建立高血脂模型，得出了與WANG等[36]相似的結論，即發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌KLDS 1.0344能夠顯著改善脂質(zhì)在血清和肝臟中分布，并增加大鼠糞便TC和總膽汁酸水平。但在調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關基因的表達方面又有了新的發(fā)現(xiàn)，即KLDS 1.0344菌株可抑制肝HMGCR和腸NPC1L1基因的表達，促進腸LXRα、ABCG5、ABCG8和ABCA1基因的表達[37]。

其他研究指出，膽鹽水解生成的游離膽汁酸重吸收效率較低，可隨糞便大量排出體外[38]。同時，次級膽鹽在腸道中對脂質(zhì)的溶解和吸收效率較低，需要消耗更多膽固醇來從頭增加膽汁酸的合成，從而降低了血清中膽固醇的水平[39]。此外，游離膽汁酸與膽固醇在腸道形成復合物共沉淀，隨糞便排出體外也是降低膽固醇含量的途徑之一[40](圖2)。

圖2 膽鹽水解酶降膽固醇的作用途徑

上述研究表明了BSH在調(diào)節(jié)膽固醇代謝途徑中的具體機制，證實了BSH在降膽固醇水平上中發(fā)揮的作用和效果。因此，篩選高BSH活性的益生菌對降膽固醇的臨床應用具有重要意義。

3.2 益生菌定殖

BSH可提高益生菌在胃腸道的定殖能力，作用分為以下2個方面：

一方面，BSH有助于益生菌在胃腸道長期定殖。YANG等[4]將植物乳桿菌進行編輯，構建了BSH過表達型菌株和BSH缺失型菌株，探究了3株菌對Caco-2細胞的黏附能力，證實了BSH活性強弱與菌株對腸細胞的吸附數(shù)量呈正相關。這也印證了BSH對菌株在腸道的定殖具有十分重要的作用。另一方面，BSH可通過介導對膽汁酸的抗性而促進益生菌對胃腸道的定殖。JONES[41]將bsh基因在李斯特菌中表達，與正常菌株相比，表達BSH的李斯特菌在膽汁酸環(huán)境中的存活率顯著增加(約1.5個lg CFU)，證實了BSH在體外介導膽汁酸耐受性。進一步評估菌株在小鼠腸道中的存活能力，表達BSH的李斯特菌與正常李斯特菌相比存活率呈現(xiàn)了一定程度的增加。雖然增幅很小，但可能在新宿主腸道的定殖過程中產(chǎn)生重大影響。因此，BSH可提高益生菌菌株的膽鹽抗性及黏附特性，有助于益生菌在腸道的定殖，這對于功能性菌株的開發(fā)挖掘具有推動作用。

3.3 緩解炎癥性腸病

潰瘍性結腸炎和克羅恩病是2種主要的炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，以胃腸道的慢性和復發(fā)性炎癥為特征[42]。IBD患者的典型癥狀包括腹痛、腹瀉、便血、食欲不振、疲勞及體重減輕等[43]。IBD的確切原因尚未清楚，現(xiàn)有的IBD治療方法包括外科手術治療和藥物治療，治療藥物包括氨基糖皮質(zhì)激素藥物、水楊酸、生物制劑和免疫抑制劑等。然而，這些藥物治療具有強烈的副作用并不適合長期治療[44]。近年來，益生菌被認為是治療IBD的有效且安全的輔助療法[45]。

相關報道顯示，IBD中腸道微生物失衡或“營養(yǎng)不良”，可對宿主的新陳代謝產(chǎn)生影響[46]。DUBOC等[47]研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者中微生物酶活性受損可導致膽汁酸代謝受損，特征為膽鹽無法水解、轉(zhuǎn)化和脫硫。而腸腔內(nèi)膽鹽代謝異常會增強腸道上皮炎癥反應，從而使IBD惡化(圖3)。此外，腸腔中結合膽鹽濃度過高，還易誘發(fā)艱難梭菌等病原菌的產(chǎn)生[48]。

圖3 炎癥性腸病中膽汁酸代謝異常的生理病理模型

目前，已有研究表明，植物乳桿菌AR113可有效緩解葡聚糖硫酸鈉引起的結腸損傷，包括調(diào)節(jié)腸道免疫反應維持上皮屏障的完整性，改善腸道菌群失調(diào)，抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達，并降低促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的表達量[49]。對植物乳桿菌AR113進行基因組測序，分析表明其具有4個bsh基因(bsh1、bsh2、bsh3和bsh4)。據(jù)此推測，膽鹽水解酶負責膽鹽代謝途徑的第1步，可催化介導膽汁酸的生成，攝入具有BSH活性的益生菌能夠促進腸道內(nèi)膽鹽的生物轉(zhuǎn)化，進而緩解腸道內(nèi)高劑量膽鹽引起的炎癥反應，這對于緩解IBD等相關疾病具有指導意義。

4 展望

目前已對BSH的結構、活性位點及底物偏好作了較為系統(tǒng)的研究，對BSH的生理特性及分布的了解也越來越全面。BSH可賦予益生菌膽鹽抗性，利于其在順利到達胃腸道后發(fā)揮更廣泛的益生作用。并且大量研究表明，BSH參與益生菌和宿主代謝途徑的復雜調(diào)控機制，如介導膽汁酸代謝、調(diào)控膽固醇合成途徑和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)等，將宿主代謝與人類的各種生理病理狀況聯(lián)系在一起，從而在改善人類健康中發(fā)揮重要作用。進一步表明了具有BSH活性的益生菌可通過介導膽汁酸代謝將宿主腸道和肝臟之間聯(lián)系起來，為治療相關疾病提供了可能性。

為了更好地了解BSH的功能，未來需要對益生菌中多個BSH基因、BSH蛋白結構和遺傳調(diào)控方面進行解析，進一步確定膽鹽水解酶在益生菌中所發(fā)揮的具體作用，為具有BSH活性的益生菌在食品及功能保健品中的應用提供理論基礎。此外，還需研究利用基因編輯技術和蛋白組學技術，更簡單、快速地找到或構建高BSH活性的益生菌株，通過干預飲食的方法來控制膽固醇、高血脂、糖尿病、肥胖癥，緩解炎癥性腸病等癥狀，這對于全面解決和理解BSH作為臨床工具具有深遠意義。