Microbio方法與平板計(jì)數(shù)方法在菌落計(jì)數(shù)中的比較

郭佳，王娉，周繼福,3，趙曉美，劉繼鋒，陳穎*

1(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京,100176) 2(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津,300457) 3(南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京,210046)

菌落總數(shù)是指食品樣品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得每克(或每毫升)樣品中形成的微生物菌落數(shù)[1]，是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生情況的重要性指標(biāo)。目前檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的方法有顯色培養(yǎng)基法、測(cè)試紙片法、電阻抗技術(shù)法、ATP生物發(fā)光技術(shù)法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法和自動(dòng)化儀器分析方法等。其中，顯色培養(yǎng)基法實(shí)驗(yàn)步驟較傳統(tǒng)方法簡(jiǎn)單[2-3]，結(jié)果更易判讀[4]；測(cè)試紙片法方便快捷[4-5]，但成本較傳統(tǒng)培養(yǎng)法高[6]；電阻抗法目前已被美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì) (Association of Official Analytical Chemists，AOAC)認(rèn)證[6]，但電阻抗儀對(duì)溫度的穩(wěn)定性要求較高[7-8]，使用時(shí)需注意環(huán)境溫度；ATP生物發(fā)光技術(shù)法操作快速簡(jiǎn)單、測(cè)定范圍廣[9]，但菌落濃度一般需≥104CFU/g[10]；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法大多應(yīng)用在液體樣品中，固體樣品的應(yīng)用還較少[11]；自動(dòng)化儀器檢測(cè)法雖然儀器本身成本偏高，但操作簡(jiǎn)單，可以大大降低人工成本，適合大批量檢測(cè)。

Microbio全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法是運(yùn)用透鏡像差多重聚焦技術(shù)對(duì)菌落進(jìn)行3D分析，能夠連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)并有效區(qū)分雜質(zhì)，快速完成菌落計(jì)數(shù)。為探究Microbio 全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法與平板菌落計(jì)數(shù)法在檢測(cè)結(jié)果上是否有顯著性差異，本文分別用上述2種方法檢測(cè)模擬染菌的食品樣品，從數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度、定量限和檢出時(shí)間等方面進(jìn)行分析比較。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計(jì)數(shù)系統(tǒng)(MicroBio)，BD；麥?zhǔn)蠞岫葍x(M007230)，Biomerieux；培養(yǎng)箱(BD115)，Binder；培養(yǎng)箱(IC160)，Salvis。

1.2 菌種與樣品

大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC11775，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)22018，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853，洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)CICC10857，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)1410302，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)22730，白色念珠菌(Moniliaalbican)ATCC90029，黑曲霉菌(Aspergillusniger)ATCC16404，領(lǐng)地伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaterritorii)IQCC33107，污染伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacontaminans)CICC23882均為本實(shí)驗(yàn)室保存。食品樣品(生雞肉)，購(gòu)自北京超市，經(jīng)高溫滅菌后備用。

1.3 試劑與耗材

平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar, PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司和BD公司；腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth，BHI)、腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar, BHIA)，Oxoid公司；NaCl，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂、比濁管，BD公司；2 mL離心管，AXYGEN公司；50 mL離心管，美國(guó)康寧公司。

1.4 方法

1.4.1 檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性及定量限比較

分別制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍爾德菌、銅綠假單胞菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念球菌、黑曲霉的菌液。

用生理鹽水將菌液調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)臐岫群蠹尤氲绞称窐悠分?，制成菌落終濃度為100、50、25、10、5 CFU/mL的食品樣品模擬污染懸液，采用GB 4789.2—2016[1]、GB 4789.15—2016[12]中的方法進(jìn)行檢測(cè)。隨后分別放入普通培養(yǎng)箱(PT組)和微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計(jì)數(shù)系統(tǒng)(TD組)進(jìn)行培養(yǎng)。每組5個(gè)重復(fù)?？瞻讓?duì)照為未添加目標(biāo)菌的食品樣品。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

制備5份不同濃度:1、5、10、15、20、25 CFU/mL的食品樣品模擬污染懸液，培養(yǎng)和檢測(cè)方法同上。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4.2 檢出時(shí)間比較

分別制備領(lǐng)地伯克霍爾德氏菌、污染伯克霍爾德氏菌食品樣品模擬污染懸液，污染濃度≤100 CFU/mL。培養(yǎng)方式及空白對(duì)照同1.4.1。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4.3 不同操作人員比較

為探究人員操作對(duì)于計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，以不同人員為單一變量，在其他條件不變的情況下，分別制備5、10、25、50、100 CFU/mL的食品樣品模擬污染懸液(大腸埃希菌)，實(shí)驗(yàn)由2人進(jìn)行操作，各做5組，平行5次實(shí)驗(yàn)，具體操作及空白對(duì)照同1.4.1。

1.4.4 不同品牌培養(yǎng)基比較

用BD公司和北京陸橋公司的培養(yǎng)基進(jìn)行金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)操作，各做5組實(shí)驗(yàn)，前期處理和后續(xù)檢測(cè)培養(yǎng)操作及空白對(duì)照同1.4.1。對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(α=0.05)。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel及Minitab 17進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙樣本t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性及定量限比較

根據(jù)1.4.1步驟對(duì)8個(gè)菌種(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍爾德菌、銅綠假單胞菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念球菌、黑曲霉)進(jìn)行數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性比較實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照無目標(biāo)菌檢出，回收率70%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD) 0.04～0.35，說明數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較好[13-14](表1)。5 CFU/mL時(shí)，RSD均≤0.35；10、25 CFU/mL時(shí)，RSD≤0.25；50、100 CFU/mL時(shí)，2個(gè)方法的RSD≤0.15。其中PT組RSD高于TD組RSD的比例為50%，這說明在數(shù)據(jù)穩(wěn)定性上，TD組較PT組有微小的優(yōu)勢(shì)。在相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差方面，5、10 CFU/mL的RSD大多在0.20～0.35之間，這在一定程度上說明低濃度(5、10 CFU/mL)的平板計(jì)數(shù)誤差較大。運(yùn)用Minitab軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(α=0.05)，得到的P>0.05，說明2者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著，Microbio全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法可以替代平板計(jì)數(shù)法。

表1 兩種培養(yǎng)方法下8株菌菌落計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù) 準(zhǔn)確性結(jié)果比較

續(xù)表1

為確定TD組的檢測(cè)結(jié)果是否可靠，對(duì)PT組和TD組的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。以PT組數(shù)值為橫坐標(biāo)，TD組數(shù)值為縱坐標(biāo)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得到的相關(guān)系數(shù)在0.969 6～0.997 4之間，且都大于0.95，具有良好的相關(guān)性，表明Microbio 全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法的測(cè)定結(jié)果可靠。

為確定Microbio全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)的定量限是否存在差異，選擇6個(gè)較低檢測(cè)濃度進(jìn)行檢測(cè)?？瞻讓?duì)照無目標(biāo)菌檢出。當(dāng)菌體濃度在1 CFU/mL時(shí)，2種方法的回收率都較低。5～25 CFU/mL時(shí)，回收較高，在72%～101%之間。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(α=0.05)，P值在0.107～1.000之間(≥0.05)，表明2種方法差異不顯著。定量限均可以達(dá)到 5 CFU/mL。

表2 兩種培養(yǎng)方法下8株菌菌落計(jì)數(shù)的定量限結(jié)果比較

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 檢出時(shí)間分析

污染伯克霍爾德氏菌[15]和領(lǐng)地伯克霍爾德氏菌生長(zhǎng)緩慢[16]，檢測(cè)一般需要1～2 d。因此選用上述2株菌評(píng)價(jià)2種方法的最快檢出時(shí)間。TD組的檢出時(shí)間可以精確計(jì)時(shí)到0.5 h?？瞻讓?duì)照無目標(biāo)菌檢出。污染伯克霍爾德菌16.0 h左右即可被 Microbio全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)系統(tǒng)檢出，20.0 h左右計(jì)數(shù)穩(wěn)定(圖1-a)；領(lǐng)地伯克霍爾德菌15.5 h左右可被檢出，19.0 h左右計(jì)數(shù)穩(wěn)定(結(jié)果未顯示)；而平板計(jì)數(shù)法24 h左右才能檢測(cè)到領(lǐng)地伯克霍爾德氏菌(結(jié)果未顯示)和污染伯克霍爾德氏菌穩(wěn)定計(jì)數(shù)結(jié)果(圖1-b)。因此，從檢測(cè)時(shí)間看，Microbio 全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法短于傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法。

A-TD組；B-PT組

2.3 人員操作對(duì)于計(jì)數(shù)結(jié)果的影響

選用大腸埃希菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，以操作人員(A、B)為單一變量，設(shè)計(jì)10組實(shí)驗(yàn)研究人員操作對(duì)于計(jì)數(shù)結(jié)果的影響?？瞻讓?duì)照無目標(biāo)菌檢出，實(shí)驗(yàn)組10組數(shù)據(jù)的P值均>0.05(0.160～0.921之間)(表4)，說明不同人員操作對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果影響不顯著。

表4 不同人員對(duì)于計(jì)數(shù)影響的單因素方差分析(大腸埃希菌)

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)于計(jì)數(shù)結(jié)果的影響

圖2是使用不同廠家培養(yǎng)基所得的計(jì)數(shù)結(jié)果圖，a為TD組結(jié)果，b為PT組結(jié)果。1號(hào)為X廠家培養(yǎng)基，2號(hào)為Y廠家培養(yǎng)基，右下角為菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，分別為73、98、95、115 CFU(空白對(duì)照無目標(biāo)菌檢出)。PT組和TD組分別有5個(gè)水平，每個(gè)水平的平行數(shù)為5，計(jì)數(shù)結(jié)果方差分析(α=0.05)顯示，2種培養(yǎng)基在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異。說明不同培養(yǎng)基對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果影響不大。

a-Microbio方法；b-平板計(jì)數(shù)法;1-X廠家培養(yǎng)基；2-Y廠家培養(yǎng)基

3 討論與結(jié)論

本研究共選用10種代表菌株，分別從計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、定量限檢測(cè)、檢出時(shí)間、人員操作、不同培養(yǎng)基方面對(duì)Microbio全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法在計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、定量限檢測(cè)、人員操作、不同培養(yǎng)基方面和平板計(jì)數(shù)法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(α=0.05)，最低檢出限可達(dá)5 CFU/mL；檢出時(shí)間方面，全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)方法相較于平板計(jì)數(shù)法有一定的優(yōu)勢(shì)，節(jié)約4 h左右。

在菌種選擇方面充分考慮了代表性，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別作為革蘭氏陽性菌[17]和革蘭氏陰性菌代表[17]，蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是污染食品中常被檢測(cè)到的芽孢桿菌[18]，選取銅綠假單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌來檢測(cè)色素是否會(huì)影響機(jī)器的計(jì)數(shù)，選取黑曲霉和白色念球菌來評(píng)價(jià)機(jī)器真菌計(jì)數(shù)[19]的效果。

食品加工過程復(fù)雜多樣，冷凍、鹽漬、高溫等加工方法可使部分菌株因細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損而死亡，但也存在一部分菌株能夠抵御這些不良環(huán)境因素，而處于受損傷或亞致死狀態(tài)，在這種情況下進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，應(yīng)合理地考慮培養(yǎng)基的使用效果。本研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)口培養(yǎng)基和國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基在數(shù)量上沒有顯著性差異。從菌落的形態(tài)來看，X廠家培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落較Y廠家培養(yǎng)基的稍大。因此在檢測(cè)敏感性較高的菌種時(shí)，應(yīng)根據(jù)菌種的長(zhǎng)勢(shì)選擇合適的培養(yǎng)基[20]。

在檢出時(shí)間方面，自動(dòng)化的儀器設(shè)備要優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，需要每間隔一定的時(shí)間就對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且受菌落大小及透明度的限制，十分耗費(fèi)人力。而Microbio全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)，實(shí)時(shí)計(jì)數(shù)，操作更智能，還能將數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)傳輸至工作者的郵箱，因此全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法在檢出時(shí)間方面有一定的優(yōu)勢(shì)。

自動(dòng)化檢測(cè)是微生物快速檢測(cè)的一個(gè)趨勢(shì)，隨著勞動(dòng)力成本的上升和儀器成本的降低，越來越多的自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于菌落計(jì)數(shù)中，如TSUTA等[21]和RAYMOND等[11]分別用流式細(xì)胞術(shù)法來提高好氧平板計(jì)數(shù)法的預(yù)測(cè)精度及檢測(cè)巧克力中乳酸菌的總數(shù)，LUCAS等[22]結(jié)合3D打印技術(shù)檢測(cè)液滴中大腸桿菌的數(shù)量，JIANG等[23]采用電化學(xué)傳感器的方法檢測(cè)水中的菌落總數(shù)。利用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)法不僅可以節(jié)省勞動(dòng)力，還可以降低實(shí)驗(yàn)員主觀上對(duì)于菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，使結(jié)果更客觀。目前關(guān)于Microbio 微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計(jì)數(shù)系統(tǒng)的相關(guān)文獻(xiàn)研究較少，但國(guó)內(nèi)已有一些原理相似的儀器出現(xiàn)，如QXC-30(上海海恒機(jī)電)及訊數(shù)公司的一系列儀器，說明該方法在菌落計(jì)數(shù)方面有較大的潛能。